本發明涉及重組人血管內皮抑制素藥物組合物技術領域。
背景技術：
20世紀60年代，美國哈佛醫學院的folkman博士提出“腫瘤生長依賴血管生長”這一假設，即血管生成在實體瘤生長和轉移過程中起著重要的作用，并于1971年提出“餓死腫瘤療法”理論。為了刺激血管的生成，腫瘤細胞會上調一系列血管生成因子，同時也會產生一些血管生成抑制因子。組織中血管生成表型的開放與關閉將取決于組織局部區域血管生成刺激因子和抑制因子之間的動態平衡(folkman，j.nat.med.1:27-31,1995；hanahan,d.,etal.cell.86:353-364,1996)。研究發現內源性的血管生成抑制因子，如血管緊張素(angiostatin)，血管內皮抑制素(endostatin)等，均能夠抑制小鼠體內腫瘤的生長(o’relly，m.s.,etal.cell.88:277-285,1997)。
血管內皮抑制素(endostatin)是o’relly于1997年從小鼠內皮細胞系eomad的培養液中分離得到的一種具有抑制血管內皮細胞作用的物質(o’relly，m.s.,etal.cell.88:299-285,1997)。氨基酸序列分析該物質為膠原蛋白xviii的羧基末端的降解片段，分子量為20kd左右。
重組人血管內皮抑制素(rhendosratin)與重組鼠血管內皮抑制素在氨基酸序列上有85％的同源性。1996年美國entremed公司采用酵母作為表達體系生產了重組人血管內皮抑制素。以重組dna技術生產，以大腸桿菌為表達系統，表達出的重組人血管內皮抑制素與先前的endostatin相比較，表達水平更高，療效更強，并且沒有因為附加n端序列而導致體內免疫原性。
但是利用傳統的大腸桿菌表達方法得到的重組人血管內皮抑制素難以復性并且易于形成沉淀，而用巴斯德畢赤酵母表達系統所耗費的生產成本巨大，兩種方法均未能解決將重組人血管內皮抑制素進行工業生產的問題。為此研究人員通過修飾人血管內皮抑制素的核苷酸編碼序列，生產出n末端帶有附件氨基酸序列的重組人血管內皮抑制素(rhendostatin,商品名
mggshhhhhhshrdfqpvlhlvalnsplsggmrgirgadfqcfqqaravglagtfraflssrlqdlysivrradraavpivnlkdellfpswealfsgsegplkpgarifsfdgkdvlrhptwpqksvwhgsdpngrrltesycetwrteapsatgqassllggrllgqsaaschhayivlciensfmtask
一般來說，目前進入臨床研究的重組人血管內皮抑制素均使用靜脈給藥，或者皮下注射給藥。以目前市場銷售的恩度注射液為例，其規格為15mg/3ml/支，臨床使用時將本品加入250～500ml生理鹽水中，勻速靜脈點滴，滴注時間3～4小時。本品在與np化療方案聯合給藥時，在治療周期的第1～14日，每天給藥一次，連續給藥14天，休息一周，再繼續下一治療周期。通常可進行2～4個治療周期。
鑒于重組人血管內皮抑制素在抗腫瘤藥物領域中的重要作用，對于研究穩定性更優越的重組人血管內皮抑制素藥物組合物是非常必要的。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種具有良好穩定性的重組人血管內皮抑制素藥物組合物，該藥物組合物由重組人血管內皮抑制素、醋酸-醋酸鈉緩沖液組成。
所述組合物的ph值為5.0-6.5、優選5.0-6.0、5.0-5.5，更優選為5.5±0.2
所述組合物中的醋酸鈉濃度為優選為30-180mm，更優選為30mm，60.mm，120mm，180mm。
所述組合物中的重組人血管內皮抑制素的濃度優選為2.0-10.0mg/ml優選2.0-6.0mg/ml，更優選為4.0mg/ml或5.0mg/ml。
所述組合物中的重組人血管內皮抑制素為rhendostatin(恩度，endostar)。本發明所述的是基因重組蛋白質類藥物，通過對其物理化學性質、化學穩定性和生物學穩定性的初步測定，來作為制定處方的依據。經測定，rhendostatin堿性氨基酸占16.6％酸性氨基酸占7.8％，理論等電點為9.3，實測為9.1，偏堿性。
所述的組合物可以加入其它藥學上可接受的藥物輔料進一步制備成為注射液，也可進一步制備成為凍干粉針以供臨床需要。
本發明所述的組合物具有良好的穩定性，特別的，對于多聚體而言，可以很好的控制其作為雜質的產生。
具體實施方式
實施例1緩沖體系的篩選
人體ph值為7.4，一般要求注射液ph值在4—9之間。另外，為確保成品在貯藏期內藥液質量穩定，需確定藥液合理的ph值范圍，本發明人分別用10mm檸檬酸鈉—檸檬酸緩沖體系、30mm醋酸鈉緩沖體系，用naoh、hcl調節ph為6.0—6.5、5.0—5.5，rhendostatin含量為5.0mg/ml，灌封于西林瓶中2—8℃貯藏三個月，考察本品的澄明度、含量、純度等指標，試驗結果見表1。
表1不同緩沖體系對rhendostatin制劑質量的影響
表1中各項指標的檢測方法均參照如下：非還原型sds-page電泳法按照《中國藥典》進行；hplc法的色譜柱為c18反相柱，以0.1％三氟乙酸的水溶液為流動相a液，以0.1％三氟乙酸的乙腈容易為流動相b液，梯度洗脫24min(a液從64％-40％，b液從36％-60％)，流速為1.3ml/min，檢測波長為214nm。
根據表1可見在ph5.0—6.5范圍內兩種緩沖體系下,rhendostatin穩定性均好，但在加速試驗時，37℃下檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系第十天時蛋白均出現沉淀，而醋酸鈉則無沉淀產生(試驗結果見表2)。
rhendostatin具有肝素親和區，在ph5.5的條件下帶有大量正電荷易于和帶負電的離子結合，醋酸鈉的pka為4.75，在ph5.5的條件下，大多數帶負電，能和rhendostatin形成鹽鍵從而穩定rhendostatin。因而本發明可選用ph5.0—6.0的醋酸鈉緩沖體系。
表2.37℃下rhendostatin穩定性試驗
實施例2醋酸鈉濃度對rhendostatin的影響試驗
確定選用醋酸鈉緩沖體系后需研究濃度對rhendostatin穩定性的影響，因為理論上，離子強度對蛋白質的穩定性有影響。因而選用了5種醋酸鈉濃度做45℃加速試驗研究rhendostatin多聚體形成速度與濃度之間的關系。醋酸鈉濃度依次為10mm，30mm，60mm，120mm，180mm；rhendostatin濃度為4.0mg/ml每支2ml，45℃水浴中加速試驗(試驗結果見表3)，在1小時，2小時，4小時末取樣做非還原sds-page檢測多聚體量，電泳結果經kodak120凝膠成相儀分析，結果表明，隨醋酸鈉濃度的增加多聚體的形成速度無較大差別。我們選用30mm醋酸鈉作為最終制劑用量，因為10mm的醋酸鈉不足以抗衡在加入其它輔料引起的ph改變，30mm則足以滿足要求。
表3.醋酸鈉濃度對rhendostatin的影響試驗
實施例3不同蛋白濃度制劑的穩定性
通過對rhendostatin含量為4.0mg/ml的制劑進行加速試驗考察后，發現其在醋酸鈉30mm，ph5.5體系中是穩定的；于是又在該濃度的周圍選擇了兩個蛋白濃度：2.0mg/ml，6.0mg/ml做37℃加速試驗來考察添加成分對蛋白的穩定作用是否依賴于蛋白含量，試驗結果表明，上述兩種濃度的rhendostatin制劑穩定性與4.0mg/mlrhendostatin制劑是一致的。
實施例4不同劑型的比較試驗
在rhendostatin醋酸鈉30mmph5.5體系中，制成凍干粉針，2～8℃保存3個月，測定各項指標，并與注射液進行比較，結果基本一致。
以上試驗結果表明，rhendostatin在30mm醋酸鈉ph5.5體系中具有較高的穩定性。