纖維支架材料、其制備方法、及亞甲藍負載量的調節方法與流程

本發明屬于可用于神經退行性疾病治療的支架材料的制備領域，尤其涉及一種具有優越的神經退行性疾病治療性能的纖維支架材料、其制備方法、及亞甲藍負載量的調節方法，主要應用于神經再生醫學領域。

背景技術：

阿爾茨海默病(ad)是一種慢性中樞神經系統退行性疾病，一般表現為神經元的壞死，β淀粉樣蛋白(aβ)沉積和tau蛋白過度磷酸化。目前治療方法主要有干細胞移植，利用干細胞的增殖和分化潛能補充缺失的神經元，但是移植的干細胞增殖率和分化率都很低，一方面患者腦內存在毒性物質，例如aβ和病變的tau蛋白，另一方面移植的干細胞缺乏可以支持其增殖或分化用的基底。

目前主要采用各種形式的支架材料，例如靜電紡絲納米纖維支架。為提高細胞存活率或分化率，一般采用在支架上負載生長因子或分化因子，或者移植轉基因干細胞，但是支架上負載因子后不利于保存和運輸，而轉基因干細胞會增加細胞癌變概率。亞甲藍是一種正在研發的治療ad的藥物，目前的研究表明亞甲藍患者腦內的毒性物質，例如能夠促進aβ清除，并減弱tau蛋白病變。但是單獨使用亞甲藍不能補充受損的神經元。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種纖維支架材料、其制備方法、及亞甲藍負載量的調節方法，以克服現有技術中的不足。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明實施例公開了一種纖維支架材料，包括基體以及負載于基體表面的亞甲藍，所述基體包括纖維支架、以及包被于所述纖維支架表面的氧化石墨烯。

優選的，在上述的纖維支架材料中，所述纖維支架為plga納米纖維支架。

相應的，本發明還公開了一種纖維支架材料的制備方法，包括步驟：

(1)通過靜電紡絲方法制備纖維支架；

(2)將氧化石墨烯通過物理吸附方法包被到纖維支架表面；

(3)通過物理吸附將亞甲藍負載到氧化石墨烯包被的纖維支架上。

優選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述物理吸附包括π-π共軛作用和/或靜電作用。

優選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述步驟(1)中，將plga溶解于四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液中，制備靜電紡絲前驅體溶液；采用靜電紡絲方法制備plga納米纖維支架，然后采用等離子體進行處理。

優選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述步驟(2)中，將氧化石墨烯分散到去離子水中，獲得氧化石墨烯溶液，然后將纖維支架浸泡在氧化石墨烯溶液中，取出干燥后獲得氧化石墨烯包被的纖維支架。

優選的，在上述的纖維支架材料的制備方法中，所述氧化石墨烯溶液的濃度為0.1g/l～1.0g/l，尤其優選為0.5g/l。

本發明實施例還公開了一種纖維支架材料表面亞甲藍負載量的調節方法，在纖維支架材料表面先物理吸附氧化石墨烯，然后再通過物理吸附方法負載亞甲藍，通過提高氧化石墨烯的用量來增加亞甲藍的負載量。

優選的，當所述氧化石墨烯溶液的濃度為0.5g/l或1.0g/l時，亞甲藍負載量接近最大，約為1.56±0.12ng/cm²。

與現有技術相比，本發明的優點包括：通過改變氧化石墨烯的濃度，使納米纖維上包被的氧化石墨烯的量不同，而通過π-π堆垛、靜電作用等物理作用吸附在支架材料上的亞甲藍的量也不同。從而治療處于不同階段的ad病變，使其既能夠清除患者腦內毒性物質，又能補充受損的神經元。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明中記載的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1所示為本發明具體實施例中纖維支架材料的制備流程圖；

圖2a所示為本發明具體實施例中不同濃度氧化石墨烯包被的納米纖維膜的掃描電鏡圖；

圖2b所示為本發明具體實施例中包被于纖維支架上氧化石墨烯的拉曼特征峰；

圖2c所示為本發明具體實施例中纖維支架材料總亞甲藍釋放量；

圖2d所示為本發明具體實施例中纖維支架材料中氧化石墨烯的拉曼特征峰；

圖3a所示為本發明具體實施例步驟三中細胞活性的示意圖；

圖3b所示為本發明具體實施例步驟三中共聚焦顯微鏡采集圖片；

圖4所示為本發明具體實施例步驟四中纖維支架材料對tau蛋白磷酸化的抑制作用示意圖。

具體實施方式

本發明實施例提供一種更好的能夠負載干細胞，并能清除患者腦內毒性物質的支架材料及其制備方法。利用氧化石墨烯特殊的化學結構以及對亞甲藍超強的吸附性能，通過改變石墨烯的濃度而調控支架上亞甲藍的負載量，制備出可控緩釋亞甲藍的氧化石墨烯-靜電紡絲納米纖維復合支架材料，該材料既可以清除患者腦內毒性物質，又能有效補充受損的神經元。

具體地，本發明實施例提供一種纖維支架材料，包括基體以及負載于基體表面的亞甲藍，所述基體包括plga(聚乳酸羥基乙酸)納米纖維支架、以及包被于所述plga納米纖維支架表面的氧化石墨烯。

plga納米纖維支架還可以為其他任意一種纖維支架。

本發明實施例還提供一種纖維支架材料的制備方法，包括步驟：

(1)通過靜電紡絲方法制備plga納米纖維支架；

(2)將氧化石墨烯通過物理吸附方法包被到plga納米纖維支架表面；

(3)通過物理吸附將亞甲藍負載到氧化石墨烯包被的plga納米纖維支架上。

優選的，所述物理吸附包括π-π共軛作用、靜電作用。

優選的，所述步驟(1)中，將plga溶解于四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液中，制備靜電紡絲前驅體溶液；采用靜電紡絲方法制備plga納米纖維支架，然后采用等離子體進行處理。所述步驟(2)中，將氧化石墨烯分散到去離子水中，獲得氧化石墨烯溶液，然后將plga納米纖維支架浸泡在氧化石墨烯溶液中，取出干燥后獲得氧化石墨烯包被的plga納米纖維支架。其中氧化石墨烯溶液的濃度為1.0g/l與0.5g/l時對纖維膜的覆蓋面積相當，幾乎達到完全覆蓋

本發明實施例還公開一種纖維支架材料表面亞甲藍負載量的調節方法，在纖維支架材料表面先物理吸附氧化石墨烯，然后再通過物理吸附方法負載亞甲藍，通過改變氧化石墨烯的用量以調節亞甲藍的負載量。

當所述氧化石墨烯溶液的濃度為1.0g/l或0.5g/l時，亞甲藍的負載量相當，約為1.56±0.12ng/cm²。

本發明通過下列實施例作進一步說明：根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。

纖維支架復合材料的制備如圖1的合成示意圖所示，是通過物理吸附的方法將氧化石墨烯包被在納米纖維表面，并通過物理作用將亞甲藍負載在納米復合材料上。

材料的詳細制法分為三個部分：靜電紡絲納米纖維制備、表面包被不同濃度的氧化石墨烯、負載不同量的亞甲藍。具體步驟如下：

步驟一，不同濃度氧化石墨烯包被的靜電紡絲納米纖維的制備：

3gplga溶解于20ml四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液(3/1,v/v)，用 超聲清洗儀超聲溶解10min(53w，sk、1200h，上海kudosinc.)。

plga溶液通過bgg40/2(北京高科生物技術有限公司)在10kv高壓下以0.25ml/h的速率紡織到覆蓋有玻璃基底的金屬接收器上。噴射器和接收器之間的距離為20cm。真空干燥兩天后，plga納米纖維用等離子體處理30s。

單層的氧化石墨烯是通過hummer’s法制備的。然后將氧化石墨烯分散到去離子水中(濃度1.0g/l、0.5g/l、0.25g/l、0.1g/l)，再將材料浸泡在氧化石墨烯溶液中15min，然后將基底材料放在真空干燥箱里干燥6h。掃描電鏡照片顯示氧化石墨烯包被在靜電紡絲納米纖維膜表面(圖2a)，拉曼光譜也檢測到氧化石墨烯的拉曼特征峰(圖2b)。

步驟二，可控緩釋亞甲藍的氧化石墨烯-靜電紡絲納米復合支架材料的制備和表征：

將氧化石墨烯包被的納米纖維支架材料浸泡在0.5g/lmb溶液中2h。將材料用pbs溶液清洗3次后，真空干燥過夜后用掃描電鏡觀察表面形態。mb的緩釋是檢測面積約為635mm²納米纖維上mb在不同的時間點(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天)在腦脊液模擬液中的釋放。總mb釋放量如圖2c，mb在材料上的緩釋結果如圖2d。

步驟三，可控緩釋亞甲藍的氧化石墨烯-靜電紡絲納米復合支架材料用于神經前體細胞培養：

神經前體細胞接種到聚賴氨酸(pdl)和層粘連蛋白(laminin)包被的plga，plga-go，plga-go-mb納米纖維支架上以密度為5×10⁴每孔接種到48孔板里。用wst-1測定在不同的時間點里(1、3、5、7天)的細胞活性，結果如圖3a所示。為了考察npc在材料上的分化行為，單個神經前體細胞被接種到pdl和laminin包被的基底上培養24h后，添加神經分化培養基培養6天，每3天換一次液。其中分化培養基的組成是在不含有egf和bfgf的neurobasalmedium中添加b27(1:100)和2nml-谷氨酸。之后細胞用4％多聚甲醛固定，用anti-betaiiitubulinantibody和cy3-標記的二抗進行免疫染色，然后用共聚焦顯微鏡采集圖片(圖3b)。

步驟四，可控緩釋亞甲藍的氧化石墨烯-靜電紡絲納米復合支架材料減弱tau蛋白磷酸化：

將用慢病毒構建的過表達tau蛋白的神經前體細胞接種到復合材料上，用3nm岡田酸誘導tau蛋白過度磷酸化，結果發現mb能顯著抑制tau蛋白磷酸化(圖4)。

綜上所述，本發明方法優點在于：可以通過改變氧化石墨烯的濃度來調節亞甲藍的負載量，并且可以同時實現ad患者腦部有害物質的清除和受損神經元的補充。該方法制備的材料已顯現出抑制tau蛋白病變的效果。并且該材料易于保存和運輸，并且制備方法簡單成本低，排除了負載生長因子的缺陷。

還需要說明的是，為了避免因不必要的細節而模糊了本發明，在附圖中僅僅示出了與根據本發明的方案密切相關的結構和/或處理步驟，而省略了與本發明關系不大的其他細節。

最后，還需要說明的是，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。