本發明涉及一種水包油包水型乳化劑及其用途和使用方法。
背景技術：
：佐劑種類很多，目前尚無統一的分類方法，常用的佐劑可分為4類：無機佐劑，如氫氧化鋁，明礬等；有機佐劑，微生物及其產物等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷等；油佐劑，如弗氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。油佐劑目前在動物中最常用，又可分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種。不完全佐劑即油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑相混合而成，當其再與抗原混合通過機械剪切形成油包水(W/O)乳劑，可用于免疫注射，制成油包水(W/O)乳劑的佐劑稱為油包水(W/O)佐劑，又稱單相佐劑。在不完全佐劑中加入死的分枝桿菌，即成為弗氏完全佐劑。完全佐劑的免疫強度大于不完全佐劑。但是油包水(W/O)型疫苗由于粘度大，注射較困難；同時由于疫苗中的白油含量較高，常常導致嚴重的接種副反應，在接種部位會可見有浮、腫脹、硬結和壞死等。而粘度較小，易于注射的水包油(O/W)型疫苗，由于免疫原性弱，僅能誘導動物體內產生弱的免疫應答，限制了其在動物疫苗方面的推廣和應用。而水包油包水(W/O/W)雙相佐劑與油包水單相佐劑(W/O)相比具有同等抗原性，但前者更易于乳化(中速攪拌即可)、制成的疫苗黏度小、安全性好、易于吸收，制成的疫苗更為穩定。因此制成的水包油包水疫苗乳液，即便與注射有具有良好的免疫原性，是最理想的乳劑疫苗。現在最好的水包油包水(W/O/W)雙相佐劑是進口法國SEPPIC公司的生產的ISA206佐劑。其通過自乳化技術制備了W/O/W型乳劑疫苗，解決了W/O/W型乳劑疫苗制備難的問題，而且具有一定的穩定性，在全球范圍內得到了廣泛應用。其不足之處為所制備的W/O/W型乳劑疫苗穩定性還不太令人滿意，并且價格昂貴。專利“一種自乳化疫苗佐劑及其制備方法”(CN1679933A)公布了W/O/W型乳化劑，但其用到的有些原料較貴且不易得；同時乳化疫苗在田間試驗時有副反應發生。專利“一種復方油佐劑及其制備方法和應用”(CN102813922A)公布的W/O/W型乳化疫苗，其穩定性在室溫時不是太理想，因此不適于商業化應用。所以開發穩定性好，免疫活性強和簡單低廉的W/O/W性乳化劑具有極其重要的現實意義和市場價值。技術實現要素：本發明旨在解決上面描述的問題。本發明的目的是提供一種水包油包水型乳化劑，通過簡單易得的原料，經特定的配置比例，使制備出的乳化劑具有比以往同類乳化劑更好的穩定性，且價格低廉，適用于商業推廣。根據本發明的一個方面，提供一種水包油包水型乳化劑，該水包油包水型乳化劑包括以下組分和質量百分含量：油相：70～98wt％；親水性表面活性劑：1～29wt％；親油性表面活性劑：1～29wt％；其中，所述親水性表面活性劑包括聚乙二醇264單油酸酯、聚乙二醇400單油酸酯、聚乙二醇600單油酸酯中的一種或多種。其中，油相包括白油或礦物油中的一種或兩種；親油性表面活性劑包括司盤60，司盤65，司盤80，甘露醇單油酸酯中的一種或多種。其中，水包油包水型乳化劑還包括下述組分和質量百分含量：助乳化劑：0～3wt％。其中，水包油包水型乳化劑包含下述組分和質量百分含量：油相：92～94wt％；親水性表面活性劑：3～5wt％；親油性表面活性劑：3～5wt％。其中，水包油包水型乳化劑包含下述組分和質量百分含量：油相：75～90wt％，親水性表面活性劑：3～10wt％親油性表面活性劑：1～15wt％其中，助乳化劑包括脂肪醇聚氧乙烯醚、吐溫40、吐溫60、吐溫80中的一種或多種。其中，水包油包水型乳化劑包括下述組分和質量百分含量：根據本發明的另一個方面，提供一種該水包油包水型乳化劑的使用方法，具體包括以下步驟：1)將所述水包油包水型乳化劑加熱至25～35℃。2)將加熱后水包油包水型乳化劑與抗原水溶液混合攪拌，制得疫苗乳液。其中，步驟2)包括：水包油包水型乳化劑與抗原水溶液的混合質量比為1～1.5：1。根據本發明的第三個方面，提供一種該水包油包水型乳化劑的用途，具體包括本發明提供的乳化劑在制備動物疫苗中的應用。本發明通過大量的實驗發現，當表面活性劑選用本發明選用乙二醇(264，400，600)單油酸酯時，該乳化劑更易在體內被降解，并且不會引起副作用。探究其原因可能是因為，聚乙二醇(264，400，600)單油酸酯是脂肪酸在催化劑的作用下與環氧乙烷加成，形成的非離子表面活性劑。非離子表面活性劑溶于水時不發生解離，其分子中的親油基團與離子型表面活性劑的親油基團大致相同，但是其親水基團主要是由具有一定數量的含氧基團(如羥基和聚氧乙烯鏈)構成。由于非離子表面活性劑在溶液中不是以離子狀態存在，所以它的穩定性高，不易受強電解質存在的影響，也不易受酸、堿的影響。正是由于非離子表面活性劑具有在水中不電離的特點，決定了它在某些方面較離子型表面活性劑優越，如在水中和有機溶劑中都有較好的溶解性，因而該表面活性劑體系也更適用于配制復合型水包油包水型乳化佐劑。同時，該表面活性劑的疏水基脂肪酸鏈和不同長度的聚氧乙烯親水基是由酯鍵相連接的，在體內容易被代謝降解，其生物兼容性好，會引起相對較小的副作用。本發明的水包油包水型乳化劑具有以下有益效果：(1)本發明通過選取合適的油相原料、親水型表面活性原料、親油型表面活性原料，并通過三者的合理配比，使制得的乳化劑具有超高的穩定性，進而使得制得疫苗溶液在室溫下有良好的穩定性，并且經研究對比發現，本發明的乳化劑的穩定性與ISA206佐劑的穩定性相當，二者的穩定性均大于專利CN1679933A公開的自乳化疫苗佐劑；另外，本發明還可通過加入與基礎原料成分相適合的助乳化劑和助乳化劑含量，進一步強化自身的穩定性，進一步提升疫苗溶液的室溫穩定性。(2)經大量臨床實驗證明，本發明的水包油包水型乳化劑與進口產品ISA206具有相近的免疫活性。并且，本發明的乳化劑在臨床實驗中，無副反應發生，對比國內以往的水包油包水型乳化劑，具有更高的安全性，適用于市場推廣。(3)該水包油包水型乳化劑的各組分包括油相、親水型表面活性劑、親油型表面活性劑和助乳化劑的原料選擇均不需進口，價格低廉，且容易得到，具有很高的商業價值，適用于商業推廣。具體實施方式為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例，對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。實施例1乳化劑X1乳化劑X1包括：礦物油88克；聚乙二醇400單油酸酯9克；甘露醇單油酸酯3克。其使用方法包括以下步驟：1)將乳化劑X1加熱至30℃；2)取加熱后的乳化劑X130克放入200mL的燒杯中，另取35℃抗原(滅活的豬口蹄疫病毒)水溶液30克也加入到該燒杯中，加完后把燒杯置于機械攪拌器下，保持200轉/每分鐘的轉速攪拌15分鐘，使乳液均勻一致，即得到自制的疫苗乳化液1。乳化劑X1的用途為：作為豬口蹄疫疫苗的佐劑。實施例2乳化劑X2乳化劑X2包括：礦物油85克；聚乙二醇400單油酸酯9克；甘露醇單油酸酯3克，脂肪醇聚氧乙烯醚3克。其使用方法包括以下步驟：1)將乳化劑X2加熱至35℃；2)取加熱后的乳化劑X245克放入200mL的燒杯中，另取15℃抗原(滅活的豬口蹄疫病毒)水溶液30克也加入到該燒杯中，加完后把燒杯置于機械攪拌器下，保持250轉/每分鐘的轉速攪拌15分鐘，使乳液均勻一致，即得到自制的疫苗乳化液2。乳化劑X2的用途為：作為豬口蹄疫疫苗的佐劑。實施例3乳化劑X3乳化劑X3包括：礦物油82克；聚乙二醇400單油酸酯9克；甘露醇單油酸酯3克，脂肪醇聚氧乙烯醚3克。其使用方法包括以下步驟：1)將乳化劑X3加熱至30℃；2)取加熱后的乳化劑X340克放入200mL的燒杯中，另取20℃抗原(滅活的豬口蹄疫病毒)水溶液30克也加入到該燒杯中，加完后把燒杯置于機械攪拌器下，保持225轉/每分鐘的轉速攪拌12分鐘，使乳液均勻一致，即得到自制的疫苗乳化液3。乳化劑X3的用途為：作為豬口蹄疫疫苗的佐劑。本發明的乳化劑包括多種，因各組分的原料和質量百分含量的選取不同而不同，以下為表格形式的舉例體現：實驗例1穩定性檢測實驗過程：對疫苗乳液1、疫苗乳液2、疫苗乳液3進行穩定性檢測，采用使用法國的ISA206作為佐劑的疫苗乳液I作為實驗的對照組。檢測結果：具體見表1～表3。表1：自制疫苗乳化液和對照疫苗乳液的比較表2：自制疫苗乳化液和對照疫苗乳液的4℃穩定性表3：自制疫苗乳化液和對照疫苗乳液的室溫(20～25℃)穩定性靜置時間疫苗乳液1疫苗乳液2疫苗乳液3疫苗乳液40天均勻一致均勻一致均勻一致均勻一致3天均勻一致均勻一致均勻一致均勻一致7天均勻一致均勻一致均勻一致均勻一致10天有分層均勻一致均勻一致有分層15天有分層均勻一致由表1可知，加入本發明的水包油包水型乳化劑X1～X3的疫苗乳液1～3，與加入ISA206乳化劑的疫苗乳液I相比，具有相近的外觀和黏度，由此推斷出，加入本發明的水包油包水型乳化劑的疫苗乳液與加入ISA206乳化劑的疫苗乳液具有相近似的應用范圍，適用于做成注射針劑或口服藥劑。由表2可知，在溫度為4℃的條件下，加入本發明的水包油包水型乳化劑X1～X3的疫苗乳液1～3，與加入ISA206乳化劑的疫苗乳液I相比，穩定性接近，并且穩定性均能保持12個月以上。由表3可知，在20～25℃的室溫下，疫苗乳液1的穩定性與疫苗乳液I的穩定性相同，疫苗乳液2和3的穩定性要明顯好于疫苗乳液I的穩定性，事實上，通過大量的實驗數據表明，加入本發明的乳化劑的疫苗乳液，在20～25℃的室溫下，好于或等于加入ISA206乳化劑的疫苗乳液的穩定性。實驗例2疫苗活性檢測實驗過程：用實施例1和實施例3中分別制得的疫苗乳液X1和疫苗乳液X3進行活性檢測實驗，使用加入ISA206乳化劑的疫苗乳液I作為對照組，依照《豬口蹄疫O型滅活疫苗質量標準》，分別對5頭豬進行免疫肌肉注射，通過觀察動物免疫后的臨床表現及監測免疫后28天抗體水平，對其安全性及效力進行評價。檢測結果：具體見表4。備注：抗體滴度以血清稀釋度的倒數表示。由表4可知，注射了疫苗乳液1、疫苗乳液3和疫苗乳液I的豬只均未見因注射引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身反應，同時，均未見口蹄疫癥狀或明顯的因注射疫苗引起的毒性反應，也就是說加入了本發明的乳化劑的疫苗與加入了ISA206乳化劑的疫苗具有相同的安全性，均無副作用發生。由表4還可知，疫苗乳液1的對豬只免疫后的ELISA抗體水平等于疫苗乳液I的豬只抗體水平，疫苗乳液3的對豬只免疫后的ELISA抗體水平高于疫苗乳液I的豬只抗體水平，事實上，通過大量的臨床實驗數據表明，加入本發明的乳化劑的疫苗乳液，其對豬只免疫后的ELISA抗體水平，全部大于或等于加入ISA206乳化劑的疫苗乳液的豬只免疫抗體水平。綜上所述，本發明的一種水包油包水型乳化劑，配方簡單、原料易得，且制成的疫苗乳液穩定性更好，并具有良好的免疫原性。最后應說明的是：在本文中，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包含一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設備中還存在另外的相同要素。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制。盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的精神和范圍。當前第1頁1 2 3