本發明涉及一種茶皂素有效部位的制備方法和其抗家畜病毒的新用途，具體涉及一種茶皂素有效部位預防或治療家畜病毒性感染疾病的應用，屬于藥物化學領域。
背景技術：
：：目前豬、雞等家畜養殖是我國廣大農民致富的主要途徑，但豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(prrsv)、偽狂犬病毒(prv)等是造成妊娠母豬的繁殖障礙和仔豬夭折等多種家畜致病的重要原因，具有較高的發病率和死亡率。然而，有效抑制病毒感染和降低病毒致死率方面的藥物比較少，研制出新型、有效、安全的具有預防和治療家畜病毒感染性疾病功能療效的藥物具有重大意義。茶皂素(teasaponia)是油茶籽餅中提取的一種五環三萜類化合物。隨著茶皂素的應用研究工作不斷深入，茶皂素在日用化工、輕紡、及醫藥行業中的應用亦愈來愈廣泛。特別是近年來的藥理活性研究發現，茶皂素具有殺滅病毒、抗菌消炎、抗氧化、抗高血壓、抑制酒精吸收保護腸胃、以及殺蟲驅蟲等藥理學功能。但油茶籽餅中茶皂素類成分極性大，易溶于水，從水溶液中富集困難，且其抗家畜病毒的文獻鮮有報道，本發明提供了一種茶皂素有效部位的制備方法和其抗家畜病毒的新用途。技術實現要素：本發明的一個目的在于提供一種利用膽甾醇或谷甾醇沉淀法精制茶皂素類成分的制備方法。本發明的另一個目的在于提供一種預防和治療家畜病毒性感染疾病的藥物組合物。本發明的目的是通過如下技術方案實現的：油茶籽餅6-10倍量水煎煮提取后，提取液通過d型大孔吸附脂柱，依次用不同比例的乙醇-水溶劑梯度洗脫，將20％乙醇以下的洗脫部位減壓濃縮至干，殘渣用適量乙醇水溶解，加入膽甾醇或谷甾醇的乙醇溶液至不再析出沉淀。沉淀用丙酮混懸，抽濾，濾餅用少量丙酮潤洗后，干燥得到茶皂素有效部位。上述水洗脫液減壓蒸干后，殘渣用適量乙醇水溶解，乙醇溶度為1％～95％。上述水洗脫液減壓蒸干后，殘渣用適量乙醇水溶解后，殘渣濃度為：1mg/ml～100mg/ml。上述殘渣用乙醇水溶解后，加入的膽甾醇或谷甾醇乙醇溶液濃度為：1mg/ml～40mg/ml。進一步，所述應用為預防或治療家畜病毒性感染疾病。進一步，所述抗病毒性感染疾病的病原微生物主要包括豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(prrsv)和偽狂犬病毒(prv)等。本發明還提供一種預防或治療家畜病毒性感染疾病的藥物組合物，該組合物包括茶皂素有效部位或其鹽以及藥學上可接受的輔料。進一步，所述抗病毒藥為利巴韋林、拉米夫定、阿昔洛韋、阿德福韋酯、奧司他韋、或奈非那韋中的任一一種或幾種。本發明進一步提供一種具有抗病毒作用的藥劑盒，該藥劑盒由治療有效量的茶皂素有效部位及常規抗病毒藥組成。所述常規抗病毒藥為利巴韋林、拉米夫定、阿昔洛韋、阿德福韋酯、奧司他韋、或奈非那韋等臨床常用一線、二線抗病毒藥物。本發明所述“藥學上可接受”指用于家畜時生理上可耐受且通常不產生過敏或類似不良反應的分子實體和組合物。所述“治療有效量”指用藥劑量足以引起宿主中臨床顯著病癥/癥狀的改善。具體實施方式本發明以下將結合實施例作進一步詳述，但并不限制本發明。制備實施例1茶皂素有效部位的制備按重量比取油茶籽餅10份加入到80份水中，倒入容器中浸泡30分鐘，煎煮提取40分鐘，過濾后得到茶皂素水煎提取液；將提取液通過d型大孔吸附樹脂柱(d型大孔吸附樹脂先用丙酮處理后裝柱)，用90％乙醇、60％乙醇、40％乙醇和水梯度洗脫，收集水洗脫部位，減壓濃縮至干，得殘渣。取上述殘渣100g，溶于50ml70％乙醇，攪拌下加入10mg/ml膽甾醇的乙醇溶液，至不在有絮狀沉淀產生，靜置抽濾，濾餅適量蒸餾水洗，干燥。取干燥物混懸于適量丙酮中，抽濾，濾餅用少量丙酮潤洗，干燥后得到淡褐色粉末64.9g，即為茶皂素有效部位。制備實施例2茶皂素有效部位的制備按重量比取油茶籽餅10份加入到80份水中，倒入容器中浸泡30分鐘，煎煮提取40分鐘，過濾后得到茶皂素水煎提取液；將提取液通過d型大孔吸附樹脂柱(d型大孔吸附樹脂先用丙酮處理后裝柱)，用90％乙醇、60％乙醇、40％乙醇和水梯度洗脫，收集水洗脫部位，減壓濃縮至干，得殘渣。取上述殘渣100g，溶于50ml70％乙醇，攪拌下加入10mg/ml谷甾醇的乙醇溶液，至不在有絮狀沉淀產生，靜置抽濾，濾餅適量蒸餾水洗，干燥。取干燥物混懸于適量丙酮中，抽濾，濾餅用少量丙酮潤洗，干燥后得到淡褐色粉末64.9g，即為茶皂素有效部位。效果實施例一茶皂素有效部位抗prrsv病毒活性研究1儀器與材料1.1病毒來源prrsv病毒由高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征活疫苗1.2試驗藥物實驗藥物：茶皂素有效部位對照藥物：利巴韋林1.3儀器thermo3111型co2培養箱；hfsafe生物安全柜；multiskango酶標儀；京立牌ld5-2b型臺式低速離心機；olympusix71倒置熒光顯微鏡改良型；rpmi-1640培養基、胎牛血清、馬血清、0.25％胰蛋白酶溶液、噻唑藍、磷酸鹽緩沖液(賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司)；amresco二甲基亞砜(dmso)。marc-145細胞衍生于非洲綠猴腎細胞，購于中國獸醫藥品監察所。2方法2.1細胞傳代培養marc-145細胞于37℃、5％co2環境中生長，3-4天后，待細胞長至瓶底面積的90％以上，即可繼續傳代培養；新復蘇的細胞連續傳代3次以上才可接種到細胞培養板中進行后續試驗。2.2細胞培養板模型建立marc-145細胞密度為2×104個/ml，按試驗要求接種到96孔板中，每孔100μl細胞懸液；接種于6孔板中，每孔2ml；接種到384孔板中，每孔20μl；在37℃、5％co2環境培養，待孔內細胞生長達到底壁90％以上備用。2.3prrsv來源高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒活疫苗(jxai-r株)，生產批號為1012001，由廣東大華農動物保健品股份有限公司提供。2.3.1prrsv擴增待marc-145細胞培養至單層后，取適量稀釋好的病毒液接種到單層細胞上(25cm2細胞培養瓶內約加入2ml)，輕輕轉動培養瓶使病毒液完全覆蓋住細胞單層。培養2.5h后，棄掉病毒液，pbs沖洗3次，加入2％細胞維持液繼續培養，細胞病變率達到80-90％時收集病毒液。2.3.2prrsv收獲把病變細胞在-20℃和4℃間反復凍融3次，3000rpm離心細胞培養液30min，收集上清液，經0.22μm微孔濾膜除菌，分裝到凍存管內，-80℃過夜，之后轉入液氮長期保存。2.4試驗方法2.4.1prrsv毒力測定marc-145細胞消化后，將細胞密度調至2×105/ml后接種到96孔板內，每孔100μl，置于37℃5％co2培養箱中培養。待細胞長至單層，每孔分別接種10-1-10-9100μl病毒液，每個滴度重復8次，繼續培養120h。每天觀察并記錄細胞的病變效應(cytopathiceffect，cpe)和病毒的半數感染量(tissuecultureinfectivedose，tcid50)，按照reed-muench公式計算。2.4.2藥物的細胞毒性測定首先將供試藥品溶于1％的dmso中，配置成dmso儲備液用于后續試驗。移液槍吸取4μl1％的供試藥品儲備液放入1.5ep管內，加入396μl細胞維持液，倍比稀釋8個梯度，分別加入長成單層的marc-145細胞96孔培養板上，100μl/孔，每個濃度梯度重復3次，同時設置細胞對照組(只加100μl/孔細胞維持液)。置于5％co2培養箱37℃共孵育72h，棄掉孔內的液體，每孔加入20μl的mtt，培養板置于37℃環境中。4h后棄掉，每孔加入150μl的dmso，再放入37℃30min，輕輕振蕩，待顯微鏡下觀察結晶完全溶解，孔內顏色均勻后，酶標儀測490nm處的od值(設630nm為參比波長)。以細胞病變程度和所測得的od值為依據，參照公式cr＝(oda-odb)/oda×100％，a為細胞對照組，b為試驗組，計算藥物致細胞的病變率(cytopaticratio，cr)。通過graphpadprismtm軟件可得出半數安全濃度(50％cytotoxicconcentration，cc50)和最大安全濃度(maximumno-cytotoxicconcentration，mntc)。2.4.3藥物對prrsv感染細胞的抑制作用藥液倍比稀釋6個梯度，將50μl待測藥物和50μl的prrsv病毒液同時加入已長至單層的marc-145細胞上(藥液的終濃度和病毒液的終濃度分別為最大安全濃度和100tcid50)，每個濃度重復3次，同時設置細胞對照組(只加100μl2％的細胞維持液)、病毒對照組(只加100μl的100tcid50病毒液)、利巴韋林對照組(終濃度為0.125mg/ml)，置37℃5％co2的培養箱中，間隔24h顯微鏡下觀察細胞病變并記錄，待病毒對照組細胞病變達到80％-90％左右，拍攝各組照片并用mtt法在酶標儀下測得各組od值，通過公式計算得到藥物對病毒的抑制率(inhibition，ir)。通過graphpadprismtm軟件計算出半數有效濃度(50％effectiveconcentration，ec50)。篩選出藥物抑制率高于50％的做后續研究。2.4.4復制抑制試驗在已長成單層marc-145細胞的96孔板上，每孔加入100μl為100tcid50的病毒液，置37℃5％co2的培養箱中，使病毒分別吸附1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h，棄掉病毒液，pbs沖洗2遍，加入最大安全濃度的藥物，每孔100μl，每組6個重復，在37℃5％co2培養箱中繼續培養，當病毒對照組病變率達到80％-90％時，電子顯微鏡拍照并記錄每孔病變狀態，mtt測od值。2.4.5吸附抑制試驗在已長成單層marc-145細胞的96孔板上，每孔加入100μl最大安全濃度的藥物，在37℃分別加入培養15min、30min、1h、2h、4h、6h，每組重復6次，然后將板子放入4℃預冷1h，棄掉藥液，pbs沖洗2遍，于每孔在加入100μl100tcid50病毒液，4℃培養2.5h后，在將96孔板放入37℃5％co2培養箱繼續培養，眼觀病毒對照組病變率達到80％-90％時，棄液，使用mtt測od值。2.4.6直接殺滅試驗先將終濃度為最大安全濃度的藥液和100tcid50分別在37℃共孵育30min、60min、90min、120min、150min，然又將藥液加入96孔板內，每孔100μl，置37℃5％co2培養箱中繼續培養，當病毒對照組病變率高達80％-90％時，通過mtt法測定od值。2.4.7藥物對prrsv誘導的細胞凋亡的影響將20μl混合液(10μl最大安全濃度的藥物和10μl100tcid50prrsv病毒液)加入長滿單層細胞的384孔內，每組4個重復樣品。包括細胞對照組、病毒對照組、陽性對照組、不同劑量藥物組，共6組。培養48h后，預冷pbs沖洗2次，按annexinv-egfp(av)、propidiumiodide(pi)和bindingbuffer以1∶1∶100比例避光混勻，每孔加入20μl熒光液，室溫避光反應15min后，倒置熒光顯微鏡觀察細胞凋亡形態并拍照。2.4.8pcr測定目的基因2.4.8.1特異性引物的設計：選取目的基因核酸序列cds區的序列，使用primer3plus引物設計軟件設計了以下5對引物(表1)。表1引物序列及pcr產物大小table.1primersequencesandthesizeofpcrproducts2.4.8.2總rna的抽提按照trizol說明書，提取marc-145細胞模型中的rna，并用核酸濃度測定儀檢測rna的濃度和完整性。2.4.8.3rt-pcr參照takara反轉錄試劑盒說明書，構建普通pcr反應體系，并用熒光定量pcr測定目的基因。以質粒為模板，n-f、n-r為引物，實施sybrgreenrt-pcr擴增，然后用allpoints方式采集熒光新號制作出溶解曲線，繼而通過溶解曲線驗證n基因的特異性。2.4.9westernblot分析茶皂素有效部位對prrsvn蛋白的影響常規總蛋白樣品的制備，并應用sds-page電泳，檢測不同濃度茶皂素有效部位在不同時間點抑制n蛋白的表達作用。參照北京康為高靈敏度化學發光試劑盒說明書配置好發光液，將發光液均勻涂滿整張膜后，室溫孵育1-5min，然后再暗室內進行x膠片的曝光。經x光顯影機顯影、定影并成相，最后掃描膠片，保存并做處理分析。2.4.10細胞凋亡檢測茶皂素有效部位對prrsv誘導的細胞凋亡的影響：分別將10μl的不同濃度的待測茶皂素有效部位和利巴韋林與10μl的病毒液同時加入已長至單層的marc-145細胞上，在37℃5％co2培養箱中共孵育48h(病毒液和藥物的終濃度分別為100tcid50和最大安全濃度)，同時設置細胞對照組(只加20μl的2％的細胞維持液)、病毒對照組(只加20μl的100tcid50病毒液)，每組重復4次。pbs洗滌2次后，將annexinv-egfp(av)、propidiumiodide(pi)、bindingbuffer按照1∶1∶100的比例避光混勻，每孔加入20μl混合液，室溫避光反應15min后，在倒置顯微鏡下觀察細胞凋亡形態并拍照。2.4.11數據分析本試驗所有數據及其方差分析均由graphpadprismtm(graphpadsoftware，inc.california，usa)軟件計算處理得到，所有數據均以mean±sd表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。本試驗所有細胞圖片的采集均由plus6.0(mediacyberneticsinc.，usa)軟件拍攝、處理。所有試驗均經過三次獨立重復試驗，每次試驗設置4個重復。3.結果3.1藥物的細胞毒性測定結果根據cpe記錄情況和mtt法測定od值的結果計算得到細胞病變率，確定供試藥物和利巴韋林(ribavirin，rv)的最大安全濃度(maximumnoneytotoxicconcentration，mntc)和cc50(50％cytotoxicconcentrations)(見表2)。不論是從cpe的觀察記錄結果還是經mtt法測定的結果來看，樣品和陽性藥在安全范圍內對細胞的毒性作用均小于10％，認為在所測試的濃度范圍內對細胞沒有毒性作用。表2藥物的細胞毒性試驗匯總table2summaryofcytotoxicityofthedifferentdrugs注：cc50表示為mean±sd，數據由4次重復所得。所有藥物的溶解媒介均為1％dmso。note：cc50representasmean±sdoffourreplications.allthedrugsweredissolvedby1％dmso.3.2病毒毒力測定結果病毒毒力的測定結果如表3所示，prrsv在marc-145細胞上的tcid50＝10-7.39，也就是在marc-145細胞上接種病毒濃度為10-7.39的病毒液0.1ml時，可使50％的細胞受到感染。本試驗中所使用的病毒毒力均為100tcid50。表3prrsvtcid50測定結果table3theresultsofprrsvtcid503.3藥物抗病毒試驗結果結果表明(見表4)，茶皂素有效部位具有較強抑制prrsv活性的作用，明顯高于利巴韋林(63％)，茶皂素有效部位對prrsv的抑制率高達100％。就si指數而言，茶皂素有效部位的si小于利巴韋林。從量-效曲線上看，茶皂素有效部位呈劑量依賴關系，即隨著藥物濃度的降低，其對prrsv的抑制率也隨之下降。表4藥物抗病毒試驗結果table4summaryofantiviralassayofthedrugs3.4ts對病毒復制阻斷作用的試驗結果由表5可以看出，無論是prrsv感染marc-145細胞后的1h還是14h后加藥(最大安全濃度)，茶皂素有效部位均表現出較強的抗病毒作用，且各個時間點均表現出顯著差異(p＜0.05)。如表5所示，ts在各個時間點的抑制率都高于75％；感染6h-10h后，抑制率最高，達到100％；感染12h后，藥物的抑制效果開始下降。結果表明，ts對prrsv的復制有持續抑制作用。表5ts對prrsv復制阻斷作用結果table5theresultofanti-prrsvreplicationofts注：相同字母表示組與組之間差異不顯著(p＞0.05)，不同字母表示組與組間差異顯著(p＜0.05)。3.5熒光定量pcr測定結果(1)ts對prrsvn基因拷貝數的影響：prrsvn基因是最具有免疫原性的蛋白，在病毒的生命周期中起著至關重要的作用。通過熒光定量pcr方法檢測茶皂素有效部位對n基因拷貝數的影響，從而來判斷茶皂素有效部位影響prrsv復制的強弱。數據表明(見表6)，在病毒感染早期，不同組間n基因mrna水平無顯著差異(p＞0.05)；感染20-52h后，茶皂素有效部位組(30μg/ml)極其顯著地抑制了n基因的表達(p＜0.001)。表6不用時間點ts對prrsv基因拷貝數的影響fig.4theeffectoftsonngenecopiesatdifferentpoints注：相同字母表示組與組之間差異不顯著(p＞0.05)，不同字母表示組與組間差異顯著(p＜0.05)。(2)熒光定量pcr檢測pabp、pcbp1和pcbp2mrna的表達量：pabp、pcbp1和pcbp2是細胞宿主蛋白，可以影響prrsv復制。選用最佳反應體系，對病毒組和加藥組的pabp、pcbp1和pcbp2基因進行定量，通過18srna參照校正，采用2-δδct對目的基因表達量進行分析比較。結果表明，marc-145細胞感染prrsv24h后，茶皂素有效部位顯著下調pabp的表達(p＜0.001)，而對pcbp1和pcbp2基本無影響(p＞0.05)。感染48h后，藥物處理組與病毒組相比較，pabp、pcbp1和pcbp2的mrna表達量幾乎無任何改變(p＞0.05)。結果表明(見表7)，茶皂素有效部位處理組只在細胞感染病毒24h后下調pabp的表達。表7茶皂素有效部位對靶基因mrna表達量的影響table7theeffectoftsonrelativeexpressionlevelsoftargetgenes.注：相同字母表示組與組之間差異不顯著(p＞0.05)，不同字母表示組與組間差異顯著(p＜0.05)。3.6westernblot的測定結果不同濃度ts處理prrsv感染的細胞，分別在24、48和72h收集樣品，試劑盒提取總蛋白，進行sds-page電泳試驗，轉膜，一抗、二抗孵育，ecl發光試劑盒檢測蛋白條帶。圖1結果表明，ts(30μg/ml)在感染72h后，幾乎完全抑制了n蛋白的合成，且抑制率顯著高于利巴韋林(125μg/ml)。所有數據都表明，ts能夠有效抑制prrsv復制。β-actin為內參對照。通過westernblot分析prrsvn蛋白。結果表明，ts在不同時間點抑制prrsvn蛋白的表達，呈劑量依賴性。3.7藥物對prrsv吸附的測定結果無論將ts與細胞共培養15min還是360min，再感染prrsv，其對prrsv的抑制率均在65％以上，結果表明ts能夠持續阻止prrsv對marc-145細胞的吸附(見表8)。表8ts對prrsv吸附阻斷作用結果fig8theresultofanti-prrsvadsorptionoftreatedwithts注：相同字母表示組與組之間差異不顯著(p＞0.05)，不同字母表示組與組間差異顯著(p＜0.05)。3.8藥物對prrsv直接殺滅的測定結果先將ts于prrsv共孵育不同時間點(30min-150min)，在感染marc-145細胞，發現所有時間點的抑制率均在80％左右，且各時間點之間沒有顯著差異(p＞0.05)，圖2表明ts可以直接滅活prrsv，并不呈現時間依賴性。3.9藥物對prrsv誘導細胞凋亡的測定結果采用av-pi雙染試劑盒檢測了prrsv誘導的細胞凋亡。annexinv-egfp是一種帶綠色熒光的ca依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結合。碘化丙啶(propidiumiodide，pi)是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在凋亡晚期細胞和壞死細胞，pi能透過細胞膜和細胞核結合呈現紅色。從熒光顯微鏡鏡下觀察，當marc-145細胞感染prrsv48h時，與細胞對照組相比，prrsv可以誘導宿主細胞的凋亡，且晚期凋亡數量顯著增多。相同條件下觀察發現不同濃度ts并不影響正常細胞的生長，而不同濃度ts干預感染prrsv得細胞模型后，凋亡細胞數量顯著低于prrsv對照組。結果表明ts能夠抑制prrsv誘導的細胞凋亡，且效果好于利巴韋林。4.結論ts(茶皂素有效部位)在marc-145細胞上具有抗prrsv作用，且呈劑量依賴關系。其中，ts抑制率最高為100％，ts在病毒復制1-14h間抑制率均高于76％，阻斷prrsv吸附于細胞的抑制率均高于65％且對prrsv的直接滅活率高于80％。熒光定量pcr結果顯示感染病毒20h-52h后，ts可顯著抑制prrsvn基因合成(p＜0.001)，感染24h，ts處理組與病毒對照組做比較，只有pabpmrna表達量下降(p＜0.001)。westernblot結果顯示ts處理組對prrsvn蛋白表達呈抑制作用，且呈劑量依賴性。此外，ts處理組的晚期細胞凋亡量明顯低于prrsv模型對照組。ts在體外marc-145細胞模型上具有抗prrsv的作用。其抗病毒機制可能是通過直接殺滅prrsv、持續抑制prrsv復制、影響prrsv吸附以及干擾細胞凋亡來實現的。此外，ts處理組可以抑制n基因合成及其蛋白表達，下調pabpmrna的表達量，進一步解釋了其抗病毒機制。效果實施例二茶皂素有效部位抗prv(偽狂犬病毒)活性研究1儀器與材料1.1病毒來源prv病毒由高致病性偽狂犬病毒活疫苗1.2試驗藥物同效果實施事例一。1.3儀器同效果實施事例一。2方法所用細胞為vero細胞；其他實驗條件和方法均同效果實施事例一。3結果表1本發明茶皂素有效部位對prv抑制作用4結論本發明茶皂素有效部位具有一定的抗prv感染活性，但對prv抑制作用效果顯著弱于其抗prrsv活性，實驗結果表明茶皂素有效部位抗病毒活性具有一定的選擇性，提示茶皂素有效部位臨床應用中不會造成因對不同病毒起效劑量不一致而引起多種病毒感染時對其耐藥性的發生。附圖說明圖1不同濃度的ts在不同時間點抑制prrsvn蛋白的表達圖；圖2ts對prrsv直接滅活的結果圖。當前第1頁12當前第1頁12