來源于共生發酵生成物的透明質酸酶抑制劑及其應用的制作方法

本發明涉及一種透明質酸酶抑制劑，特別是涉及一種來源于共生發酵生成物的透明質酸酶抑制劑及其于口服組合物、皮膚外用組合物以及醫藥組合物的應用。

背景技術：

透明質酸酶(hyaluronidase；haase)亦稱擴散因子，是一群水解透明質酸(hyaluronicacid；ha)糖苷酶的總稱，主要存在于動物組織(例如皮膚、關節、韌帶、眼睛等)、動物毒液及微生物中。透明質酸酶主要作用在透明質酸的n-乙酰胺基葡糖和d-葡糖醛酸之間的β-1,3、β-1,4糖苷鍵，將其解聚合并水解成相對低分子質量(mr)的ha或寡糖。透明質酸廣泛地存在于動物的各種組織中，在機體內顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節、調節蛋白質的運轉、促進創傷愈合等。更為重要的是，它具有良好的保濕作用，在保濕的同時，又是良好的透皮吸收促進劑。含透明質酸的化妝品目前在國際上被公認為「仿生化妝品」、「第四代化妝品」。

透明質酸酶依據最適反應ph值、氨基酸序列同源性及來源、結構和作用機制，可概分成三類，分別是內切-β-n-乙酰胺基葡萄糖苷酶、內切-β-葡萄糖醛酸苷酶、透明質酸裂解酶。

透明質酸酶是i型過敏反應和腫瘤細胞增殖的參與者，它與發炎、過敏有強相關性。可使結締組織的間質分解，組織水腫，血管通透性增加，炎癥加劇。這些作用與細菌及其產物的穿透和炎癥迅速擴散有關。因此，抑制透明質酸酶的活性，既能使透明質酸不被分解以維持其正常的生理功能，又能達到抗炎、抗過敏、抗腫瘤的功效。透明質酸酶也能暫時降低細胞間質的黏性，使皮下注射輸液、局部累積的滲出液或血液加快擴散而利于吸收，更可舒緩退化性關節炎的癥狀。因此，透明質酸酶也可作為藥物擴散劑以及治療退化性關節炎等應用。另外，在含有透明質酸的制劑(特別地，如美容增強劑和組織填充劑)中加入抑制透明質酸酶活性的添加劑，能夠增強制劑作用的持久性，避免規律性地重復給藥。所以，抑制透明質酸酶活性的添加劑的開發在制藥、保健品、化妝品行業具有重要意義。

透明質酸被分解會造成許多疾病，例如過敏、發炎、退化性關節炎等。目前已知有一些透明質酸酶抑制劑，例如多磺酸基粘多糖等，可抑制透明質酸酶的酵素活性，使透明質酸不被分解以維持其正常的生理功能，又能達到抗發炎、抗過敏、減緩退化性關節炎等功效。

目前已知天然來源產物中，列當科管花肉蓯蓉、七葉樹科天師栗的果實娑羅子、迷迭香等提取物，具有抑制透明質酸酶活性的活性。然而，上述具有抑制透明質酸酶的天然來源產物對于透明質酸酶的抑制效果有限。

有鑒于此，亟需開發一種天然來源產物，以提供具有抑制透明質酸酶活性的產品。

技術實現要素：

本發明的一方面是提供一種來源于共生發酵生成物的透明質酸酶抑制劑，其包含共生發酵生成物，且此共生發酵生成物為于植物性培養基中以多種發酵菌株經共生發酵步驟以及固液分離步驟而得。

本發明的另一方面是提供一種皮膚外用組合物，包含上述的透明質酸酶抑制劑，其中透明質酸酶抑制劑作為有效成分。

本發明的又一方面是提供一種透明質酸酶抑制劑用于制備具有抑制透明質酸酶的口服組合物，其是以上述透明質酸酶抑制劑作為有效成分。

本發明的再一方面是提供一種透明質酸酶抑制劑用于制備具有抑制透明質酸酶的醫藥組合物，其是以上述的透明質酸酶抑制劑作為有效成分。

根據本發明的上述方面，提出一種來源于共生發酵生成物的透明質酸酶抑制劑，其于植物性培養基中以多種發酵菌株經共生發酵步驟以及固液分離步驟而得，其中前述共生發酵步驟是于37℃下進行70小時至100小時，且前述發酵菌株選自于由多種乳酸菌菌株以及至少一非乳桿菌屬菌株所組成組中的至少8者。

依據本發明一實施例，上述乳酸菌菌株包括多種雙歧桿菌屬(bifidobacteriumspp.)菌株和/或乳桿菌屬(lactobacillusspp.)菌株。

依據本發明一實施例，上述雙歧桿菌屬選自于由青春雙歧桿菌(b.adolescentis；bcrc14606或atcc15703、bcrc14607或atcc15704、bcrc14608或atcc15705、bcrc14658或dsm20087、和/或bcrc80247或atcc15706)、兩叉雙歧桿菌(b.bifidum；bcrc11844或dsm20082、bcrc11845或atcc29521、bcrc14613或atcc11863、bcrc14614或atcc15696、bcrc14615或atcc29521、bcrc14630或atcc35914、和/或bcrc14670或dsm20215)、短雙歧桿菌(b.breve；bcrc11846或atcc15700、bcrc12584或cscc1900、bcrc14601或atcc15698、和/或bcrc14612或ncdo1456)、長雙歧桿菌(b.longum；bcrc11847或atcc15707、bcrc12585或cscc1901、bcrc14602或atcc15697、bcrc14634或atcc15708、和/或bcrc14664或dsm20097)及上述的任意組合所組成的。

依據本發明一實施例，上述乳桿菌屬菌株選自于由德氏乳桿菌保加利亞亞種(l.delbrueckiisubsp.bulgaricus；bcrc10696或atcc15703、bcrc12297或ncdo970、bcrc14007或ncdo2074、bcrc14008或ncdo2394、bcrc14010或ncdo2487、bcrc14069或cscc2505、和/或bcrc14071)、瑞士乳桿菌(l.helveticus；bcrc11052或iam12090、bcrc12258或atcc10386、bcrc12259或atcc12046、bcrc12296或ncdo1844、bcrc12936或atcc15009、bcrc14021或ifo3809、bcrc14026或atcc521)、鼠李糖乳桿菌(l.rhamnosus；bcrc10940或atcc7469、bcrc11673或atcc9595、bcrc12249或cscc2602、bcrc14027或atcc14957、bcrc14029或atcc21052、bcrc14068或cscc2608、bcrc16000或atcc53103、和/或bcrc16095或ncimb8824)、乳桿菌副干酪亞種(l.paracaseisubsp.paracasei；bcrc12188或atcc27216、bcrc12193或atcc25598、bcrc12248或atcc25302、bcrc14001或atcc335、bcrc14023或atcc27092、bcrc16100或atcc11582、bcrc17002或atcc334、bcrc17005或atcc11578、和/或bcrc17475或iam10074)、短乳桿菌(l.brevis；bcrc10361或atcc8287、bcrc11196或nrrl1834、bcrc12187或atcc14869、bcrc12310或atcc367、和/或bcrc14060或dsm1268)、干酪乳桿菌(l.casei；bcrc10358或iam1045、bcrc10697或atcc393、bcrc11197或nrrl1445、bcrc12272或cscc2607、和/或bcrc14025或atcc27139)、乳桿菌屬(lactobacillussp.；bcrc12945、bcrc14018或ifo14511、bcrc14031或atcc33222、bcrc14040或atcc27305、bcrc14044或ifo3914、bcrc14045或atcc27306、bcrc14061或atcc8291、和/或bcrc17003或atcc14435)及上述的任意組合所組成的。

依據本發明一實施例，上述至少一非乳桿菌屬菌株包括鏈球菌屬(streptococcusspp.)菌株和/或酵母菌屬(saccharomycesspp.)菌株。

依據本發明一實施例，上述鏈球菌屬菌株包括嗜熱鏈球菌(streptococcussalivariussubsp.thermophilus；bcrc12257或cscc2012、bcrc12268或cscc2002、bcrc12307或ncdo1409、bcrc13869或atcc19258、bcrc14017或atcc14485、bcrc14308和/或bcrc14085)。

依據本發明一實施例，上述酵母菌屬菌株包括啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae；bcrc20262、bcrc20263、bcrc20270或atcc2345、bcrc20271或atcc26602、bcrc20405或atcc26603、bcrc20496或atcc28683、bcrc20497或atcc28684、bcrc20498或atcc28685、和/或bcrc21680或cbs5816)。

依據本發明一實施例，上述發酵菌株于植物性培養基的接種量可例如為3重量百分比至5重量百分比。

依據本發明一實施例，上述植物性培養基包含大豆、芝麻、薏苡、蔗糖、氯化鈉及水。

依據本發明一實施例，上述植物性培養基包含1.0至10.0重量百分比的大豆、1.0至5.0重量百分比的芝麻、1.0至5.0重量百分比的薏苡、1.0至5.0重量百分比的蔗糖以及0.1至2.0重量百分比的氯化鈉。

依據本發明一實施例，上述植物性培養基包含1.0至6.0重量百分比的大豆、1.0至3.0重量百分比的芝麻、1.0至3.0重量百分比的薏苡、2至5重量百分比的蔗糖以及0.2至1.0重量百分比的氯化鈉。

根據本發明的另一方面，提出一種透明質酸酶抑制劑用于制備具有抑制透明質酸酶的口服組合物，其是以上述的透明質酸酶抑制劑作為有效成分。

根據本發明的又一方面，提出一種皮膚外用組合物，其包含上述的透明質酸酶抑制劑，其是以上述的透明質酸酶抑制劑作為有效成分。

根據本發明的再一方面，提出一種透明質酸酶抑制劑用于制備具有抑制透明質酸酶的醫藥組合物，其是以上述的透明質酸酶抑制劑作為有效成分。

應用本發明的透明質酸酶抑制劑，其包含來源于共生發酵生成物，且此來源于共生發酵生成物為于植物性培養基利用多種發酵菌株經共生發酵步驟以及固液分離步驟而得，所得的透明質酸酶抑制劑具有抑制透明質酸酶的活性，可應用于皮膚外用組合物、制備具有抑制透明質酸酶的口服組合物或醫藥組合物。

附圖說明

為使本發明的上述和其他目的、特征、優點與實施例能更明顯易懂，提供附圖，所述附圖的詳細說明如下：

圖1繪示根據本發明實施例1的實驗例、比較例1及比較例2所得的共生發酵生成物的hplc圖譜。

圖2a至圖2c示出根據本發明濃度1.0～10％的實施例1的實驗例(圖2a)、比較例1(圖2b)及比較例2(圖2c)的共生發酵生成物與3t3纖維母細胞共培養后，透明質酸酶的透明質酸酶譜膠體照片。

具體實施方式

承前所述，本發明提供一種來源于共生發酵生成物的透明質酸酶抑制劑，其包含來源于共生發酵生成物，且此共生發酵生成物為于植物性培養基利用多種發酵菌株經共生發酵步驟以及固液分離步驟而得。

展開講，本發明此處所稱的「共生發酵生成物」是指在體外將各種不同菌株，培養于發酵基質中進行共生發酵，再經固液分離等處理所得的生成物，其中包含菌體殘留成分、代謝物質等。

在一實施例中，前述共生發酵生成物可例如于植物性培養基，以多種發酵菌株接種后，經共生發酵步驟以及固液分離步驟而得。在此說明的是，并非共生發酵生成物當然就具有抑制透明質酸酶活性，需經實驗證實才能確認。

在一實施例中，上述植物性培養基可包含例如大豆、芝麻、薏苡、蔗糖、氯化鈉及水。在一例示中，上述植物性培養基可包含1.0至10.0重量百分比的大豆、1.0至5.0重量百分比的芝麻、1.0至5.0重量百分比的薏苡、1.0至5.0重量百分比的蔗糖以及0.1至2.0重量百分比的氯化鈉，其余量為水。在另一例示中，上述植物性培養基可包含1.0至6.0重量百分比的大豆、1.0至3.0重量百分比的芝麻、1.0至3.0重量百分比的薏苡、2至5重量百分比的蔗糖以及0.2至1.0重量百分比的氯化鈉，其余量為水。

在此說明的是，倘若植物性培養基的各成分的使用量在上述范圍之外，則未經實驗證實，無法預期能獲得具有抑制透明質酸酶活性的共生發酵生成物。

在一實施例中，上述發酵菌株選自于由多種乳酸菌菌株以及至少一非乳桿菌屬菌株所組成的組中的至少8者。在一例示中，上述發酵菌株于植物性培養基的接種量可例如為3重量百分比至5重量百分比。

依據本發明一實施例，上述乳酸菌菌株可包括但不限于多種雙歧桿菌屬(bifidobacteriumspp.)菌株和/或乳桿菌屬(lactobacillusspp.)菌株。

在上述實施例中，雙歧桿菌屬可例如選自于由青春雙歧桿菌(b.adolescentis；bcrc14606或atcc15703、bcrc14607或atcc15704、bcrc14608或atcc15705、bcrc14658或dsm20087、和/或bcrc80247或atcc15706)、兩叉雙歧桿菌(b.bifidum；bcrc11844或dsm20082、bcrc11845或atcc29521、bcrc14613或atcc11863、bcrc14614或atcc15696、bcrc14615或atcc29521、bcrc14630或atcc35914、和/或bcrc14670或dsm20215)、短雙歧桿菌(b.breve；bcrc11846或atcc15700、bcrc12584或cscc1900、bcrc14601或atcc15698、和/或bcrc14612或ncdo1456)、長雙歧桿菌(b.longum；bcrc11847或atcc15707、bcrc12585或cscc1901、bcrc14602或atcc15697、bcrc14634或atcc15708、和/或bcrc14664或dsm20097)及上述的任意組合所組成的。

在上述實施例中，乳桿菌屬菌株可例如選自于由德氏乳桿菌保加利亞亞種(l.delbrueckiisubsp.bulgaricus；bcrc10696或atcc15703、bcrc12297或ncdo970、bcrc14007或ncdo2074、bcrc14008或ncdo2394、bcrc14010或ncdo2487、bcrc14069或cscc2505、和/或bcrc14071)、瑞士乳桿菌(l.helveticus；bcrc11052或iam12090、bcrc12258或atcc10386、bcrc12259或atcc12046、bcrc12296或ncdo1844、bcrc12936或atcc15009、bcrc14021或ifo3809、bcrc14026或atcc521)、鼠李糖乳桿菌(l.rhamnosus；bcrc10940或atcc7469、bcrc11673或atcc9595、bcrc12249或cscc2602、bcrc14027或atcc14957、bcrc14029或atcc21052、bcrc14068或cscc2608、bcrc16000或atcc53103、和/或bcrc16095或ncimb8824)、乳桿菌副干酪亞種(l.paracaseisubsp.paracasei；bcrc12188或atcc27216、bcrc12193或atcc25598、bcrc12248或atcc25302、bcrc14001或atcc335、bcrc14023或atcc27092、bcrc16100或atcc11582、bcrc17002或atcc334、bcrc17005或atcc11578、和/或bcrc17475或iam10074)、短乳桿菌(l.brevis；bcrc10361或atcc8287、bcrc11196或nrrl1834、bcrc12187或atcc14869、bcrc12310或atcc367、和/或bcrc14060或dsm1268)、干酪乳桿菌(l.casei；bcrc10358或iam1045、bcrc10697或atcc393、bcrc11197或nrrl1445、bcrc12272或cscc2607、和/或bcrc14025或atcc27139)、乳桿菌屬(lactobacillussp.；bcrc12945、bcrc14018或ifo14511、bcrc14031或atcc33222、bcrc14040或atcc27305、bcrc14044或ifo3914、bcrc14045或atcc27306、bcrc14061或atcc8291、和/或bcrc17003或atcc14435)及上述的任意組合所組成的。

在上述實施例中，至少一非乳桿菌屬菌株可包括例如鏈球菌屬(streptococcusspp.)菌株和/或酵母菌屬(saccharomycesspp.)菌株。

在上述實施例中，鏈球菌屬菌株包括嗜熱鏈球菌(streptococcussalivariussubsp.thermophilus；bcrc12257或cscc2012、bcrc12268或cscc2002、bcrc12307或ncdo1409、bcrc13869或atcc19258、bcrc14017或atcc14485、bcrc14308和/或bcrc14085)。

在上述實施例中，酵母菌屬菌株包括啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae；bcrc20262、bcrc20263、bcrc20270或atcc2345、bcrc20271或atcc26602、bcrc20405或atcc26603、bcrc20496或atcc28683、bcrc20497或atcc28684、bcrc20498或atcc28685、和/或bcrc21680或cbs5816)。

上述atcc代表美國典型培養物保藏中心(americantypeculturecollection；atcc)，bcrc代表中國臺灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter；bcrc)，cbs代表荷蘭皇家藝術與科學院真菌生物多樣性中心(centraalbureauvoorschimmelcultures；cbs)，dsm代表德國微生物及細胞培養保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh；dsmz)，nrrl代表美國農業研究菌種保藏中心(agriculturalresearchserviceculturecollection；nrrl)。cscc、iam、ifo、ncdo、ncimb則為非國際寄存機構(internationaldepositaryauthority；ida)，其中cscc代表澳洲食品科學聯邦科學與工業研究組織(commonwealthscientificandindustrialresearchorganisation；csiro)部的入門菌種保藏(starterculturecollection)中心，iam代表日本東京大學應用微生物研究所(instituteofappliedmicrobiology；iam)菌種保藏中心，ifo代表日本大阪酦酵研究所(instituteforfermentation；ifo)微生物保藏中心，ncdo代表荷蘭國際合作及可持續發展國家委員會(nationalcommitteeforinternationalcooperationandsustainabledevelopment；ncdo)，ncimb代表英國蘇德蘭國立工業食品及海洋微生物保藏中心(nationalcollectionofindustrialandmarinebacteria；ncimb)，nrrl代表美國農業部國立農業利用研究中心(nationalcenterforagriculturalutilizationresearch)北方地區性研究實驗室(northernregionalresearchlaboratory；現改名為農業研究服務保藏中心，agriculturalresearchservice(ars)culturecollection)。

在一實施例中，前述共生發酵步驟可例如于37℃下進行70小時至100小時，然以于37℃下進行72小時至96小時為較佳，以獲得發酵產物。在另一例示中，固液分離步驟可例如過濾步驟或離心步驟，除去發酵產物的固形物，以獲得共生發酵生成物。

在其他實施例中，上述共生發酵步驟以及固液分離步驟之間，更可選擇性進行終止發酵步驟。在一例示中，前述終止發酵步驟可例如在90℃下進行15分鐘。

在一實施例中，上述所得的共生發酵生成物可選擇性進行公知的后處理步驟，例如濃縮步驟、脫色步驟和/或微生物檢測步驟，端視實際需求而定。

上述所得的共生發酵生成物經體外活性試驗評估后，證實具有抑制透明質酸酶活性，故可進一步應用于各種劑型的組合物。適合的組合物可包括但不限于口服組合物、皮膚外用組合物和/或醫藥組合物。在一實施例中，上述的共生發酵生成物的口服組合物、皮膚外用組合物和/或醫藥組合物是以共生發酵生成物為有效成分，使上述劑型的組合物具有抑制透明質酸酶的活性。在此說明的是，一般而言，目前已知天然來源產物中具有抑制透明質酸酶活性者，其抑制活性的程度都有劑量及時間依存(dose-andtime-dependent)相關性。然而，本發明上述所得的共生發酵生成物在作為透明質酸酶抑制劑時，具有良好的水溶性，不具有劑量依存相關的細胞毒性，更可于無劑量及時間依存表現下完全抑制透明質酸酶酶活性，因此可提供生物安全性高、穩定、生體吸收性佳且有效的透明質酸酶抑制劑。

以下利用數個實施例以說明本發明的應用，然其并非用以限定本發明，本發明技術領域中普通技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，可作各種修改與改變。

實施例1：制備共生發酵生成物

1.配制植物性培養基

首先，根據表1配制實施例、比較例1至2的植物性培養基。

表1

在進行發酵前，表1所列的植物性培養基可先利用公知的高壓蒸氣滅菌法進行滅菌，其滅菌的工藝條件可例如在121℃下進行40分鐘。然后，將至少8種不同的發酵菌株分別接種至于表1的植物性培養基中，其中發酵菌株于植物性培養基的總接種量可為3％(w/v)至5％(w/v)。

在此實施例中，前述發酵菌株包括青春雙歧桿菌(b.adolescentis；bcrc14606或atcc15703、和/或bcrc14658或dsm20087)、兩叉雙歧桿菌(b.bifidum；bcrc11845或atcc29521、和/或bcrc14615或atcc29521)、短雙歧桿菌(b.breve；bcrc11846或atcc15700、和/或bcrc14612或ncdo1456)、長雙歧桿菌(b.longum；bcrc12585或cscc1901、和/或bcrc14602或atcc15697)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(l.delbrueckiisubsp.bulgaricus；bcrc10696或atcc15703、和/或bcrc14008或ncdo2394)、瑞士乳桿菌(l.helveticus；bcrc12936或atcc15009、和/或bcrc14026或atcc521)、鼠李糖乳桿菌(l.rhamnosus；bcrc14068或cscc2608、和/或bcrc16000)、乳桿菌副干酪亞種(l.paracaseisubsp.paracasei；bcrc14023或atcc27092、和/或bcrc17475或iam10074)、短乳桿菌(l.brevis；bcrc11196或nrrl1834、和/或bcrc12187或atcc14869)、干酪乳桿菌(l.casei；bcrc10697或atcc393、和/或bcrc11197或nrrl1445)、乳桿菌屬(lactobacillussp.；bcrc14061或atcc8291、和/或bcrc17003或atcc14435)、嗜熱鏈球菌(streptococcussalivariussubsp.thermophilus；bcrc12257或cscc2012、和/或bcrc13869或atcc19258)以及啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae；bcrc20262和/或bcrc21680或cbs5816)。上述同種但不同保藏編號的菌株，各選擇一種菌株與其他不同種的菌株混合使用。

接下來，上述接種后的植物性培養基進行共生發酵步驟，其是于37℃下進行72小時至96小時。所得的共生發酵生成物在終止發酵步驟以及固液分離步驟后，即獲得所得的共生發酵生成物并進行后續評估。

實施例2：利用高效液相層析評估共生發酵生成物

1.共生發酵生成物的分析產物萃取

實施例1的實驗例、比較例1及比較例2所得的共生發酵生成物先分別以50％乙酸乙酯萃取，再以多層(例如6層)紗布過濾后的濾液，于45℃下烘干6小時，以獲得共生發酵生成物測試樣品的萃取產物，取1mg樣品，以2mldmso回溶，以進行高效液相層析(hplc)分析。

2.共生發酵生成物測試樣品萃取產物的分析方法

hplc分析條件如下，其結果如圖1所示：

(i)分析管柱：cosmosilc18；

(ii)uv-vis檢測器：hitachil-7420；

(iii)檢測波長：243nm；

(iv)移動相：洗提液a：甲醇/醋酸(100/0.5)；

(v)洗提液b：甲醇/水/醋酸(80/20/0.5)；

(vi)梯度洗提的條件：甲醇濃度在0至15分鐘內從80％線性遞增至84％，在15至30分鐘內再遞增至86％，在30至40分鐘內再遞增至88％，在0至50分鐘內再遞增至94％，在50至70分鐘內再遞增至100％；

(vii)流速：0.7ml/min。

參閱圖1，其繪示實施例1的實驗例、比較例1及比較例2所得的共生發酵生成物的hplc圖譜。由圖1的結果可知，不同的植物性培養基經共生發酵等步驟處理后，其峰值分布(peakpattern)亦有所不同。實驗組1的共生發酵生成物出現的峰值分布(peakpattern)可作為參考，并作為未來生產共生發酵生成物的品管標準。

實施例3：評估共生發酵生成物抑制透明質酸酶的活性(即抗過敏活性分析)

1.細胞培養

首先，將老鼠3t3纖維母細胞(mouse3t3fibroblasts；bcrc60071)培養于含10％胎牛血清(fetalcalfserum,hyclone)及2.5％小牛血清(bovinecalfserum,hyclone)的dulbecco’smodifiedeagle’smedium(dmem)培養基并加入3.7％(w/v)的碳酸氫鈉，0.03％(w/v)的谷氨酸(l-glutamine)，每毫升含100單位的青霉素(penicillin)及100毫克的鏈霉素(streptomycin)等抗生素，在37℃、10％co2培養箱培養，一般以1×10⁶個細胞的細胞密度接種于75cm²的培養皿，每三至四天進行繼代培養并換以新鮮培養基。之后，取約第十代的3t3細胞，進行不同濃度的共生發酵生成物的細胞實驗。

2.透明質酸酶活性抑制分析方法(透明質酸酶譜分析；hyaluronan-basedzymography)

將3t3老鼠纖維母細胞(mouse3t3fibroblasts；bcrc60071)與實施例1的實驗例、比較例1至2的共生發酵生成物共培養，或不與前述共生發酵生成物(對照組)共培養。培養1或2天(24或48小時)后，取各組的細胞培養液，配制含有玻尿酸的電泳膠片(包括stackinggel及separatinggel)，再進行蛋白質電泳分析，其中蛋白質電泳的條件應為本發明所屬技術領域中普通技術人員所熟知，在此不另贅述。待電泳結束后，將電泳槽中的膠片取出，浸泡于清洗緩沖溶液(washingbuffer)中，于室溫震蕩清洗1小時后，移除清洗緩沖溶液，再加入反應緩沖溶液(reactionbuffer)中，于37℃水浴中震蕩反應16小時。反應完畢后，將膠片取出，浸泡于0.5％的阿爾辛藍染液(alcianbluesolution)中震蕩染色2小時后，再浸泡于褪染緩沖溶液(destainingbuffer)中，褪染約1至2小時至條帶清晰可見為止。之后，再以玻璃紙封片固定于壓克力板上，放置室溫下自然風干，即完成共生發酵生成物測試樣品萃取產物對于透明質酸酶活性影響的分析步驟，其結果如圖2a至圖2c。

參閱圖2a至2c，其示出根據本發明濃度1.0～10％的實施例1的實驗例(圖2a)、比較例1(圖2b)及比較例2(圖2c)的共生發酵生成物與3t3纖維母細胞共培養后，透明質酸酶的透明質酸酶譜膠體照片。在圖2a至2c中，第m道代表蛋白質標記，第c0、c24、c48道分別顯示未經處理的3t3老鼠纖維母細胞經0、24、48小時培養后的透明質酸酶活性。

由圖2a至圖2c的結果可知，本發明實施例1的實驗例(圖2a)的共生發酵生成物在1.0～10％的濃度(處理24小時)對于玻尿酸酶活性均具有強大的抑制作用，而且無劑量依存關系。在此說明的是，圖2a不僅顯示實施例1的實驗例的共生發酵生成物在體外以低劑量(1.0％)的實驗例(圖2a)的共生發酵生成物，于24小時內可完全抑制透明質酸酶活性，在1.0～10％的濃度皆可明顯抑制對玻尿酸酶活性，且其抑制作用在1.0～10％的濃度之間不具有劑量相關性。相較于其他已知具有劑量及時間相關性的天然來源產物的透明質酸酶抑制劑，本發明實驗例的共生發酵生成物對玻尿酸酶的抑制作用顯然是更加有效的。至于比較例1(圖2b)的共生發酵生成物在10％以內的濃度(處理48小時)對于透明質酸酶的酵素活性沒有任何的抑制作用，不具有保護玻尿酸的作用。比較例2(圖2c)的共生發酵生成物在10.0％的濃度(處理24小時)以及在1.0％的濃度(處理48小時)對于玻尿酸酶活性才具有較有效的抑制作用(甚至完全的活性抑制)，但抑制效果遠不及實驗例(圖2a)。

由于實施例1的實驗例的共生發酵生成物可明顯抑制透明質酸酶的活性，具有保護玻尿酸的較佳作用，也就是具有推遲玻尿酸因老化因素而被透明質酸酶破壞的能力，可作為有效成分并應用于皮膚外用組合物，例如化妝品組合物。

其次，實施例1的實驗例的共生發酵生成物根據中國臺灣公告的健康食品安全性評估方法，以低劑量(3.5g/kg體重/天)、中劑量(7g/kg體重/天)及高劑量(11.67g/kg體重/天)的劑量，利用胃管經口投予試驗動物(雄、雌大鼠，至少為三重復的數據)，進行28天亞慢性毒性試驗，并未造成死亡現象以及不良臨床征兆。每日體重增加量及飲水、飼料消耗量、形態、行為活動力及器官組織重量未產生與劑量相關的顯著變化。血液分析及生化指針檢測的結果顯示喂食實施例1的實驗例的共生發酵生成物與比較例或對照組間無明顯差異，證實無明顯亞慢性毒性，符合食品安全性的標準(圖未繪示)，并推估實施例1的實驗例的共生發酵生成物的未觀察到不良影響反應劑量(no-observed-adverse-effect-level；noael)為11.67g/kg/天。

既然實施例1的實驗例的共生發酵生成物能明顯抑制透明質酸酶的活性，又符合食品安全性的標準，可作為有效成分，并應用于制備具有抑制透明質酸酶活性的口服組合物和/或醫藥組合物。

綜言之，由上述數個實施例證實，本發明來源于共生發酵生成物的透明質酸酶抑制劑，成功利用多種發酵菌株經共生發酵步驟以及固液分離步驟制得，且所得的共生發酵生成物確實具有抑制透明質酸酶的活性，亦可進一步抑制過敏、發炎、退化性關節炎，可應用于皮膚外用組合物、制備具有抑制透明質酸酶的口服組合物或醫藥組合物。

需補充的是，本發明雖以特定的工藝、特定的分析方法或特定儀器作為例示，說明本發明的具有抑制透明質酸酶活性的共生發酵生成物及其應用，惟本發明所屬技術領域中任何普通技術人員可知，本發明并不限于此，在不脫離本發明的精神和范圍內，本發明的具有抑制透明質酸酶活性的共生發酵生成物亦可使用其他工藝、其他的分析方法或其他儀器進行。

由上述實施例可知，本發明的來源于共生發酵生成物的透明質酸酶抑制劑及其應用，其優點在于利用多種發酵菌株經共生發酵步驟以及固液分離步驟而得，所得的共生發酵生成物具有抑制透明質酸酶的活性，可應用于皮膚外用組合物、制備具有抑制透明質酸酶的口服組合物或醫藥組合物。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其并非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何普通技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，可作各種修改與改變，因此本發明的保護范圍視所附權利要求書所界定為準。