本發明涉及一種植物源廣譜抗菌劑及其制備方法和應用。
背景技術：
防腐劑是指可以阻止微生物生長的物質。在化妝品中，防腐劑的作用是保護產品，使之免受微生物污染。目前常用的防腐劑多為合成防腐劑，例如乙內酰脲(dmdmh)、卡松系列、布羅波爾、碘代丙炔基氨基甲酸丁酯(ipbc)、尼泊金酯類、三氯新等。這些防腐劑均存在一定缺陷：例如，dmdmh在使用過程中易釋放甲醇，存在安全隱患；卡松系列因含氯成分，使用過程中可能對某些膚質產生一定的刺激性；布羅波爾易產生致癌物質亞硝胺；ipbc可能導致使用者碘的過量攝入；尼泊金酯類易在脂肪組織中產生累積；三氯新已被證實會對環境產生負面影響；此外對羥基苯甲酸防腐劑類在特定的測試系統中已經證實能顯示某種模擬女性激素雌激素的能力，對人體安全和生理系統帶來不良影響。可見，市場上亟需出現一種低毒、高效、無污染的天然防腐劑。
近年來，在回歸自然、享受綠色與健康的熱潮沖擊下，化妝品中加入純天然的防腐劑已成為國內外提倡和開發的熱點，從天然產物提取分離出抗菌性強而廣、安全無毒的天然防腐劑已成為今后開發的重要方向。
而目前使用的天然防腐劑多為粗制品，其顏色較深，氣味較濃，抗菌譜也較窄。同時，有些中藥聯合使用后抗菌效果不如單味藥，如黃芪和黃芩混合配比后對大腸桿菌、綠膿桿菌和沙門氏桿菌的抑菌作用弱于單獨使用。因此，開發一種原料天然、能廣譜抗菌的抗菌劑是本領域亟待解決的技術難題。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題在于克服現有技術中存在的天然防腐劑抗菌譜較窄的缺陷，而提供了一種植物源廣譜抗菌劑及其制備方法和應用。本發明提供的植物源廣譜抗菌劑具有廣譜抗菌、溫和、溶解性好、經濟、用量小、穩定及適合工業化生產的優點，可以有效抑制化妝品中微生物的生長，延長化妝品的貨架壽命，同時有利于保障產品的安全性，防止消費者因使用受微生物污染的產品而引起可能的感染。本發明提供的制備方法克服了傳統制備工藝制備的中藥提取液氣味重，有效成分保留少，雜質多，抗菌譜窄、用量大、刺激性強等問題。
本發明是采用如下技術方案來解決上述技術問題的：
本發明提供了一種植物源廣譜抗菌劑的制備方法，所述的植物源廣譜抗菌劑的原料包括物料a、水、脂肪酶和ph調節劑，以質量份數為100份計，所述物料a包括以下組分：0.1～5份的山蒼子油、0.1～5份的廣藿香油、0.1～5份的香茅油、0.1～5份的水解人參皂苷和80～99.6份的辛酸癸酸甘油三酯；所述的制備方法包括如下步驟：
(1)將所述物料a中的各組分混合均勻，得油脂混合物；
(2)將水與脂肪酶混合均勻，再調節ph值至7～10，再與所述油脂混合物混合均勻，在40～50℃下酶解，酶解過程中伴以攪拌，得酶解液；
(3)對所述酶解液進行超聲處理，然后進行油水分離，取油相；
(4)對所述油相進行陳化處理，取上清液過濾，得濾液，即可。
本發明中，以質量份數為100份計，所述物料a較佳地包括以下組分：0.2～1份的山蒼子油、0.2～1份的廣藿香油、0.2～1份的香茅油、0.2～1份的水解人參皂苷和96～99.2份的辛酸癸酸甘油三酯。
其中，所述的山蒼子油具有本領域常規含義，其來源于樟木科植物，山雞椒的果實，較佳地購自吉安國光香料廠。
其中，所述的廣藿香油具有本領域常規含義，其來源于唇形科植物廣藿香草的地上部分，較佳地購自吉安市萬億香料油有限公司。
其中，所述的香茅油具有本領域常規含義，其來源于禾本科香茅屬植物香茅草的全草，較佳地購自吉安市萬億香料油有限公司。
其中，所述的水解人參皂苷具有本領域常規含義，其來源于五加科植物人參的根莖葉中人參皂苷的水解產物，較佳地購自西安萃源生物科技有限公司。
其中，所述的辛酸癸酸甘油三酯具有本領域常規含義，其來源于棕櫚科植物油棕的果實，為棕櫚油精制后的衍生物，較佳地購自上海賽福化工發展有限公司。
本發明中，所述的水為本領域常規物質，較佳地為去離子水，所述的去離子水的用量為本領域常規用量，較佳地為所述物料a的用量的1/10～1/5。
本發明中，所述的ph調節劑為本領域常規物質，較佳地為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、鹽酸和檸檬酸中的一種或多種。
步驟(2)中，所述的脂肪酶為本領域常規物質，較佳地購自莊市杰諾生物酶有限公司；所述的脂肪酶的用量為將溶液中的酶活性調節至常規酶解反應所需要的酶活性，較佳地為將酶活性調節至10～500u/g所需的脂肪酶的用量，更佳地為將酶活性調節至50～100u/g所需的脂肪酶的用量。
步驟(2)中，所述的酶解的時間為本領域常規的酶解時間，一般為1小時以上，較佳地為1～4小時。
步驟(2)中，所述的攪拌為本領域常規操作，所述的攪拌的速率較佳地為100～300rpm，更佳地為200rpm。
步驟(3)中，所述的超聲為本領域常規操作，所述的超聲的頻率較佳地為25000～35000hz，更佳地為30000hz；所述的超聲的時間較佳地為2～10分鐘。
步驟(3)中，所述的油水分離可以采用本領域常規操作實現，較佳地為靜置。所述的靜置的時間為本領域常規，較佳地為0.5～4h。
步驟(4)中，所述的陳化為本領域常規操作，所述的陳化的溫度較佳地為-6℃～-2℃，更佳地為-4℃；所述的陳化的時間較佳地為8～14小時，更佳地為12小時。
本發明還提供了一種由上述制備方法制得的植物源廣譜抗菌劑。
本發明中，所述的植物源廣譜抗菌劑具有廣譜抗菌性能，其能抵抗的菌的種類較佳地包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌中的一種或多種。
本發明還提供上述植物源廣譜抗菌劑在日用化妝品和/或皮膚外用藥物中作為防腐劑的應用。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在于：
(1)本發明通過應用植物間的配伍關系及協同作用，使提取物具有廣譜抗菌的作用，并且在原料中引入了水解人參皂苷，使抗菌劑的安全性得到很大提高；
(2)本發明在傳統中藥制劑的制備過程中融入了現代生物酶解技術，明顯降低了刺激性，大大提高了植物抗菌劑的抗菌活性，同時改良了不良氣味對抗菌劑應用的影響；通過陳化除去部分雜質，從而更好地保留小分子物質，在滿足化妝品使用要求和美感上有重要貢獻；
(3)本發明中整個工藝過程都是以植物油脂及提取物為原料，在低溫條件下制備，綠色天然，節能環保；
(4)本發明制得的抗菌劑能與二丙二醇以任意比例互溶，由于使用量較低，為稱量方便，可以用二丙二醇進行稀釋。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
下述實施例中，所使用的山蒼子油購自吉安國光香料廠，廣藿香油購自吉安市萬億香料油有限公司，香茅油購自吉安市萬億香料油有限公司，水解人參皂苷購自西安萃源生物科技有限公司，辛酸葵酸甘油三酯購自上海賽福化工發展有限公司，脂肪酶購自棗莊市杰諾生物酶有限公司。
實施例1(抗菌劑)
本實施例中植物源廣譜抗菌劑的制備方法如下：
(1)將0.1g山蒼子油、0.1g廣藿香油、0.1g香茅油、0.1g水解人參皂苷和99.6g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均勻，得油脂混合物；
(2)取10g去離子水，加入脂肪酶，至酶活性為50u/g，使用碳酸氫鈉調節ph值至8，與步驟(1)中的油脂混合物混合均勻，在40℃條件下酶解2h，酶解過程中伴以攪拌，攪拌速率為100rpm；
(3)停止攪拌，在30000hz條件下超聲2分鐘，再靜置30分鐘進行油水分離，取油相；
(4)將油相在-4℃下陳化12小時，取上清液過濾，即得所述植物源廣譜抗菌劑。
實施例2(抗菌劑)
本實施例中植物源廣譜抗菌劑的制備方法如下：
(1)將1g山蒼子油、1g廣藿香油、1g香茅油、1g水解人參皂苷和96g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均勻，得油脂混合物；
(2)取10g去離子水，加入脂肪酶，至酶活性為100u/g，使用碳酸鈉調節ph值至9，與步驟(1)中的油脂混合物混合均勻，在45℃條件下酶解4h，酶解過程中伴以攪拌，攪拌速率為200rpm；
(3)停止攪拌，在30000hz條件下超聲5分鐘，再靜置1h進行油水分離，取油相；
(4)將油相在-4℃下陳化12小時，取上清液過濾，即得所述植物源廣譜抗菌劑。
實施例3(抗菌劑)
本實施例中植物源廣譜抗菌劑的制備方法如下：
(1)將5g山蒼子油、5g廣藿香油、5g香茅油、5g水解人參皂苷和80g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均勻，得油脂混合物；
(2)取20g去離子水，加入脂肪酶，至酶活性為10u/g，使用檸檬酸調節ph值至7，與步驟(1)中的油脂混合物混合均勻，在50℃條件下酶解4h，酶解過程中伴以攪拌，攪拌速率為300rpm；
(3)停止攪拌，在25000hz條件下超聲10分鐘，再靜置4h進行油水分離，取油相；
(4)將油相在-6℃下陳化8小時，取上清液過濾，即得所述植物源廣譜抗菌劑。
實施例4(抗菌劑)
本實施例中植物源廣譜抗菌劑的制備方法如下：
(1)將0.2g山蒼子油、0.2g廣藿香油、0.2g香茅油、0.2g水解人參皂苷和99.2g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均勻，得油脂混合物；
(2)取10g去離子水，加入脂肪酶，至酶活性為500u/g，使用氫氧化鈉調節ph值至10，與步驟(1)中的油脂混合物混合均勻，在45℃條件下酶解4h，酶解過程中伴以攪拌，攪拌速率為200rpm；
(3)停止攪拌，在35000hz條件下超聲5分鐘，再靜置1h進行油水分離，取油相；
(4)將油相在-2℃下陳化14小時，取上清液過濾，即得所述植物源廣譜抗菌劑。
對比實施例1(不采用生物酶解技術的抗菌劑的對比實施例)
本對比實施例中抗菌劑的制備方法如下：
(1)將1g山蒼子油，1g廣藿香油，1g香茅油，1g水解人參皂苷，96g辛酸癸酸甘油三酯，充分混合均勻；
(2)在-10℃下陳化12小時，過濾，即得所述植物源防腐劑。
對比實施例2(原料中不加水解人參皂苷的抗菌劑的對比實施例)
本對比實施例中抗菌劑的制備方法如下：
(1)將1g山蒼子油，1g廣藿香油，1g香茅油，97g辛酸癸酸甘油三酯，充分混合均勻；
(2)取10g去離子水，加入脂肪酶，至酶活性為100u/g，調節ph值至9，與步驟(1)中的油脂混合，在45℃條件下，攪拌4h；
(3)停止攪拌，在30000赫茲條件下，超聲5分鐘，靜置1h，進行油水分離，取油相；
(4)在-10℃下陳化12小時，過濾，即得所述植物源防腐劑。
效果實施例1(抗菌劑的抑菌試驗)
抑菌試驗步驟：
(1)試驗菌株
金黃色葡萄球菌(atcc8739)，大腸桿菌(atcc6538)，綠膿桿菌(atcc9027)，白色念珠球菌(atcc10231)，黑曲霉菌(atcc16404)。
(2)培養基
tsb固體培養基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，k2hpo42.5g/l，酵母提取物3g/l，瓊脂15g/l，蒸餾水溶解，調節ph為7.2±0.2，115℃高壓滅菌20min；tsb液體培養基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，k2hpo42.5g/l，酵母提取物3g/l，蒸餾水溶解，調節ph為7.2±0.2，115℃高壓滅菌20min；
sdb固體培養基：蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo43g/l，酵母提取物5g/l，瓊脂15g/l，蒸餾水溶解，115℃高壓滅菌20min；sdb液體培養基：蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo43g/l，酵母提取物5g/l，蒸餾水溶解，115℃高壓滅菌20min。
(3)菌懸液制備及接種
取甘油保藏的金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌100μl涂布于tsb固體培養基上，37℃培養2d，用生理鹽水重懸，得到菌懸液，并用平板培養法計數，將測試菌濃度調整為105～106cfu/ml。
白色念珠球菌和黑曲霉菌100μl涂布于sdb固體培養基上，30℃培養2d，用生理鹽水重懸，得到菌懸液，并用平板培養法計數，將測試菌濃度調整為105～106。
(4)樣品抑菌作用的測定
杯碟法
在培養皿中倒入tsb或sdb固體培養基，待凝固后，在此培養基上均勻涂布測試菌100μl。在培養基上等距離放2個無菌牛津杯[內徑(6.0±0.1)mm，外徑(8.0±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm，在杯內分別注入200μl待測樣品，用生理鹽水或含一定量的dmso的生理鹽水作為對照。37℃或30℃恒溫箱中培養2d后，用直尺測量各種藥品的抑菌圈直徑，取其平均值。
微孔板法
在微孔中加入100μl待測樣品(初始濃度)，再加入含測試菌濃度1.0×105cfu/ml為2×tsb或2×sdb液體培養基100μl，混勻，即待測樣品的測試濃度為初始濃度的50wt％。30℃或37℃恒溫箱中培養2d后，觀察有無菌生長。結果判斷的前提是生長對照良好，空白對照無菌生長清晰。
(5)最低抑菌濃度(mic值)的測定
①最低抑制金黃色葡萄球菌濃度(mic)、最低抑制大腸桿菌濃度(mic)、最低抑制綠膿桿菌濃度(mic)、最低抑制白色念珠球菌濃度(mic)的測定方法如下：
藥液制備：將待測樣品用生理鹽水稀釋成實驗濃度。
菌液制備：用2×tsb或2×sdb液體培養基稀釋菌懸液，使其最終菌濃度為l05cfu/ml。
培養及結果判讀：在微孔中加入菌液100μl和藥液100μl，同時設不加菌的陰性對照和不加藥液的正常生長對照，每種藥做3個平行，取平均值。置37℃或30℃濕盒孵育，48h后觀察結果，采用直接法讀取數據。結果判斷的前提是生長對照良好，空白對照無菌生長清晰，其它孔隨藥物濃度梯度升高而菌的生長受到抑制。
②最低抑制黑曲霉濃度(mic)測定
采用杯碟法，在培養皿中倒入sdb固體培養基，待凝固后，在此培養基上加入黑曲霉菌(105cfu/ml)100μl，均勻涂布。在培養基上等距離放3個無菌牛津杯[內徑(6.0±0.1)mm，外徑(8.0±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm，在杯內分別注入200μl不同濃度的樣品(用生理鹽水稀釋)。同時設不加測試樣品的正常生長對照和生理鹽水對照。結果判斷的前提是生長對照和生理鹽水對照生長良好，其它隨藥物濃度梯度升高而菌的生長受到抑制。
本發明與單味植物油(植物油用辛酸癸酸甘油三酯稀釋成3％的溶液)，以及水解過程可能產生的已知具有一定防腐效果的單辛酸癸酸甘油酯相比，產品抑菌結果如表1所示：
表1實施例與單味植物油的mic值比較
由表1可知，在100μl/ml以內，山蒼子油對大腸桿菌、黑曲霉無抗菌效果，對白色念珠菌、綠膿桿菌抗菌效果一般；在100μl/ml以內廣藿香對綠膿桿菌無抗菌效果，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抗菌效果一般；在100μl/ml以內，香茅油對大腸桿菌、綠膿桿菌無抗菌效果，對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉的抗菌效果一般，單辛酸甘油酯對綠膿桿菌、黑曲霉抗菌效果一般，單癸酸甘油酯對綠膿桿菌和白色念珠菌抗菌效果一般。
本發明實施例與對比實施例的抑菌結果比較如表2所示：
表2實施例與對比實施例的mic值比較
由表2可知對比實施例1對各菌的抑制效果均一般，對比實施例2與實施例2的抑菌效果相當。
由此可見：一、通過植物之間的合理配伍，起到廣譜抗菌的效果；二、針對每個菌單獨來看，配伍后的抑菌效果優于單味植物的抗菌效果，實現了1+1大于2的結果，體現了植物之間抗菌效果上的協同作用；三、酶解后的綜合產物，優于其可能產生的單一成分的抑菌效果；四、酶解后能夠大幅度提高抑菌效果。
本發明的組方抑菌功效顯著，具有廣譜的抗菌功效，其抑菌效果要好于單味藥的效果，克服了單味藥對某些菌株的局限性。同時，此發明的三種中藥的比例可以最大限度的抑制細菌的增長。適合作為植物防腐劑使用，工藝方案保持了抑菌功效，并大幅減弱了產品的顏色，產品穩定，適合添加到化妝品中作為防腐劑使用。
為進一步說明本發明的技術內容、所實現目的及效果，下面的實施例中將對本發明作進一步的說明，在實施例中申請人特意加了易滋生微生物的膠原蛋白和葡萄糖來有效說本工藝下植物防腐劑的使用效果，實施例不以任何方式限制本發明。所有材料均為質量百分比濃度。
實施例5(本發明實施例1制備的抗菌劑作為防腐劑在霜類產品中的應用)
本實施例的霜類產品可作為保濕霜、修復霜等使用，其原料配方如下：
本實施例的霜類產品的制備工藝如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明質酸鈉、聚丙烯酸鈉，攪拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二鈉加入該釜中，加熱至溫度為85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山崳醇、ve醋酸酯、emulgadesucro(emulgadesucro為商品名，其具體物質為蔗糖多硬脂酸酯和氫化聚異丁烯)、植物甾醇放至油相釜中，加熱至溫度為85℃，攪拌為300rpm，即得油相。
(3)將(2)油相與(1)水相在乳化釜中混合，均質(速度為500rpm)5min，攪拌降溫至45℃。
(4)取本發明實施例1得抗菌劑、膠原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，攪拌速度為500rpm，降至室溫。
實施例6(本發明實施例2制備的抗菌劑作為防腐劑在霜類產品中的應用)
本實施例的霜類產品可作為保濕霜、修復霜等使用，其原料配方如下：
本實施例的霜類產品的制備工藝如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明質酸鈉、聚丙烯酸鈉，攪拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二鈉加入該釜中，加熱至溫度為85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山崳醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加熱至溫度為85℃，攪拌為300rpm，即得油相。
(3)將(2)油相與(1)水相在乳化釜中混合，均質(速度為500rpm)5min，攪拌降溫至45℃。
(4)取本發明實施例2得天然抗菌劑、膠原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，攪拌速度為500rpm，降至室溫。
實施例7(本發明實施例1制備的抗菌劑作為防腐劑在水類產品中的應用)
本實施例的水類產品可作為潤膚水、保濕水、精華水等使用，其原料配方如下：
本實施例的水類產品的制備工藝如下：
(1)取甘油、丁二醇，加水相釜中，加入透明質酸鈉，攪拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二鈉加入該釜中，加熱至溫度為85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取本發明實施例1得天然抗菌劑、peg-40氫化蓖麻油、1,2-辛二醇、1,2-戊二醇放油相釜中，攪拌均勻，加熱至溫度為85℃，即得油相。
(3)將(2)油相加入(1)水相，快速攪拌(速度為300rpm)5min，攪拌降溫至45℃。
(4)取膠原蛋白和葡萄糖加至(3)中，攪拌速度為300rpm，降至室溫。
對比實施例3(本發明對比實施例1制備的抗菌劑作為防腐劑在霜類產品中的應用)
本對比實施例的霜類產品可作為保濕霜、修復霜等使用，其原料配方如下：
本對比實施例的霜類產品的制備工藝如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明質酸鈉、聚丙烯酸鈉，攪拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二鈉加入該釜中，加熱至溫度為85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山崳醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加熱至溫度為85℃，攪拌為300rpm，即得油相。
(3)將(2)油相與(1)水相在乳化釜中混合，均質(速度為500rpm)5min，攪拌降溫至45℃。
(4)取本發明對比實施例1得天然抗菌劑、膠原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，攪拌速度為500rpm，降至室溫。
對比實施例4(本發明對比實施例2制備的抗菌劑作為防腐劑在霜類產品中的應用)
本對比實施例的霜類產品可作為保濕霜、修復霜等使用，其原料配方如下：
本對比實施例的霜類產品的制備工藝如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明質酸鈉、聚丙烯酸鈉，攪拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二鈉加入該釜中，加熱至溫度為85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山崳醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加熱至溫度為85℃，攪拌為300rpm，即得油相。
(3)將(2)油相與(1)水相在乳化釜中混合，均質(速度為500rpm)5min，攪拌降溫至45℃。
(4)取本發明對比實施例2得天然抗菌劑、膠原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，攪拌速度為500rpm，降至室溫。
對比實施例5(本領域常規的水類產品)
本對比實施例的水類產品可作為潤膚水、保濕水、精華水等使用，其原料配方如下：
本對比實施例的水類產品的制備工藝如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明質酸鈉、聚丙烯酸鈉，攪拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二鈉加入該釜中，加熱至溫度為85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山崳醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加熱至溫度為85℃，攪拌為300rpm，即得油相。
(3)將(2)油相與(1)水相在乳化釜中混合，均質(速度為500rpm)5min，攪拌降溫至45℃。
(4)取本發明單癸酸甘油酯、膠原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，攪拌速度為500rpm，降至室溫。
效果實施例2(實施例5～7、對比實施例3～5的防腐挑戰試驗)
(1)防腐挑戰接種的方式和數量：
采用混合菌接種。待測樣品中接入金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌至接種數量為105～106cfu/g或105～106cfu/ml；白色念珠球菌和黑曲霉菌接種數量為104cfu/g或104cfu/ml，各三個平行，以生理鹽水作為空白對照。
(2)防腐挑戰分離檢測
接種后的樣品在特定時間分離檢測：0小時、7天、14天、21天和28天。取樣后，根據實驗需要，用生理鹽水稀釋后取100μl涂布于tsb和sdb培養基平板，28℃±1℃或36℃±1℃培養后菌落計數。
(3)評判標準(按照化妝品和香料香精協會(ctfa)標準)
要求在第7天時，細菌降低99.9％，黑曲霉菌和白色念珠球菌各降低90％，并且在28天內持續下降，則通過防腐挑戰試驗。
如果混合菌接種的三個平行試驗中任何一個微生物數量的平均值，在第7天時下降到100cfu/g(cfu/ml)以下，在28天內全部降至0cfu/g(cfu/ml)或＜10cfu/g(cfu/ml)，那么視為防腐效果優秀。
表30小時防腐挑戰結果
表448小時防腐挑戰結果
表57天防腐挑戰結果
表614天防腐挑戰結果
表721天防腐挑戰結果
表828天防腐挑戰結果
表9防腐挑戰結果匯總
效果實施例3(實施例5～7、對比實施例4的人體皮膚斑貼試驗)
(1)斑試方法：選用合格的斑試器，以封閉式斑貼試驗方法，將受試物約0.020g～0.025g涂于斑試器內，外用專用膠帶貼敷于受試者前臂曲側，24小時后去除受試物，于去除受試物斑試器后30min，待壓痕消失后觀察皮膚反應，按《化妝品衛生規范》(2007年版)中皮膚反應分組標準記錄其結果。
(2)結果評價：按表10(皮膚不良反應分組標準)記錄反應結果，具體結果見表11。
表10皮膚不良反應分組標準
表11實施例樣品對人體皮膚斑貼試驗結果
結論：各組的人體皮膚斑貼試驗結果顯示：在3個實施例中30例受試者皮膚全部呈陰性反應，而對比實施例4，有7例為可疑反應，僅有微弱紅斑(評分等級：0級)。依據《化妝品衛生規范》(2007年版)人體皮膚斑貼試驗判斷標準3組實施例對人體無皮膚不良反應，而對比實施例4為可疑反應，說明本發明的原料中加入水解人參皂苷帶來的意義，即能大大提高防腐劑的安全性。