官能化的兩性離子和混合電荷聚合物、相關的水凝膠及它們的使用方法與流程

相關申請的交叉引用

本申請要求于2014年9月9日提交的美國專利申請第62/048,155號的權益，通過引用明確地將其全部并入本文。

政府許可權利的聲明

本發明是利用國家科學基金會(thenationalsciencefoundation)授予的、根據合同號dmr1307375和cbet-1264477，以及由海軍研究局(theofficeofnavalresearch)授予的、根據合同號n00014-14-1-0090和n00014-15-1-2277的政府支持完成的。政府在本發明中享有一定的權利。

背景技術：

對于生物學和生物材料應用而言，水凝膠長期以來一直是令人感興趣的，這是因為其模擬間質組織環境的高水含量，確保高擴散滲透性，并提供仿生機械強度。特別感興趣的是peg水凝膠和聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(phema)水凝膠，因為除了水凝膠的一般特性之外，其還通常被認為是結垢少的、生物惰性的和通用的。

已發現phema水凝膠被用于并被研究用于例如尤其接觸透鏡、人工角膜、藥物遞送載體、軟骨替代物以及組織支架的應用。然而，phema的水合低于天然組織的水合，并且雖然其結垢少，但仍高于其它非結垢材料。此外，經由羥基的phema官能化通常是困難的。

常規使用peg水凝膠，并且當將其它的官能團引入peg水凝膠中時，為了體外和體內應用受控制，僅能對peg水凝膠進行修飾，用于需要具有特定增加的生物活性功能性的生物惰性背景的應用。然而，已發現peg易于氧化。peg對氧化損傷的敏感性降低了其用于需要長期材料穩定性的應用的效用。然而，對于其中需要最大生物穩定性和非結垢的應用，基于peg的材料是不能勝任的。

最近，包括聚(羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯)的兩性離子化合物已被證實是結垢超少的，意味著用這些聚合物涂覆的表面實現低于5ng/cm²的蛋白吸附。由于兩性離子材料的高水合和超低的結垢性，因此作為對生物醫學應用具有優良適用性的水凝膠，兩性離子水凝膠是令人感興趣的。然而，迄今為止研究的兩性離子水凝膠已顯示出低機械強度，這限制了其潛在的生物學用途。

因此，存在對具有改善的機械性能的水凝膠的需求。本發明力圖滿足該需求并提供另外的相關優點。

發明概述

本發明提供官能化的兩性離子和混合電荷聚合物和共聚物，用于制備該聚合物和共聚物的方法，由官能化的兩性離子和混合電荷聚合物和共聚物制備的水凝膠，用于制備該水凝膠的方法，將該水凝膠用于體外和體內細胞培養的方法，和用于給予治療劑的兩性離子和混合電荷聚合物和共聚物。

官能化的兩性離子聚合物和混合電荷共聚物

一方面，本發明提供了官能化的兩性離子聚合物和共聚物以及官能化的混合電荷共聚物。

在一個實施方案中，本發明提供了一種官能化的聚合物，其包含核，所述核具有共價偶聯到核并從核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含一個或多個官能團，所述一個或多個官能團有效將所述聚合物共價偶聯到能夠與所述一個或多個官能團形成共價鍵的材料。

在某些實施方案中，所述聚合物包含三個、四個、五個或六個聚合物支鏈。支鏈的數目可以變化，并取決于所述核和所述支鏈本身的性質。在一些實施方案中，所述支鏈是支化的。

在某些實施方案中，所述結構單元是兩性離子結構單元。在其它實施方案中，所述結構單元是混合電荷結構單元。將被理解的是，所述兩性離子聚合物和混合電荷共聚物可進一步包含其它結構單元(例如，兩性離子聚合物可以是共聚物)。合適的其它結構單元包括包含賦予共聚物反應性的官能團或賦予共聚物期望性質的其它基團(例如陰離子基團、陽離子基團、中性基團、疏水基團、親水基團)的結構單元。

在某些實施方案中，官能團位于聚合物支鏈的末端。在其它實施方案中，官能團的位置是沿著所述聚合物支鏈的骨架。在一些實施方案中，一個或多個結構單元包含官能團。可以控制聚合物或聚合物支鏈中官能團的數目以達到期望的聚合物或支鏈的整體官能度，并且聚合物或聚合物支鏈中官能團的數目將取決于聚合物的最終用途。

在某些實施方案中，官能團是硫醇。在其它實施方案中，官能團是反應對之一。在這些實施方案中，官能團是選自疊氮化物和炔烴、疊氮化物和烯烴、硫醇和馬來酰亞胺、或硫醇和二硫化物的反應對之一。

兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠

在本發明的另一方面，提供了兩性離子和混合電荷水凝膠。

在一個實施方案中，水凝膠包含共價偶聯至第二聚合物的第一聚合物，其中所述第一聚合物包含第一核，所述第一核具有共價偶聯到第一核并從第一核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第一結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第一聚合物共價偶聯到所述第二聚合物的一個或多個第一官能團，其中所述第二聚合物包含第二核，所述第二核具有共價偶聯到第二核并從第二核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第二結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第二聚合物共價偶聯到所述第一聚合物的一個或多個第二官能團，并且其中所述水凝膠包含通過所述第一官能團和第二官能團的反應形成的鍵合所述第一聚合物和第二聚合物的共價鍵。

在另一個實施方案中，水凝膠包含共價偶聯至第二聚合物的第一聚合物，其中所述第一聚合物包含第一核，所述第一核具有共價偶聯到第一核并從第一核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第一結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第一聚合物共價偶聯到所述第二聚合物的一個或多個第一官能團，其中所述第二聚合物包含第二核，所述第二核具有共價偶聯到第二核并從第二核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第二結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第二聚合物共價偶聯到所述第一聚合物的一個或多個第二官能團，并且其中所述水凝膠包含通過具有兩個或多個第三官能團的交聯劑鍵合所述第一聚合物和第二聚合物的共價鍵，其中鍵合所述第一聚合物和第二聚合物的共價鍵通過所述第一官能團和第三官能團以及所述第二官能團和第三官能團的反應形成。

在包含由交聯劑形成的交聯的某些水凝膠實施方案中，將被理解的是，交聯的性質可以變化。在某些實施方案中，所述第一聚合物和第二聚合物是不同的，具有不同的官能團，并且通過具有合適的反應官能團的交聯劑進行交聯。在其它實施方案中，所述第一聚合物和第二聚合物是相同的，具有相同的官能團，并且通過具有合適的反應官能團的交聯劑進行交聯。

在包含由交聯劑形成的交聯的某些水凝膠實施方案中，所述第一官能團和第二官能團是相同的。在包含由交聯劑形成的交聯的某些水凝膠實施方案中，所述第一官能團是硫醇，所述第二官能團是硫醇，并且所述第三官能團是硫醇或二硫化物。在包含由交聯劑形成的交聯的其它水凝膠實施方案中，所述第一官能團和第三官能團以及所述第二官能團和第三官能團是點擊化學反應對。在這些實施方案中的某些實施方案中，所述第一官能團和第三官能團選自疊氮化物和炔烴、疊氮化物和烯烴、硫醇和馬來酰亞胺、或硫醇和二硫化物。在這些實施方案中的某些實施方案中，所述第二官能團和第三官能團選自疊氮化物和炔烴、疊氮化物和烯烴、硫醇和馬來酰亞胺、或硫醇和二硫化物。

對于如上所述的本發明的水凝膠，在某些實施方案中，所述第一聚合物包含三個、四個、五個或六個聚合物支鏈。在某些實施方案中，所述第一結構單元是兩性離子結構單元。在其它實施方案中，所述第一結構單元是混合電荷結構單元。

在某些實施方案中，所述第一官能團位于聚合物支鏈的末端。在其它實施方案中，所述第一官能團的位置是沿著所述聚合物支鏈的骨架。在某些實施方案中，所述第一結構單元包含所述第一官能團。

在某些實施方案中，所述第二聚合物包含三個、四個、五個或六個聚合物支鏈。在某些實施方案中，所述第二結構單元是兩性離子結構單元。在其它實施方案中，所述第二結構單元是混合電荷結構單元。

在某些實施方案中，所述第二官能團位于聚合物支鏈的末端。在其它實施方案中，所述第二官能團的位置是沿著所述聚合物支鏈的骨架。在某些實施方案中，所述第二結構單元包含所述第二官能團。

在某些實施方案中，所述第一和第二官能團是相同的。在某些實施方案中，所述第一官能團是硫醇，并且第二官能團是硫醇。在其它實施方案中，所述第一官能團和第二官能團是不同的。在某些實施方案中，所述第一官能團和第二官能團是點擊化學反應對。代表性的對包括疊氮化物和炔烴、疊氮化物和烯烴、硫醇和馬來酰亞胺、或硫醇和二硫化物。

本發明的水凝膠可以有利地包含另外的組分。在某些實施方案中，水凝膠進一步包含細胞、病毒、細菌及其組分，或其基因改變的變體。

代表性的細胞包括天然細胞及其基因修飾的對應物，例如外分泌上皮細胞、激素分泌細胞、角質化上皮細胞、濕分層屏障上皮細胞(wetstratifiedbarrierepithelialcells)、感覺傳導細胞、自主神經元細胞、感覺器官和外周神經元支持細胞、神經元和膠質細胞、晶狀體細胞、肝細胞、脂肪細胞(adipocyte)、脂細胞(lipocyte)、屏障功能細胞、腎細胞、心臟細胞、細胞外基質細胞、收縮細胞，血液和免疫系統細胞如紅細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞、t細胞、干細胞、生殖細胞、滋養細胞、間質細胞、祖細胞、造血干細胞。

代表性病毒包括dna病毒、rna病毒、逆轉錄酶病毒、逆轉錄病毒和腺病毒。

代表性細菌包括病原菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、藍細菌。代表性的細菌種類包括梭菌的種、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌。

在某些實施方案中，本發明的水凝膠包含寡核苷酸(dna和rna)、脂質復合物(lipoplexes)、聚合物囊泡(polymersome)、聚合復合物(polyplexes)、樹狀聚合物(dendrimer)、無機顆粒。

在其它實施方案中，本發明的水凝膠包含蛋白質、肽、多糖或小分子。

在某些實施方案中，本發明的水凝膠包含治療劑或診斷劑。

在其它實施方案中，本發明的水凝膠包含納米材料。

用兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠處理的表面和制備的裝置

在另一方面，本發明提供了用本發明的水凝膠處理的基質。在一個實施方案中，本發明提供了具有表面的基質，其中所述表面的至少一部分用水凝膠涂覆。在某些實施方案中，所述表面全部用水凝膠涂覆。

在相關方面，本發明提供了至少部分地由本發明的水凝膠形成的裝置(例如，醫療裝置)或摻入本發明的水凝膠的裝置(例如，醫療裝置)。在這些實施方案中的某些實施方案中，所述裝置全部或部分地由本發明的水凝膠制成。

代表性的基質和裝置包括以下：可植入的生物傳感器、傷口護理裝置、密封劑、接觸透鏡、牙科植入物、矯形裝置(人工關節、人工骨、人工韌帶、人工腱)、心血管裝置(導管、人工瓣膜、人工血管、人工支架、lvad、節律管理裝置)、胃腸病學裝置(飼管、消化道夾、胃腸套(gastro-intestinalsleeve)、胃氣囊(gastricballoon))、ob/gyn裝置(植入式生育控制裝置、陰道吊帶)、腎臟裝置(吻合連接器、皮下港)、神經外科裝置(神經引導管、腦脊液引流管或分流器)、皮膚病學裝置(皮膚修復裝置)、眼科裝置(分流器)、耳鼻喉科裝置(支架、耳蝸植入物、管、分流器、擴張器)、眼內透鏡(intra-ocularlen)、美容植入物(乳房植入物、鼻植入物、臉頰植入物)、神經學植入物(神經刺激裝置)、耳蝸植入物、神經導管、激素控制植入物(血糖傳感器、胰島素泵)、植入的生物傳感器、接入端口裝置(accessportdevice)、組織支架肺部裝置(用于copd或人工肺的管理的瓣膜)、放射學裝置(射線不透性或超聲不透性標記物)或泌尿裝置(導管、人工尿道)。

兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠的用途

另一方面，本發明提供了兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠的用途。

在某些實施方案中，本發明提供了包含水凝膠的用于細胞保護、保存或生長的培養基。所述培養基可進一步包含一種或多種營養素或生長因子。所述培養基可以在體外或體內使用。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的外科密封劑。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的外科抗粘附涂層。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的外科填充物。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的傷口敷料。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的美容填充物。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的預成型為特定形狀的美容填充物。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的矯形軟組織替代物(例如軟骨或椎間盤(spinaldisc))。

在某些實施方案中，本發明提供了包含所述水凝膠的組織生長支架。所述支架可以在體外或體內使用。

在某些實施方案中，本發明提供了至少部分地由水凝膠形成的醫療裝置。

在某些實施方案中，本發明提供了摻入水凝膠的醫療裝置。

用于制備兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠的方法

在另一方面，本發明提供了用于制備兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠的方法。

在第一實施方案中，本發明提供了一種用于形成水凝膠的方法，其包括使第一聚合物與第二聚合物反應以提供水凝膠，其中所述第一聚合物包含第一核，所述第一核具有共價偶聯到第一核并從第一核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第一結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第一聚合物共價偶聯到所述第二聚合物的一個或多個第一官能團，其中所述第二聚合物包含第二核，所述第二核具有共價偶聯到第二核并從第二核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第二結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第二聚合物共價偶聯到所述第一聚合物的一個或多個第二官能團，并且其中所述水凝膠通過所述第一官能團和第二官能團之間形成共價鍵而形成。

在某些實施方案中，所述水凝膠在原位形成(例如，在體內)。在其它實施方案中，所述水凝膠在容器中形成。在任一實施方案中，所述水凝膠可用于細胞培養。

在第二實施方案中，本發明提供一種用于在體內形成水凝膠的方法，其包括：

(a)在體內的部位放置第一聚合物；和

(b)在所述部位放置第二聚合物，由此所述第二聚合物在所述部位與所述第一聚合物接觸以提供水凝膠，

其中所述第一聚合物包含第一核，所述第一核具有共價偶聯到第一核并從第一核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第一結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第一聚合物共價偶聯到所述第二聚合物的一個或多個第一官能團，

其中所述第二聚合物包含第二核，所述第二核具有共價偶聯到第二核并從第二核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第二結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第二聚合物共價偶聯到所述第一聚合物的一個或多個第二官能團，

其中所述水凝膠通過所述第一官能團和第二官能團之間形成共價鍵而形成。

在某些實施方案中，通過注射、噴射、灌注和浸涂將所述第一聚合物和第二聚合物置于所述部位。

在第三實施方案中，本發明提供了一種用于形成水凝膠的方法，其包括使第一聚合物、第二聚合物和交聯劑反應以提供水凝膠，其中所述第一聚合物包含第一核，所述第一核具有共價偶聯到第一核并從第一核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第一結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第一聚合物共價偶聯到所述交聯劑的一個或多個第一官能團，其中所述第二聚合物包含第二核，所述第二核具有共價偶聯到第二核并從第二核延伸的兩個或多個聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的第二結構單元，并且其中所述兩個或多個聚合物支鏈各自包含有效地將所述第二聚合物共價偶聯到所述交聯劑的一個或多個第二官能團；其中所述交聯劑包含通過在所述第一聚合物和第二聚合物之間形成交聯有效地將所述第一聚合物共價偶聯到所述第二聚合物的兩個或多個第三官能團；并且其中所述水凝膠通過所述第一官能團和第三官能團以及所述第二官能團和第三官能團之間形成共價鍵而形成。

在第三實施方案中的某些實施方案中，所述第一官能團和第二官能團是相同的；所述第一官能團是硫醇，所述第二官能團是硫醇，且所述第三官能團是硫醇或二硫化物；以及所述第一官能團和第三官能團、和所述第二官能團和第三官能團是點擊化學反應對。在某些實施方案中，所述第一官能團和第三官能團選自疊氮化物和炔烴、疊氮化物和烯烴、硫醇和馬來酰亞胺、或硫醇和二硫化物。在某些實施方案中，所述第二官能團和第三官能團選自疊氮化物和炔烴、疊氮化物和烯烴、硫醇和馬來酰亞胺、或硫醇和二硫化物。

在上述方法(第一、第二和/或第三實施方案)中，所述第一聚合物包含三個、四個、五個或六個聚合物支鏈。

在這些實施方案中的某些實施方案中，所述第一結構單元是兩性離子結構單元。在這些實施方案中的其它實施方案中，所述第一結構單元是混合電荷結構單元。

在某些實施方案中，所述第一官能團位于所述聚合物支鏈的末端。在其它實施方案中，所述第一官能團的位置是沿著所述聚合物支鏈的骨架。在某些實施方案中，一個或多個所述第一結構單元包含所述第一官能團。

在上述方法(第一、第二和/或第三實施方案)中，所述第二聚合物包含三個、四個、五個或六個聚合物支鏈。

在這些實施方案中的某些實施方案中，所述第二結構單元是兩性離子結構單元。在這些實施方案中的其它實施方案中，所述第二結構單元是混合電荷結構單元。

在某些實施方案中，所述第二官能團位于聚合物支鏈的末端。在其它實施方案中，所述第二官能團的位置是沿著所述聚合物支鏈的骨架。在某些實施方案中，一個或多個所述第二結構單元包含所述第二官能團。

在某些實施方案中，所述第一官能團和第二官能團是相同的。在某些實施方案中，第一官能團是硫醇，且第二官能團是硫醇。

在其它實施方案中，所述第一官能團和第二官能團是不同的。在某些實施方案中，所述第一官能團和第二官能團是點擊化學反應對。在某些實施方案中，所述第一官能團和第二官能團選自疊氮化物和炔烴、疊氮化物和烯烴、硫醇和馬來酰亞胺、或硫醇和二硫化物。

兩性離子和混合電荷星形聚合物治療劑綴合物(conjugate)

另一方面，本發明提供了兩性離子和混合電荷星形聚合物治療劑綴合物。

在一個實施方案中，本發明提供一種聚合物，其包含核，所述核具有兩個或多個共價偶聯至核并從核延伸的聚合物支鏈，其中所述聚合物支鏈包含選自兩性離子結構單元和混合電荷結構單元的結構單元，并且其中所述兩性離子結構單元和混合電荷結構單元包含共價偶聯至其的治療劑。

在某些實施方案中，所述治療劑通過可水解鍵共價偶聯至結構單元。

在某些實施方案中，所述聚合物包含三個、四個、五個或六個聚合物支鏈。在某些實施方案中，所述結構單元是兩性離子結構單元。在其它實施方案中，所述結構單元是混合電荷結構單元。

在相關方面，提供了一種用于向受試者給予治療劑的方法。在該方法中，將治療有效量的具有共價偶聯至其的治療劑的本發明的聚合物給予有其需要的受試者(例如，溫血動物，如人)。

在某些實施方案中，給予聚合物包括全身、表面(topical)或局部(local)給予。在某些實施方案中，給予聚合物包括吸入、口服和經皮給予。在某些實施方案中，給予聚合物包括靜脈內注射、肌內注射、皮下注射、腹膜內注射或局部注射。

附圖說明

因為當結合附圖時，參照下面的詳細描述，本發明的上述方面和許多伴隨的優點變得更好理解，所以其將變得更容易領會。

圖1是具有兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的本發明的代表性星形聚合物的合成的示意圖。在該星形聚合物中，所述支鏈顯示以溴甲基封端，所述溴甲基是用于連續聚合(例如原子轉移自由基聚合，atrp)的自由基引發劑基團。所述星形聚合物通過atrp由具有所示的自由基引發劑基團(-o(c＝o)-c(ch3)2-br)的四官能化核和羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯(ch2＝c(ch3)-c(＝o)-ch2ch2-n(ch3)2⁺-ch2ch2-co2^-，cbma)單體制備。

圖2是具有以硫醇基(-ch2-sh)封端的兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的本發明的代表性星形聚合物的合成示意圖。這種星形聚合物由圖1所示的所述星形聚合物通過點擊化學(星形聚合物與疊氮化鈉和3-硫代乙炔(3-thioacetylene)的反應)來制備。

圖3a和3b示意性地示出了由本發明的適當官能化的星形聚合物制備的本發明的代表性水凝膠的制備。圖3a示出了本發明的兩種代表性星形聚合物的合成：(a)具有以硫醇基(-ch2-sh)封端的兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的星形聚合物，表示為pcb-a；和(b)具有以吡啶基二硫基(-ch2-s-s-c5h4n)封端的兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的星形聚合物，表示為pcb-b。這些星形聚合物由圖1所示的所述星形聚合物通過點擊化學(星形聚合物與疊氮化鈉和(a)3-硫代乙炔或(b)3-吡啶基二硫乙炔(3-pyridyldisulfideacetylene)的反應)來制備。圖3b示出了由圖3a所示的所述星形聚合物(pcb-a和pcb-b)的反應制備的本發明的代表性水凝膠的制備。水凝膠可以通過在細胞存在下簡單混合pcb-a與pcb-b來形成。

圖4a-4d顯示在本發明的代表性水凝膠(pcb水凝膠)中培養的包封的胰島細胞的數據。圖4a是顯示在體外培養18天后對pcb水凝膠內的包封胰島進行live/dead測定的結果的圖像。刻度條：300μm。胰島細胞的水凝膠包封的效果示于圖4b-4d。圖4b比較了在本發明的代表性水凝膠(pcb)和對照物(ctrl)(n＝3)中培養的胰島細胞隨時間的葡萄糖消耗。圖4c比較了在本發明的代表性水凝膠(pcb)和對照物(ctrl)中培養的胰島細胞在靜態孵育中第18天(n＝4)的胰島素分泌。圖4d比較了在本發明的代表性水凝膠(pcb)和對照物(ctrl)中培養的胰島細胞使用灌注系統(n＝3)通過低葡萄糖培養基(3mm，藍色箭頭)、高葡萄糖培養基(17mm，紅色箭頭)并再通過低(3mm)葡萄糖培養基的連續刺激評估的第18天的動態胰島素釋放。圖中，*表示與對照胰島(無水凝膠，p<0.05)有顯著差異。均值±sem。

圖5a和5b示出在本發明的代表性水凝膠(pcb水凝膠)中培養的包封的外周血干細胞(pbsc)細胞的數據。圖5a示出水凝膠模量隨時間的變化(水凝膠降解)。圖5b是顯示在7天體外培養后在pcb水凝膠內對包封的pbsc細胞進行的live/dead測定的結果的圖像。

圖6是從具有兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的本發明的代表性星形聚合物釋放代表性治療劑的示意圖。所述星形聚合物通過atrp由具有所述自由基引發劑基團的四官能化核和羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯治療劑單體(ch2＝c(ch3)-c(＝o)-ch2ch2-n(ch3)2⁺-ch2ch2-co2-治療劑)制備。在所示的代表性星形聚合物中，通過與cbma的延伸聚合進一步延伸支鏈，以提供除帶有治療劑的結構單元之外還具有兩性離子結構單元的支鏈。圖6所示的所述星形聚合物是嵌段共聚物。將被理解的是，在某些實施方案中，所述星形聚合物是通過兩性離子單體(例如cbma)和兩性離子治療劑單體(例如cbma-治療劑)的共聚制備的無規共聚物。在所述星形聚合物水解時，釋放所述治療劑。星形聚合物的水解和治療劑的釋放使星形聚合物中的兩性離子結構單元再生。如圖6所示，所述治療劑是布洛芬(ibuprophen)，并且通過cbma與布洛芬的縮合制備用于合成能釋放布洛芬的所述星形聚合物的單體。

圖7是對制備用于細胞包封的水凝膠有用的本發明的代表性星形pcb的制備的示意圖。

圖8比較了包封在本發明的代表性pcb水凝膠內的t細胞的活力。

發明詳述

本發明提供了兩性離子和混合電荷星形聚合物和共聚物，用于治療劑遞送和水凝膠形成的官能化的兩性離子和混合電荷星形聚合物和共聚物，具有共價偶聯至其的治療劑的用于治療劑遞送的兩性離子和混合電荷星形聚合物和共聚物，和由官能化的兩性離子和混合電荷星形聚合物制備的水凝膠。

如本文所用，術語“兩性離子聚合物或共聚物”是指具有兩性離子結構單元的聚合物或共聚物。兩性離子結構單元具有包含兩性離子基團的側基(即聚合物骨架側面的基團)。代表性的兩性離子側基包括羧基甜菜堿基團(例如，-ra-n⁺(rb)(rc)-rd-co2^-，其中ra是將聚合物骨架共價偶聯到羧基甜菜堿基團的陽離子氮中心的連接基團，rb和rc是氮取代基，rd是將陽離子氮中心共價偶聯到羧基甜菜堿基團的羧基的連接基團)。

術語“混合電荷共聚物”是指具有基本上相等數量的帶正電荷的結構單元和帶負電荷的結構單元以提供基本上電中性的共聚物的共聚物。在某些實施方案中，混合電荷共聚物是無規共聚物，所述無規共聚物不具有沿聚合物骨架的帶正電荷或帶負電荷的延伸區域(即帶正電荷和帶負電荷的結構單元沿聚合物骨架相對均勻分布)。代表性的混合電荷側基包括羧基(例如，-ra-co2^-，其中ra是將羧基共價偶聯到聚合物骨架的連接基團)和氨基(例如，-ra-n⁺(rb)(rc)(rd)，其中ra是將陽離子氮中心共價偶聯到聚合物骨架的連接基團，rb，rc和rd是氮取代基)。

術語“星形聚合物或共聚物”是指其中兩個或多個聚合物或共聚物支鏈從核延伸的支化聚合物或共聚物。本發明的代表性的星形聚合物和共聚物包含從核延伸的兩個、三個、四個、五個、六個或更多個支鏈。核是具有兩個或多個官能團的原子團，通過聚合所述支鏈可以從所述核延伸。代表性的核具有兩個、三個、四個、五個、六個或更多個官能團，支鏈可以從所述核延伸。在某些實施方案中，支鏈是兩性離子聚合物或共聚物支鏈。在其它實施方案中，支鏈是混合電荷共聚物支鏈。

術語“官能化的聚合物或共聚物”是指共聚物的聚合物，其包含賦予聚合物或共聚物共價偶聯到也是官能化的聚合物或共聚物的另一共聚物的聚合物的反應性的官能團。在本發明的實踐中，本發明的官能化的星形聚合物和共聚物通過其官能團反應以形成共價偶聯聚合物和共聚物(例如，使聚合物和共聚物交聯)的共價鍵。為了將第一官能化的聚合物或共聚物共價偶聯到第二官能化的聚合物或共聚物，第一聚合物或共聚物和第二聚合物或共聚物的官能團(即分別為第一官能團和第二官能團)具有互補的反應性。第一官能團和第二官能團是反應對。在某些實施方案中，第一官能團和第二官能團一旦在室溫和生理溫度之間的溫度下混合就反應以形成鍵(例如，在沒有外部刺激的情況下)。合適的這種反應對在本領域中是已知的。代表性的有用的反應對包括硫醇/馬來酰亞胺和點擊化學反應對(例如，疊氮化物/炔烴和疊氮化物/烯烴)。

聚合物定義

術語“結構單元”是指聚合物中的原子或原子團，其包括聚合物鏈的部分以及其側面的原子或原子團(如果存在的話)。結構單元可以指重復單元。結構單元還可以指聚合物鏈上的端基。例如，聚乙二醇的結構單元可以是對應于重復單元的-ch2ch2o-或對應于端基的-ch2ch2oh。

術語“重復單元”對應于最小的結構單元，其重復構成了規則大分子(或寡聚物分子或嵌段)。

術語“端基”是指位于聚合物端部的具有僅一個與聚合物鏈的連接(attachment)的結構單元。例如，一旦單體單元已聚合，則端基可以來源于聚合物端部的單體單元。作為另一個實例，端基可以是用于合成聚合物的鏈轉移劑或引發劑的部分。

術語“單體”是聚合時構成聚合物結構中的一個或多個結構單元的可聚合化合物。

術語“聚合物”是指作為單個單體聚合的結果的產物。

術語“共聚物”是指作為由兩種或多種不同單體聚合的結果的聚合物。可以在共聚物中分別控制每種結構單元的數量和性質。除非另有明確說明，否則結構單元可以以完全隨機、交替隨機、規則交替、規則嵌段或隨機嵌段的構型進行設置。完全隨機構型可以例如為：x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z……或y-z-x-y-z-y-z-x-x……。交替隨機構型可以為：x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z……，且規則交替構型可以為：x-y-z-x-y-z-x-y-z……。

官能化的兩性離子聚合物和混合電荷共聚物

一方面，本發明提供了官能化的兩性離子和混合電荷聚合物和共聚物。在某些實施方案中，本發明的官能化的兩性離子和混合電荷聚合物和共聚物是官能化的兩性離子星形和混合電荷星形聚合物和共聚物。

如上所述，對于本發明的星形聚合物和共聚物而言，支鏈可以是任何兩性離子或混合電荷聚合物以及其通過水解、紫外線照射或熱可以被轉化為兩性離子或混合電荷聚合物的前體。兩性離子或混合電荷聚合物可以通過有效地使不飽和單體聚合的任何聚合方法獲得，聚合方法包括原子轉移自由基聚合(atrp)、可逆加成-斷裂鏈轉移聚合(raft)、光聚合、開環聚合(rop)、縮合、邁克爾(michael)加成、支鏈產生/增長反應(branchgeneration/propagationreaction)或其它反應。在某些實施方案中，具有末端官能團的聚合物能夠特異性結合到結合配偶體，且同時避免通過它們的兩性離子或混合電荷結構被賦予聚合物的非特異性生物結垢。由于它們的官能化末端，通過互補偶聯化學(例如，點擊化學、硫醇交換反應、還原反應和本領域已知的其它化學過程)，本發明的聚合物可以被轉化成用于制備本發明的水凝膠的進一步官能化的聚合物。在產生支鏈后，這些官能端基可以被預改性和后改性。

兩性離子單體。在某些實施方案中，本發明的官能化的聚合物和共聚物是由合適的可聚合的兩性離子單體的聚合制備的聚合物。在這些實施方案中的某些實施方案中，聚合物或共聚物具有式(i)的重復單元：

其中

r4選自氫、氟、三氟甲基、c1-c6烷基和c6-c12芳基；

r5和r6獨立地選自烷基和芳基，或與它們所連接的氮一起形成陽離子中心；

l4是將陽離子中心[n⁺(r5)(r6)]共價偶聯到聚合物骨架[-(ch2-cr4)n-]的連接部。

l5是將陰離子中心[a2(＝o)o^-]共價偶聯到陽離子中心的連接部；

a2是c、so、so2、p或po；

n為5至約10,000的整數；和

*代表重復單元被共價連接至用于形成水凝膠的相鄰的重復單元或官能團的點。

在聚合物中，側基兩性離子基團是內鹽且m+和x-不存在。

在一個實施方案中，r4是c1-c3烷基。

r5和r6獨立地選自烷基和芳基，或與它們所連接的氮一起形成陽離子中心。在一個實施方案中，r5和r6是c1-c3烷基。

在某些實施方案中，l4選自以下：-c(＝o)o-(ch2)n-和-c(＝o)nh-(ch2)n-，其中n是1至20的整數。在某些實施方案中，l4是-c(＝o)o-(ch2)n-，其中n為1-6。

在某些實施方案中，l5為-(ch2)n-，其中n為1至20的整數。

在某些實施方案中，a2是c或so。

在某些實施方案中，n為5至約5,000的整數。

在一個實施方案中，r4、r5和r6為甲基，l4為-c(＝o)o-(ch2)2-，l5為-(ch2)-，a1為c，且n為10至約1,000的整數。

本發明的兩性離子聚合物和共聚物可以通過具有式(ii)的單體的聚合來制備：

ch2＝c(r4)-l4-n⁺(r5)(r6)-l5-a2(＝o)o^-(ii)

其中r4、r5、r6、l4、l5和a2如上文關于式(i)的重復單元所述的。

本發明的代表性兩性離子聚合物支鏈具有式(iii)：

pb-(l4-n⁺(r5)(r6)-l5-a2(＝o)o^-)n(iii)

其中r5、r6、l4、l5、a2和n如上文關于式(i)的重復單元所述的，并且pb是包含重復單元[式(i)]的聚合物骨架。

混合電荷共聚單體。另一方面，本發明提供由離子對共聚單體的共聚制備的混合電荷共聚物。如上所述，混合電荷共聚物具有聚合物骨架、多個帶正電荷的重復單元和多個帶負電荷的重復單元。在本發明的實踐中，這些共聚物可以通過離子對共聚單體的聚合制備。

混合電荷共聚物包含多個帶正電荷的重復單元和多個帶負電荷的重復單元。在一個實施方案中，混合電荷共聚物是基本電中性的。如本文所用，術語“基本上電中性”是指賦予共聚物有利的不結垢性的共聚物。在一個實施方案中，基本上電中性的共聚物是具有基本上為零的凈電荷的共聚物(即帶正電荷的重復單元和帶負電荷的重復單元數目約相等的共聚物)。在一個實施方案中，帶正電荷的重復單元的數目與帶負電荷的重復單元的數目之比為約1:1.1至約1:0.5。在一個實施方案中，帶正電荷的重復單元的數目與帶負電荷的重復單元的數目之比為約1:1.1至約1:0.7。在一個實施方案中，帶正電荷的重復單元的數目與帶負電荷的重復單元的數目之比為約1:1.1至約1:0.9。

在一個實施方案中，混合電荷共聚物由合適的可聚合的離子對共聚單體的共聚制備。

用于本發明的代表性離子對共聚單體具有式(iv)和(v)：

ch2＝c(r7)-l6-n⁺(r9)(r10)(r11)x^-(iv)

ch2＝c(r8)-l7-a3(＝o)-o-m+(v)

在該實施方案中，混合電荷共聚物具有式(vi)的重復單元：

其中

r7和r8獨立地選自氫、氟、三氟甲基、c1-c6烷基和c6-c12芳基；

r9、r10和r11獨立地選自烷基和芳基，或與它們所連接的氮一起形成陽離子中心；

a3(＝o)om)是陰離子中心，其中a3是c、so、so2、p或po，以及m是金屬或有機反離子(counterion)；

l6是將陽離子中心[n⁺(r9)(r10)(r11)]共價偶聯到聚合物骨架的連接部；

l7是將陰離子中心[a(＝o)om]共價偶聯到聚合物骨架的連接部；

x^-是與陽離子中心締合的反離子；

n為5至約10,000的整數；

p為5至約10,000的整數；和

*代表重復單元被共價連接至用于形成水凝膠的任一和相鄰的重復單元或官能團的點。

在一個實施方案中，r7和r8是c1-c3烷基。

r9、r10和r11獨立地選自烷基和芳基，或與它們所連接的氮一起形成陽離子中心。在一個實施方案中，r9、r10和r11是c1-c3烷基。

在某些實施方案中，l6選自-c(＝o)o-(ch2)n-和-c(＝o)nh-(ch2)n-，其中n是1至20的整數。在某些實施方案中，l6是-c(＝o)o-(ch2)n-，其中n為1-6。

在某些實施方案中，l7是c1-c20亞烷基鏈。代表性的l7基團包含-(ch2)n-，其中n為1-20(例如，1、3或5)。

在某些實施方案中，a3是c、s、so、p或po。

在某些實施方案中，n為5至約5,000的整數。

在一個實施方案中，r7、r8、r9、r10和r11是甲基，l6和l7是-c(＝o)o-(ch2)2-，a1為c，以及n為10至約1,000的整數。

代表性的混合電荷聚合物支鏈具有式(vii)：

pb-[l6-n⁺(r9)(r10)(r11)]n[l7-a3(＝o)-o^-m⁺)]p(x^-)n(vii)

其中l6、n⁺(r9)(r10)(r11)、l7、a3(＝o)o-m+、x^-、n和p如上所述，且pb是包含重復單元[式(vi)]的聚合物骨架。

以下是對上述式(i)-(vi)的交聯劑、單體、共聚單體、聚合物、共聚物和交聯物的描述。

在上式中，pb是聚合物骨架。代表性的聚合物骨架包含獲自乙烯基單體(例如，丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯)的乙烯基骨架(例如，-c(r')(r”)-c(r”')(r””)-，其中r'、r”、r”'和r””獨立地選自氫、烷基和芳基)。其它合適的骨架包括提供側基的聚合物骨架。其它代表性的聚合物骨架包括肽(多肽)、氨基甲酸乙酯(聚氨酯)和環氧骨架。

類似地，在上式中，ch2＝c(r)-是可聚合的基團。將被理解的是，可以使用包含上述那些的其它可聚合的基團來提供本發明的單體和聚合物。

在上式中，n⁺是陽離子中心。在某些實施方案中，陽離子中心是季銨(例如，鍵合至l4、r5、r6和l5的n)。除了銨之外，其它有用的陽離子中心(與n一起的r5和r6)包括咪唑鎓、三唑鎓、吡啶鎓、嗎啉鎓、噁唑烷鎓、吡嗪鎓、噠嗪鎓，嘧啶鎓、哌嗪鎓和吡咯烷鎓。

r4、r5、r6、r9、r10和r11獨立地選自氫、烷基和芳基。代表性的烷基包括c1-c10直鏈和支鏈烷基。在某些實施方案中，烷基進一步被一個或多個取代基取代，所述取代基包括例如芳基(例如-ch2c6h5、芐基)。代表性的芳基包括c6-c12芳基，c6-c12芳基包括例如苯基。對于上述式的某些實施方案，r5和r6，或r9、r10和r11與n⁺一起形成陽離子中心。

l4(或l6)是將陽離子中心共價偶聯到聚合物骨架的連接部。在某些實施方案中，l4包含將l4的剩余部分偶聯到聚合物骨架(或單體的可聚合部分)的官能團(例如酯或酰胺)。除了官能團之外，l4還可以包含c1-c20亞烷基鏈。代表性的l4基團包含-c(＝o)o-(ch2)n-和-c(＝o)nh-(ch2)n-，其中n為1-20(例如3)。

l5是將陽離子中心共價偶聯到陰離子基團(即(a＝o)o^-)的連接部。l5可以是c1-c20亞烷基鏈。代表性的l5基團包含-(ch2)n-，其中n為1-20(例如，1、3或5)。

l7是將聚合物骨架共價偶聯到陰離子基團的連接部。l7可以是c1-c20亞烷基鏈。代表性的l7基團包含-(ch2)n-，其中n是1-20(例如，1、3或5)。

a(＝o)-o^-是陰離子中心。陰離子中心可以是羧酸酯(a是c)、亞磺酸(a是so)、磺酸(a是so2)、次膦酸(a是p)或膦酸(a是po)。

在上式中，代表性的烷基包含c1-c30直鏈和支鏈烷基。在某些實施方案中，烷基進一步被一個或多個取代基取代，所述取代基包括例如芳基(例如，-ch2c6h5、芐基)。

代表性的芳基包括c6-c12芳基，所述c6-c12芳基包括例如包括取代的苯基的苯基(例如苯甲酸)。

x^-是與陽離子中心締合的反離子。反離子可以是產生自陽離子聚合物或單體的合成的反離子(例如cl^-、br^-、i^-)。最初由陽離子中心的合成所產生的反離子也可以與其它合適的反離子交換，以提供具有可控水解性質和其它生物學性質的聚合物。代表性的疏水性反離子包括羧酸鹽，例如苯甲酸和脂肪酸陰離子(例如ch3(ch2)nco2^-，其中n＝1-19)；烷基磺酸鹽(例如ch3(ch2)nso3^-，其中n＝1-19)；水楊酸鹽；乳酸鹽；雙(三氟甲基磺酰基)酰胺陰離子(n^-(so2cf3)2)；及其衍生物。其它反離子也可以選自氯化物、溴化物、碘化物、硫酸鹽；硝酸鹽；高氯酸鹽(clo4)；四氟硼酸鹽(bf4)；六氟磷酸鹽(pf6)；三氟甲基磺酸鹽(so3cf3)；及其衍生物。其它合適的反離子包括疏水性反離子和具有治療活性的反離子(例如，抗微生物劑，例如水楊酸(2-羥基苯甲酸)、苯甲酸鹽、乳酸鹽。

對于單體，r1和r2選自氫、氟化物、三氟甲基和c1-c6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。在一個實施方案中，r1、r2和r4是氫。在一個實施方案中，r1、r2和r4是甲基。

本發明的代表性的兩性離子星形聚合物如圖1和2所示。

圖1是具有兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的本發明的代表性星形聚合物的合成的示意圖。在該星形聚合物中，支鏈顯示以溴甲基封端，所述溴甲基是用于連續聚合(例如原子轉移自由基聚合，atrp)的自由基引發劑基團。星形聚合物通過atrp由具有所示自由基引發劑基團(-o(c＝o)-c(ch3)2-br)的四官能化核和羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯(ch2＝c(ch3)-c(＝o)-ch2ch2-n(ch3)2⁺-ch2ch2-co2^-，cbma)單體制備。

圖2是具有以硫醇基(-ch2-sh)封端的兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的本發明的代表性星形聚合物的合成示意圖。這種星形聚合物由圖1所示的所述星形聚合物通過點擊化學(星形聚合物與疊氮化鈉和3-硫代乙炔的反應)來制備。

本發明的兩性離子和混合電荷聚合物的代表性官能團包括oh、nh、nh2、sh、n3、ch＝ch2、c≡ch、cooh、cho、酰亞胺酯、鹵代乙酰基、酰肼、烷氧基胺、芳基疊氮、雙吖丙啶、馬來酰亞胺、碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、噻唑烷-2-硫酮、吡啶基二硫化物(pyridyldisulfide)、二氟化環辛炔(difluorinatedcyclooctyne)、staudinger試劑對、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醚、巰基、肼、羥甲基膦、磺基-nhs酯、五氟苯基酯、磺酰基疊氮、5h-二苯并[b,f]吖庚因(5h-dibenz[b,f]azepine)及其衍生物。

在某些實施方案中，官能化的兩性離子聚合物具有式(a)：

其中

(c)是核(例如，c1-c50亞烷基、亞芳基、丙烯酸酯、胺、酰胺或其它大分子核)；

r1、r4、r5、r8和m獨立地選自c-c6亞烷基和c6-c12亞芳基。

r2和r3獨立地選自c1-c6亞烷基、c6-c12亞芳基、-o(ch2)m-、-s(ch2)m-、-c(＝o)(ch2)m-、-c(＝s)(ch2)m-、-c(＝nh)(ch2)m-和-nh(ch2)m-、-(ch2)mc(＝o)-、-(ch2)moc(＝o)-、-(ch2)mnhc(＝o)-、-(ch2)mnhc(＝s)-、-(ch2)msc(＝o)-、-(ch2)msc(＝s)-、-(ch2)mnhc(＝nh)-和-(ch2)mc(＝o)nhnh-，其中m是1至20的整數；

k是陽離子中心，其選自以下：銨、咪唑鎓、三唑鎓、吡啶鎓、嗎啉鎓和其它氮-、硫化物-、磷酸鹽-基陽離子，例如氨基亞膦酸(ammoniophosphinate)、氨基(烷氧基)二氰基乙烯醇鹽(ammonio(alkoxy)dicyanoethenolate)、氨基硼酸鹽(ammonioboronate)、磺酰基羧酸鹽(sulfoniocarboxylate)和羥吡啶甜菜堿(oxypyridinebetaine)；

r6和r7獨立地選自氫和c1-c6烷基、或與k一起形成陽離子中心，其選自以下：銨、咪唑鎓、三唑鎓、吡啶鎓、嗎啉鎓和其它氮-、硫化物-、磷酸鹽-基陽離子，例如氨基亞膦酸、氨基(烷氧基)二氰基乙烯醇鹽、氨基硼酸鹽、磺酰基羧酸鹽和羥吡啶甜菜堿；

a1是c、so、so2、p、或po^-；

n是從5到大約10,000的整數；

nc是核重復度，為1至1000的整數；和

x是選自以下的官能團：oh、nh、nh2、sh、n3、ch＝ch2、c≡ch、cooh、cho、酰亞胺酯、鹵代乙酰基、酰肼、烷氧基胺、芳基疊氮、雙吖丙啶、馬來酰亞胺、碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、噻唑烷-2-硫酮、吡啶基二硫化物、二氟化環辛炔、staudinger試劑對之一、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醚、巰基、肼、羥甲基膦、磺基-nhs酯、五氟苯基酯、磺酰基疊氮、5h-二苯并[b,f]吖庚因及其衍生物。

核重復度(nc)是聚合物中支鏈的總數。在某些實施方案中，支鏈數為2至500、3至100、3至10、3至6。

在某些實施方案中，x是硫醇、二硫化物、馬來酰亞胺或者點擊化學反應對之一。

在其它實施方案中，官能化的兩性離子聚合物具有式(b)：

其中

(c)、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、m、k、n和nc，如上文關于(a)所述的；

q^-是選自以下的反離子：cl^-、br^-、i^-、so4^2-、no3^-、clo4^-、bf4^-、pf6^-、n(so2cf3)2^-、so3cf3^-或rcoo^-(其中r為c1-c20烷基)、或乳酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽及其衍生物；和

r9是選自以下的官能團：氫、三氟甲基、c1-c6烷基、c6-c12芳基、-(ch2)noh、-(ch2)nnh2、-(ch2)nsh、-(ch2)nn3、-(ch2)nch＝ch2、-(ch2)nc≡ch、-(ch2)ncooh、-(ch2)ncho，其中n為1至6，酰亞胺酯、鹵代乙酰基、酰肼、烷氧基胺、芳基疊氮、雙吖丙啶、馬來酰亞胺、碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、噻唑烷-2-硫酮、吡啶基二硫化物、二氟化環辛炔、staudinger試劑對之一、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醚、巰基、肼、羥甲基膦、磺基-nhs酯、五氟苯基酯、磺酰基疊氮、5h-二苯并[b,f]吖庚因及其衍生物。

在進一步的實施方案中，官能化的兩性離子聚合物具有式(c)：

其中

(c)、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、m、k、q、x、n和nc如上文關于(a)和(b)所述的。

在其它實施方案中，官能化的兩性離子聚合物具有式(d)：

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、q、a1、nc和x如上文關于(a)、(b)和(c)所述的，

m1、m2和m3是獨立選擇的，且如上文關于(a)、(b)和(c)的m所述的；

k1和k2是獨立選擇的，且如上文關于(a)、(b)和(c)的k所述的；

p2和p3如上文關于r2和r3所述的；

p4、p5和p8分別如上文關于r4、r5和r8所述的；

p6和p7如上文關于r6和r7所述的；

q2和q3如上文關于r2和r3所述的；

q4和q5如上文關于r4和r5所述的；

r9、f和x是獨立地選自以下的官能團：-(ch2)noh、-(ch2)nnh2、-(ch2)nsh、-(ch2)nn3、-(ch2)nch＝ch2、-(ch2)nc≡ch、-(ch2)ncooh、-(ch2)ncho、其中n為1至6，酰亞胺酯、鹵代乙酰基、酰肼、烷氧基胺、芳基疊氮、雙吖丙啶、馬來酰亞胺、碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、噻唑烷-2-硫酮、吡啶基二硫化物、二氟化環辛炔、staudinger試劑對之一、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醚、巰基、肼、羥甲基膦、磺基-nhs酯、五氟苯基酯、磺酰基疊氮、5h-二苯并[b,f]吖庚因及其衍生物。

m為5至約10,000的整數；

n為5至約10,000的整數；和

q是5至約10,000的整數。

在某些實施方案中，官能化的混合電荷共聚物具有式(e)：

其中

(c)、r1、r2、r3、r5、r6、r7、m、k、a1、n、nc和x如上文關于(a)所述的，且

n如上文關于m所述的；

r8如上文關于r6和r7所述的。

r9如上文關于r2和r3所述的。

r10如上文關于r5所述的。

在其它實施方案中，官能化的混合電荷共聚物具有式(f)：

其中

(c)、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、m、k、n、a1、n和nc如上文關于(e)所述的，q^-如上文關于(b)所述的，且r11選自以下：-(ch2)noh、-(ch2)nnh2、-(ch2)nsh、-(ch2)nn3、-(ch2)nch＝ch2、-(ch2)nc≡ch、-(ch2)ncooh、-(ch2)ncho，其中n為1至6，酰亞胺酯、鹵代乙酰基、酰肼、烷氧基胺、芳基疊氮、雙吖丙啶、馬來酰亞胺、碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、噻唑烷-2-硫酮、吡啶基二硫化物、二氟化環辛炔、staudinger試劑對之一、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醚、巰基、肼、羥甲基膦、磺基-nhs酯、五氟苯基酯、磺酰基疊氮、5h-二苯并[b，f]吖庚因及其衍生物。

在進一步的實施方案中，官能化的混合電荷共聚物具有式(g)：

其中

(c)、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、m、k、n、a1、n、nc和x如上文關于(e)和(f)所述的。

在其它實施方案中，官能化的混合電荷共聚物具有式(h)：

其中

(c)、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、a1、nc、q-和x如上文關于(g)所述的；

m1、m2和m3獨立地如上文關于(g)的m所述的；

n1和n2獨立地如上文關于(g)的n所述的；

k1和k2獨立地如以上關于(g)的k所述的。

p2、p3和p9分別如關于r2、r3和r9所述的；

p4為如關于r4所述的；

p5和p10分別如關于r5和r10所述的；

p6、p7和p8分別如關于r6、r7和r8所述的；

q2、q3和q4分別如關于r2、r3和r4所述的；

f如上文關于(d)所述的；和

m、n和q如上文關于(d)所述的。

兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠

在另一方面，本發明提供了由官能化的兩性離子和混合電荷星形聚合物制備的水凝膠。官能化的兩性離子和混合電荷聚合物和共聚物可用于通過使用相同的聚合物(例如通過硫醇封端的聚合物的二硫化物鍵合)、兩種或更多種聚合物(例如通過點擊化學)，或與其它多功能分子、寡聚物和聚合物形成均聚物或共聚物(例如，水凝膠)。

由于在聚合物中存在大量的羧酸(cooh)基團(即存在于每個結構單元中)，所以聚(羧基甜菜堿)(pcb)聚合物是高度可官能化的。這種官能度使聚合物通用于使用簡單化學過程進一步官能化。一種這樣的化學過程是cooh基與胺官能化合物偶聯。由于偶聯劑(例如n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/n-羥基琥珀酰亞胺(edc/nhs))的高效性，該化學操作簡便。偶聯化學可以用于使用各種不同的胺來官能化pcb聚合物。當選擇含有用于點擊化學的互補基團的胺時，可以獲得點擊反應性pcb聚合物對。本發明的水凝膠可以通過將具有互補官能團的兩種聚合物簡單地混合來制備。在其它實施方案中，合適的雙官能交聯劑或其它互補官能化的化合物可與反應性pcb聚合物混合以提供水凝膠。這些構思在圖解1-3中示出。

在一個實施方案中，將用互補可點擊基團(r和r*)官能化的第一兩性離子聚合物和第二兩性離子聚合物(例如pcb)組合以提供如圖解1所示的水凝膠。

圖解1。用互補可點擊基團r和r*官能化的聚(羧基甜菜堿)聚合物(步驟1a和1b)和通過將其混合形成的所得水凝膠。

參看圖解1，將帶有側面的第一反應基團(r)的第一聚合物和帶有側面的第二反應基團(r*)的第二聚合物組合以提供本發明的代表性水凝膠。第一聚合物和第二聚合物可由與圖解1所示相同的聚合物制備(例如本發明的兩性離子聚合物或混合電荷共聚物)。水凝膠通過互補的第一反應基團和第二反應基團(例如，互補的第一和第二點擊組)交聯第一聚合物和第二聚合物而形成。

在另一個實施方案中，可以分別通過兩性離子單體(例如cbma)和第一共聚單體和第二共聚單體的共聚制備第一和第二互補反應性(例如，點擊反應性)聚合物。第一共聚單體包含第一反應基團(例如進一步包含第一反應基團如點擊反應基團的兩性離子單體)。第二共聚單體包含第二反應基團(例如進一步包含第二反應基團如點擊反應基團的兩性離子單體)。可以在需要高度官能化的情況下使用該共聚策略，例如用于制備高強度可注射水凝膠以模擬軟骨或其它組織。通過這些方法，保持聚合物的官能度和總體兩性離子特性。該策略如圖解2所示。

圖解2。通過共聚用互補可點擊基團r和r*官能化的聚(羧基甜菜堿)共聚物(步驟2a和2b)和通過將其混合形成的所得水凝膠。

參看圖解2路徑2a，通過將兩性離子單體(表示為cb單體)(例如cbma)和包含第一反應基團(即進一步包含第一反應(例如，第一點擊反應)基團的兩性離子共聚單體)的第一共聚單體(表示為cb-點擊單體)的共聚制備第一兩性離子共聚物。參看圖解2路徑2b，通過將兩性離子單體(表示為cb單體)(例如cbma)和包含第二反應基團(例如，進一步包含第二反應(例如，第二點擊反應)基團的兩性離子共聚單體)的第二共聚單體(表示為cb-點擊單體)的共聚制備第二兩性離子共聚物，如2a所示。水凝膠通過互補的第一和第二反應基團(例如，互補的第一和第二點擊反應基團)交聯第一聚合物和第二聚合物而形成。

在另外的實施方案中，兩性離子聚合物可用互補反應(例如，點擊反應)基團端基官能化。參見圖解3。這些端基官能化的聚合物可以與圖解1和2中所示的聚合物和共聚物一起使用。端基官能化的聚合物的制備和通過將其混合形成的水凝膠示于圖解3中。

圖解3.端基官能化的聚合物和由聚合物形成的水凝膠。

參看圖解3路徑3a，用第一反應基團(例如，第一點擊反應基團)端基官能化第一兩性離子聚合物。參看圖解3路徑3b，用第二反應基團(例如，第二點擊反應基團)端基官能化第二兩性離子聚合物。水凝膠通過互補的第一反應基團和第二反應基團(例如，互補的第一點擊反應基團和第二點擊反應基團)交聯第一聚合物和第二聚合物而形成。

將上述交聯(水凝膠形成)化學過程描述為互補反應基團(即第一反應基團和第二反應基團)之間的反應。應當理解，互補的反應基團可以是具有適于鍵形成的反應性，優選適于在室溫和生理溫度之間的溫度下的鍵形成的反應性的任何反應基團對。在某些實施方案中，互補反應基團是本領域眾所周知的點擊基團(點擊反應對)。

使用上述策略形成的代表性的兩性離子點擊水凝膠在實施例1-6中闡明。

水凝膠可以采用有或無生物化合物的支架、可注射水凝膠或納米凝膠的形式。在某些實施方案中，本發明的水凝膠進一步包含包封的小分子、納米材料、核酸、多糖、蛋白質和細胞。這種水凝膠應用于醫學和藥物檢測、矯形外科、心血管科、內部眼科、美容、眼部和藥物/蛋白質/藥物遞送。水凝膠可以附著在用于醫療和工程應用的表面。除了形成水凝膠之外，官能化的兩性離子聚合物也可以附著在生物或非生物分子和基質上。此外，對于可官能化的聚羧酸甜菜堿(pcb)聚合物，聚合物可以以可降解或不可降解的方式直接綴合，而支鏈可以用丙烯酰胺、噁唑啉和乙烯基吡咯烷酮代替。

本發明的水凝膠可用于物件、裝置和組件，例如可植入的生物傳感器；傷口護理裝置、膠和密封劑、接觸透鏡；牙科植入物、矯形裝置例如人工關節、人工骨、人工韌帶和人工腱；心血管裝置例如導管、人工瓣膜、人工血管、人工支架、lvad或節律管理裝置；胃腸病學裝置(例如飼管、消化道夾、胃腸套)或胃氣囊；ob/gyn裝置，例如植入式生育控制裝置或陰道吊帶；腎臟裝置例如吻合連接器或皮下港；神經外科裝置，例如神經引導管，腦脊液引流管或分流器，皮膚病學裝置例如皮膚修復裝置，眼科裝置例如分流器，耳鼻喉科裝置如支架、耳蝸植入物、管、分流器或擴張器，眼內透鏡；美容植入物，例如乳房植入物，鼻植入物和臉頰植入物；神經學植入物例如神經刺激裝置、耳蝸植入物和神經導管；激素控制植入物，例如血糖傳感器和胰島素泵；植入的生物傳感器；接入端口裝置；以及組織支架肺部裝置，例如用于copd或人工肺的管理的瓣膜；放射學裝置，例如射線不透性或超聲不透性標記物；或泌尿裝置，例如導管或人工尿道。

以下是本發明的代表性水凝膠及其用于細胞培養和組織支架的用途的描述。

用于胰島包封的官能化的兩性離子聚合物基水凝膠。通過atrp和點擊化學的組合合成cbma，通過cbma的聚合制備的官能化的星形聚(羧基甜菜堿)聚合物(pbb)。合成硫醇基封端的pcb聚合物，并在生理條件下將硫醇封端的pcb與1,2-雙(馬來酰亞胺基)乙烷一起混合形成pcb水凝膠。

如圖1所示進行通過atrp的星形pcb聚合物的合成。簡言之，將cbma、2,2'-聯吡啶(bpy)、催化劑、四官能引發劑、季戊四醇四(2-溴異丁酸酯)置于10ml反應管中，并將混合物進行三次冷凍-泵-解凍(freeze-pump-thaw)循環。將混合物保持在室溫下20分鐘，并以1:1的比例加入水和甲醇。在室溫下攪拌使反應繼續進行8小時。在用氧化鋁處理后回收聚合物產物，且最后通過兩次沉淀到丙酮中純化。可以通過單體和引發劑之間的化學計量比調節聚合物的分子量。合成分子量為5000、20,000和50,000的星形聚合物。其它活性聚合法，如raft也可以應用于合成聚合物。通過點擊化學制備官能化的星形pcb聚合物。如圖2所示，純化后，通過與疊氮化鈉在水中的親核取代反應將初始形成的星形pcb的末端溴基轉化為疊氮基。產物通過透析純化。使用凍干法去除水分。然后在甲醇中以cubr/pmdeta為催化劑使pcb-n3(pcb-疊氮化物)鏈與炔-sh反應，以生成具有四臂的星形pcb聚合物。如圖2所示，純化后通過透析和凍干獲得硫醇封端的星形pcb。

圖3a和3b示意性地示出了由本發明的適當地官能化的星形聚合物制備的本發明的代表性水凝膠的制備。圖3a示出了本發明的兩種代表性星形聚合物的合成：(a)具有以硫醇基(-ch2-sh)封端的兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的星形聚合物，表示為pcb-a；和(b)具有以吡啶基二硫基(-ch2-s-s-c5h4n)封端的兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的星形聚合物，表示為pcb-b。這些星形聚合物由圖1所示的星形聚合物通過點擊化學(星形聚合物與疊氮化鈉和(a)3-硫代乙炔或(b)3-吡啶基二硫乙炔(3-pyridyldisulfideacetylene)的反應)來制備。圖3b示出了由圖3a所示的星形聚合物(pcb-a和pcb-b)的反應制備的本發明的代表性水凝膠的制備。水凝膠可以通過在細胞存在下簡單地混合pcb-a與pcb-b來形成。

評估pcb水凝膠中的體外胰島包封和分析。在rpmi-1640培養基中將大鼠胰島與5％硫醇封端的pcb-a(mw＝15000)混合。然后，向混合物中加入1,2-雙(馬來酰亞胺基)乙烷，并使體系在37℃下固化5分鐘。在37℃下用補充10％fbs的rpmi-1640培養基培養水凝膠包封的胰島和對照胰島，培養基每兩天更換一次。如圖4a所示，體外培養18天后，包封的胰島表現出非常高的活力。用培養基中的葡萄糖消耗來衡量在培養物中保存的水凝膠包封的胰島的代謝活性。葡萄糖代謝主要通過培養的胰島在培養基中的葡萄糖利用率進行衡量，并且不僅顯示為用于胰島活力的指標而且還顯示為用于細胞活性的指標。在18天的期間內每48小時測定培養基中葡萄糖的攝取量，以評估胰島質量。包封胰島中的葡萄糖攝取量保持在第1天水平的近100％直到第18天(圖4b)。在對照胰島中，葡萄糖消耗量在第7天下降到72％，并且隨著時間的推移進一步下降。到第14和18天，分別利用僅59％和38％的葡萄糖。總的來說，與對照胰島相比，包封的胰島保持高得多的代謝活性(p<0.01)。為了量化胰島素的生物合成能力，將培養的胰島在低(3mm)或高(17mm)葡萄糖培養基中在第0天和第18天孵育18小時(圖4b)。在高和低葡萄糖暴露(p＝0.13-0.40)下，水凝膠包封的胰島均保持新鮮分離的胰島的胰島素分泌水平(第0天)。相反，在第18天測試的對照培養的胰島中沒有保持葡萄糖反應性(p<0.05，對比第0天的對照物和第18天的包封的胰島)。對照胰島的胰島素儲存/分泌能力下降也通過在第18天通過雙硫腙(dtz)的胰島素染色降低來顯示(圖4c)。為了進一步評估β細胞功能，在使用或不用水凝膠包封培養18天的胰島的灌注系統中測試動態葡萄糖刺激的胰島素的釋放。雖然在第0天在包封和對照樣品中均存在相同數量的胰島，但是對照組中的胰島隨著時間的推移分解，并且沒有顯示刺激的胰島素分泌。相反，包封的胰島對葡萄糖刺激反應良好(圖4d)。

水凝膠也可以通過混合兩種不同的聚合物而形成。例如，如圖3a所示，通過atrp和點擊化學的組合合成硫醇封端的pcb-a和吡啶基二硫化物封端的pcb-b。水凝膠可以通過在生理條件下將pcb-a與pcb-b混合而形成(參見圖3b)。因為水凝膠可以在生理條件下形成，所以可以在膠凝過程中加入諸如干細胞、免疫細胞、神經細胞、激素分泌細胞和心臟細胞的細胞，以被包封在水凝膠中。此外，由于水凝膠用二硫鍵交聯，所以水凝膠可被生物制劑如半胱氨酸降解。

用于外周血干細胞(pbsc)細胞包封的官能化的兩性離子聚合物基水凝膠。如上文關于大鼠胰島細胞所述的，外周血干細胞(pbsc)細胞也包封在本發明的代表性水凝膠中。

圖5a和5b示出在本發明的代表性水凝膠(pcb水凝膠)中培養的包封的外周血干細胞(pbsc)細胞的數據。圖5a示出水凝膠模量隨時間的變化(水凝膠降解)。圖5b是顯示在7天體外培養后在pcb水凝膠內對包封的pbsc細胞進行的live/dead檢測的結果的圖像。

本發明的水凝膠還可進一步包含通過本發明的方法有利地給予的組分或添加劑。

在某些實施方案中，水凝膠進一步包含細胞。在這些實施方案中，細胞包含在或包封在水凝膠中。包封在水凝膠中的細胞的性質不受限制(天然細胞和基因修飾的細胞，以及其粉碎物)。有利地包封在水凝膠中的代表性細胞包括外分泌上皮細胞、激素分泌細胞、角質化上皮細胞、濕分層屏障上皮細胞、感覺傳導細胞、自主神經元細胞、感覺器官和外周神經元支持細胞、神經元和膠質細胞、晶狀體細胞、肝細胞、脂肪細胞、脂細胞、屏障功能細胞、腎細胞、心臟細胞、細胞外基質細胞、收縮細胞、血液和免疫系統細胞如紅細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞、t細胞、干細胞、生殖細胞、滋養細胞、間質細胞、祖細胞、造血干細胞。

在某些實施方案中，水凝膠還包含病毒。在這些實施方案中，病毒包含在或包封在水凝膠中。代表性病毒包含逆轉錄病毒和腺病毒。

在某些實施方案中，水凝膠還包含細菌。在這些實施方案中，細菌包含在或包封在水凝膠中。代表性細菌包含梭菌的種、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌。

有利地包封在水凝膠中的其它材料包含蛋白質、肽、核酸(寡核苷酸)、多糖、小分子(即分子量小于約800g/摩爾的有機、無機和有機金屬化合物)和納米材料。代表性的蛋白質包含抗體、抗體片段、酶(例如治療性和保護性酶)和肽。代表性的核酸包含dna(例如cdna)和rna(例如，sirna，mrna)。代表性的小分子包含其它治療劑和診斷劑(例如熒光和磁共振成像劑)。代表性的納米材料包含碳納米結構(例如碳納米管和石墨烯)和量子點。

有利地包封在水凝膠中的其它材料包括脂質復合物、聚合物囊泡、聚合復合物、樹狀聚合物和無機顆粒。

在某些實施方案中，水凝膠用可降解的交聯劑交聯。代表性的可降解交聯劑包含肽、多糖、酸酐交聯劑、二硫化物交聯劑和聚酯交聯劑。在這些實施方案中，可以將水凝膠設計成在特定環境(例如，生理條件)下降解，例如通過酶的水解或消化降解。

在某些實施方案中，本發明的水凝膠由官能化的兩性離子聚合物制備并具有式(j)：

其中

(c1)和(c2)是核，并且獨立地選自丙烯酸酯官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；胺官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；酰胺官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；環氧官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；c1-c6烷基和c6-c12芳基；或其它大分子核；

y1和y2是連接基團，獨立地選自-o(ch2)n-、-s(ch2)n-、-c(＝o)(ch2)n-、-c(＝s)(ch2)n-、-c(＝nh)(ch2)n-、-nh(ch2)n-、-(ch2)nc(＝o)-、-(ch2)noc(＝o)-、-(ch2)nnhc(＝o)-、-(ch2)nnhc(＝s)-、-(ch2)n-c(＝o)-、-(ch2)nsc(＝s)-、-(ch2)nnh-c(＝nh)-、-(ch2)nc(＝o)nhnh-，其中n為1至20的整數，以及可由上述定義的官能團x形成的其它連接；

r1-r8如上文關于(a)所述的；

r9-r16分別如上文關于r1-r8所述的；

m如上文關于(a)所述的；

n是m；

k1和k2獨立地如上文關于(a)的k所述的；

a1是c、so、so2、p或po^-；

a2是c、so、so2、p或po^-；

m為5至約10,000的整數；

n為5至約10,000的整數；

nc1和nc2是核重復度，并且是獨立地選自2至1000的整數；和

q是nc1和nc2中間的整數。

在其它實施方案中，本發明的水凝膠由官能化的兩性離子聚合物制備并具有式(k)：

其中取代基的定義如上文關于(j)所述的，p^-如關于(b)的q^-所述的，且r17和r18是官能團，并且獨立地選自由(b)的r9所定義的基團。

在某些實施方案中，本發明的水凝膠由官能化的混合電荷共聚物制備并具有式(l)：

其中

(c1)和(c2)是核，并且獨立地選自丙烯酸酯官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；胺官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；酰胺官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；環氧官能化的c1-c6烷基和c6-c12芳基；c1-c6烷基和c6-c12芳基；或其它大分子核；

y1和y2是連接基團，且獨立地選自-o(ch2)n-、-s(ch2)n-、-c(＝o)(ch2)n-、-c(＝s)(ch2)n-、-c(＝nh)(ch2)n-、-nh(ch2)n-、-(ch2)nc(＝o)-、-(ch2)noc(＝o)-、-(ch2)nnhc(＝o)-、-(ch2)nnhc(＝s)-、-(ch2)n-c(＝o)-、-(ch2)nsc(＝s)-、-(ch2)nnh-c(＝nh)-、-(ch2)nc(＝o)nhnh-，其中n為1至20的整數，以及可由上述定義的官能團x形成的其它連接；

r1-r10如上文關于(e)所述的；

r11-r20如上文關于對應的r1-r10所述的；

m1和m2獨立地如上文關于(k)的m所述的；

n1和n2獨立地如上文關于(k)的n所述的；

k1和k2獨立地如上文關于(k)的k所述的；

a1是c、so、so2、p或po^-；

a2是c、so、so2、p或po^-；

m為5至約10,000的整數；

n為5至約10,000的整數；

nc1和nc2是核重復度，并且是獨立地選自2至1000的整數；和

q是nc1和nc2中間的整數。

在其它實施方案中，本發明的水凝膠由官能化的混合電荷共聚物制備并具有式(m)：

其中取代基的定義如上文關于(l)所述的，p^-如關于(f)的q^-所述的，r21和r22為官能團且獨立地選自由(f)的r8所定義的基團。

用兩性離子或混合電荷聚合物水凝膠處理的表面

另一方面，本發明提供了已用本發明的兩性離子或混合電荷水凝膠處理的表面。本發明的水凝膠在某些實施方案中可水解成兩性離子聚合物或混合電荷共聚物，其可有利地用作各種裝置，包括例如醫療裝置的表面的涂層。

本發明的水凝膠有利地用于涂覆表面以提供生物相容的、抗微生物的和不結垢的表面。因此，在另一方面，本發明提供了具有表面(即一個或多個表面)的裝置和材料，該表面上已施加(例如，涂覆、共價偶合、離子締合、疏水締合)一種或多種本發明的交聯的兩性離子水凝膠。可有利地用本發明的水凝膠處理、改性成包含本發明的水凝膠、或摻入本發明水凝膠的代表性的裝置和載體包括：

顆粒(例如，納米顆粒)，其具有用本發明的水凝膠處理、改性成包含或摻入本發明水凝膠的表面；

藥物載體，其具有用本發明的材料處理、改性為包含或摻入本發明材料的表面；

非病毒基因遞送系統，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明水凝膠的表面；

生物傳感器，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明水凝膠的表面；

用于生物處理或生物分離的裝置，例如用于微生物懸浮、激素分離、蛋白質分級、細胞分離、廢水處理、寡糖生物反應器、蛋白質超濾和乳品加工的膜，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面；

可植入的傳感器，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面；

皮下傳感器，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面；

植入物，例如乳房植入物、耳蝸植入物和牙科植入物，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面；

接觸透鏡，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面；

組織支架，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面；

可植入的醫療裝置，例如人工關節、人工心臟瓣膜、人工血管、起搏器、左心室輔助裝置(lvad)、動脈移植物(arterygraft)和支架，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面；和

醫療裝置，例如耳引流管、飼管，青光眼引流管、腦積水分流器、人工角膜、神經引導管、導尿管、組織粘合劑和x射線引導器，其具有用本發明的水凝膠處理、改性為包含或摻入本發明的水凝膠的表面。

可有利地用本發明的水凝膠處理、改性成包含本發明的水凝膠、或摻入本發明水凝膠的其它代表性的基質和表面包括織物，例如衣服(例如，外套、襯衫、褲子、內衣，包括醫院工作人員和軍人穿戴的)、床上用品(如毯子、床單、枕套、床墊和枕頭)、毛巾和抹布。

可有利地用本發明的水凝膠處理、改性成包含本發明的水凝膠、或摻入本發明的水凝膠的其它代表性的基質和表面包括工作表面，例如桌面、書桌和臺面。

本發明的水凝膠可涂覆在包括物件、裝置和組件的表面的各種表面，這些物件、裝置和組件例如是可植入的生物傳感器；傷口護理裝置，膠和密封劑、接觸透鏡；牙科植入物；矯形裝置例如人工關節、人工骨、人工韌帶和人工腱；心血管裝置例如導管、人工瓣膜、人工血管、人工支架、lvad或/和節律管理裝置；胃腸病學裝置例如飼管、消化道夾、胃腸套或胃氣囊；ob/gyn裝置，例如植入式生育控制裝置或陰道吊帶；腎臟裝置例如吻合連接器或皮下港；神經外科裝置，例如神經引導管、腦脊液引流管或分流器，皮膚病學裝置例如皮膚修復裝置，眼科裝置例如分流器，耳鼻喉科裝置如支架、耳蝸植入物、管、分流器或擴張器，眼內透鏡；美容植入物，例如乳房植入物、鼻植入物和臉頰植入物；神經學植入物例如神經刺激裝置、耳蝸植入物和神經導管；激素控制植入物，例如血糖傳感器和胰島素泵；植入生物傳感器；接入端口裝置；以及組織支架肺部裝置，例如用于copd或人工肺的管理的瓣膜；放射學裝置，例如射線不透性或超聲不透性標記物；或泌尿裝置，例如導管或人工尿道。

原位兩性離子和混合電荷聚合物水凝膠

另一方面，本發明提供了用于制備兩性離子或混合電荷聚合物水凝膠的方法。在某些實施方案中，該方法是原位方法，例如體內方法的原位方法，其中將適當官能化的兩性離子星形聚合物或適當官能化的混合電荷星形共聚物引入到期望水凝膠位于的環境中。由于官能化的兩性離子星形聚合物或官能化混合電荷星形共聚物的互補官能團，聚合物或共聚物被交聯以在原位提供水凝膠。

當環境是體內位置時，可通過例如注射將官能化的兩性離子星形聚合物或官能化的混合電荷星形共聚物引入到期望的部位。

通過這種方法，水凝膠及其添加的承載物(addedcargo)可以有利地在期望的體內部位形成。

在某些實施方案中，給予各自具有反應對的官能團(例如，帶有第一官能團的第一聚合物和帶有第二官能團的第二聚合物，第一官能團和第二官能團相互之間有反應活性以將第一聚合物共價偶聯到第二聚合物)的本發明的兩種適當官能化的兩性離子聚合物，使得兩種聚合物在組合或在原位彼此接觸(例如，在期望的部位注射后在體內)時，反應形成水凝膠。

在其它實施方案中，給予各自具有反應對的一個官能團(例如，帶有第一官能團的第一聚合物和帶有第二官能團的第二聚合物，第一官能團和第二官能團相互之間有反應活性以將第一聚合物共價偶聯到第二聚合物)的本發明的兩種官能化的混合電荷共聚物，使得兩種聚合物在組合或在原位(例如，在期望的部位注射后在體內)彼此接觸時，反應形成水凝膠。

兩性離子和混合電荷星形聚合物治療劑綴合物

另一方面，本發明提供兩性離子和混合電荷聚合物和共聚物，其具有共價偶聯至其的治療劑。這些綴合物對于治療劑遞送是有用的。通過水解從本發明的聚合物控制釋放治療劑。

以下是本發明的代表性綴合物和從綴合物釋放治療劑的描述。

圖6是代表性治療劑從具有兩性離子(聚羧基甜菜堿)支鏈的本發明的代表性星形聚合物釋放的示意圖。星形聚合物通過atrp由具有自由基引發劑基團的四官能化核和羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯治療劑單體(ch2＝c(ch3)-c(＝o)-ch2ch2-n(ch3)2⁺-ch2ch2-co2-治療劑)制備。在所示的代表性星形聚合物中，通過與cbma的延伸聚合進一步延伸支鏈，以提供除了帶有治療劑的結構單元之外，還具有兩性離子結構單元的支鏈。圖6所示的星形聚合物是嵌段共聚物。應當理解，在某些實施方案中，星形聚合物是通過兩性離子單體(例如cbma)和兩性離子治療劑單體(例如cbma-治療劑)的共聚制備的無規共聚物。在星形聚合物水解時，釋放所述治療劑。星形聚合物的水解和治療劑的釋放使星形聚合物中的兩性離子結構單元再生。如圖6所示，治療劑是布洛芬，并且通過cbma與布洛芬的縮合制備用于合成能釋放布洛芬的星形聚合物的單體。

如圖6所示，通過在二氯甲烷(dcm)中與二環己基碳二亞胺(dcc)攪拌，通過酸酐形成反應將布洛芬摻入到羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯(cbma)中以提供可聚合的單體。從單體制備4臂星形兩性離子聚合物以提供聚合物治療劑綴合物。如圖6所示，通過水解釋放治療劑。水解后得到的聚合物轉化成其對應的兩性離子聚合物。

除非另外指出，在說明書和權利要求書中使用的表示成分數量、例如分子量、反應條件等的性質的所有數字應被理解為在所有情況下被術語“約”修飾。因此，除非有相反指示，在說明書和所附權利要求書中列出的數值參數是近似值，其可以根據本發明尋求獲得的期望的性質而變化。作為最低限度，并且不試圖限制將等同原則適用于權利要求的范圍，每個數值參數至少應根據報告的有效數字的數和通過應用常規舍入技術來解釋。當需要進一步的澄清時，術語“約”具有本領域技術人員在結合所述數值或范圍使用時合理地歸因于其的含義(即表示稍微多于或稍低于所述值或者范圍，在所述值的±20％、所述值的±19％、所述值的±18％、所述值的±17％、所述值的±16％、所述值的±15％、所述值的±14％、所述值的±13％、所述值的±12％、所述值的±11％、所述值的±10％、所述值的±9％、所述值的±8％、所述值的±7％、所述值的±6％、所述值的±5％、所述值的±4％、所述值的±3％、所述值的±2％、或所述值的±1％的范圍內)。

盡管列出本發明寬泛范圍的數值范圍和參數是近似值，但是在具體實施例中列出的數值盡可能精確地報告。然而，任何數值固有地包含必然由其各自試驗測量中存在的標準偏差導致的某些誤差。

給出以下實施例的目的在于說明而不是限制本發明。

實施例

實施例1

代表性水凝膠：第一兩性離子聚合物和第二兩性離子聚合物聚合物環辛炔/疊氮化物化學過程

在本實施例中，本發明的代表性水凝膠由第一兩性離子聚合物和第二兩性離子聚合物制備。第一聚合物包含側面的第一反應基團(即環辛炔)，且第二聚合物包含側面的第二反應基團(即疊氮化物)。

在沒有任何外部刺激的情況下混合兩種聚合物以提供水凝膠。

第一聚羧基甜菜堿聚合物和第二聚羧基甜菜堿聚合物的形成和由聚合物形成的水凝膠如下所示。

使用已知的edc/nhs偶聯，分別在與環辛炔胺和疊氮基胺的兩種不同的反應中官能化聚羧酸甜菜堿(pcb)聚合物。首先通過edc/nhs化學過程活化pcb聚合物，然后在thf中通過沉淀純化聚合物。然后用各種胺處理活化的聚合物。聚合物再次在thf中通過沉淀純化。將純化的聚合物在真空下干燥。官能化程度由¹h和¹³cnmr表征。混合這兩種官能化的pcb聚合物，然后進行點擊反應以形成水凝膠。官能化程度以及由此的交聯程度可容易地通過改變反應性胺的量而改變。

實施例2

官能化的兩性離子共聚物

在本實施例中，描述了本發明的代表性官能化的兩性離子共聚物的制備。代表性官能化的共聚物包含側基(即n-羥基琥珀酰亞胺基團)，其實現另外的活化基團(互補反應基團)的共價偶聯以提供用于形成本發明的水凝膠的可交聯聚合物。

用n-羥基琥珀酰亞胺(nhs-cbma)官能化羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯單體(cbma)。該單體與羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯單體(cbma)共聚(參見圖解3)。所得聚合物是cbma和nhs-cbma的無規聚合物。共聚反應如下所示。

可以改變兩種單體的進料比，以提供具有不同官能度的官能化的聚合物。活化的聚合物可容易地用合適的胺進一步官能化，促進圖解1中的步驟1a和1b。

首先合成nhs活化的羧基甜菜堿單體。按不同的進料比將該單體與羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯一起聚合。所得的聚合物已經被活化。通過在thf中沉淀純化該聚合物以去除所有小分子雜質(例如未反應的單體、引發劑)，然后真空干燥。用¹h和¹³cnmr表征聚合物。

實施例3

代表性水凝膠：第一兩性離子聚合物和第二兩性離子聚合物硫醇/馬來酰亞胺化學過程

在本實施例中，本發明的代表性水凝膠由第一兩性離子聚合物和第二兩性離子聚合物制備。第一聚合物包含側面的第一反應基團(即硫醇)，且第二聚合物包含側面的第二反應基團(即馬來酰亞胺)。

第一聚羧基甜菜堿聚合物和第二聚羧基甜菜堿聚合物的形成如下所示。

羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯和馬來酰亞胺官能化的cbma單體的無規共聚物的合成如下所示。

羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯和乙硫醇官能化的cbma單體的無規共聚物的合成如下所示。

在沒有任何外部刺激的情況下混合兩種聚合物提供水凝膠。

首先用互補可點擊基團合成官能化的羧基甜菜堿單體。將該官能化的單體與cbma單體無規聚合。作為代表性實例，使用基于馬來酰亞胺基和硫醇的胺合成馬來酰亞胺和硫醇官能化的cbma單體。通過在thf中沉淀純化聚合物以去除未反應的單體。通過nmr(¹h和¹³c)確定聚合物的組成。通過調節進料比改變聚合物中官能化單元的量。因此，合成互補的可點擊聚合物。將這些聚合物在水中以5-10wt％混合以形成水凝膠。

實施例4

代表性的兩性離子共聚物：硫醇側基

在本實施例中，通過保留羧酸鹽上的負電荷的銨部分的改性合成改性的羧基甜菜堿單體以提供硫醇官能化的兩性離子單體。

用以提供官能化的兩性離子共聚物的cbma和改性的cbma單體的共聚合如下所示。

這樣的單體具有高交聯率的優點。可以獲得類似的單體和共聚物用于相應的點擊基團對應物以完成圖解2所示的過程。

實施例5

代表性兩性離子共聚物水凝膠：胰島包封

在本實施例中，描述了使用代表性兩性離子聚合物的胰島包封。

通過atrp和“點擊”反應的組合合成官能化的星形pcb聚合物。合成具有不同分子量的馬來酰亞胺和巰基封端的pcb聚合物。通過在生理條件下將馬來酰亞胺封端的pcb(pcb-a)與硫醇封端的pcb(pcb-b)混合在一起形成pcb水凝膠。可以通過調整聚合物的分子量和使用的聚合物的量來調節水凝膠的機械性能、平衡水含量(ewc)和孔徑尺寸。

通過atrp合成星形pcb聚合物。將cbma、2,2'-聯吡啶(bpy)、催化劑、四官能引發劑、季戊四醇四(2-溴異丁酸酯)置于10ml反應管中，并將混合物進行三次冷凍-泵-解凍循環。將混合物保持在室溫下20分鐘，并以1:1的比例加入水和甲醇。在室溫下在攪拌使反應繼續進行8h。在用氧化鋁處理后回收聚合物產物，且最后通過兩次沉淀到丙酮純化。可以通過單體和引發劑之間的化學計量比調節聚合物的分子量。合成重均分子量為5000、20000和50000的星形聚合物。其它活性聚合法如可逆加成斷裂鏈轉移(raft)也可以用于合成聚合物。

通過點擊化學過程合成官能化的星形pcb聚合物。純化后，通過在水中與疊氮化鈉的親核取代反應將星形pcb的末端溴基團轉化為疊氮基。產物通過透析純化。使用凍干法去除水分。然后在甲醇中以cubr/pmdeta作為催化劑使pcb-n3鏈與含炔化合物反應，以生成具有臂數量為4的星形pcb聚合物。純化后通過透析和凍干獲得硫醇封端的星形pcb(pcb-a)和馬來酰亞胺封端的星形pcb(pcb-b)。

膠凝性能的無胰島評估。在37℃下在pbs中通過與各種聚合物重量百分含量的pcb-b溶液一起添加pcb-a形成pcb凝膠。參見例如圖3。用蒸餾水徹底洗滌所得水凝膠以去除未反應的聚合物。在37℃下使用重量法測定水凝膠的ewc。通過精密度為±0.1℃的恒溫水浴控制溫度。將樣品浸入0.1mpbs緩沖溶液(ph7.4)中至少24小時，然后取出，用濕濾紙吸干以去除表面上的水，在微量天平上稱重。交聯后，使水凝膠在pbs中自由溶脹24小時。

pcb水凝膠的體外胰島功能評估。在體外測試pcb水凝膠的生物相容性。檢測pcb水凝膠中包封的豬胰島的活力和功能。此外，檢測pcb水凝膠對補體系統、淋巴細胞、單核細胞、血小板和pmn的活化以及細胞因子產生的抑制作用。

胰島活力評估。通過發光強度定量監測豬胰島的活力。將水凝膠包封的胰島或從豬分離的對照胰島(100個胰島/孔)培養長達28天，并通過將0.75mg/mld-螢光素加入到胰島培養基中使用xenogen圖像系統(caliperlifesciences，hopkinton，ma)測定發光強度。在期望的時間點也使用活/死染色定性評估胰島活力。通過在含有0.24mm熒光素二乙酸酯和7.5mm碘化丙啶(propidiumiodide)的pbs中孵育裝載有細胞的水凝膠進行活/死染色10分鐘。然后在pbs中洗滌水凝膠，并通過熒光顯微鏡(olympusix50，olympusamerica，centralvalley，pa)成像。

胰島培養期間的葡萄糖消耗。在培養基更換期間每48小時收集培養基，并一式兩份用onetouch葡萄糖計(lifescan，milpitas，ca)監測葡萄糖水平，并取均值。用沒有胰島的對照培養基(ct)作為每個時間點的對照。將第一個48小時內的有(i0)和無(c0)胰島的培養基葡萄糖水平的差異(c0-i0)設為每個樣品的基線細胞葡萄糖消耗。具有胰島的樣品(it)中葡萄糖水平的隨后變化計算如下：葡萄糖攝取百分比＝(ct-it)*100/(c0-i0)。

對葡萄糖刺激的胰島素和c-肽釋放的長期反應。14天后在培養物中手選如上所述的在有或無水凝膠的情況下培養的胰島，并將其收集于微管(單胰島/管，sexplicate)中，用補充有5％fbs的含3mm葡萄糖(低葡萄糖培養基)的rpmi1640培養基洗滌3次。根據制造商的說明書，將胰島在含有低葡萄糖或高葡萄糖(17mm葡萄糖)培養基的無組織培養物包被的96孔板中培養16小時，此時使用豬胰島素和豬c-肽elisa試劑盒(mercodia，winstonsalem，nc)測定上清培養基中的胰島素和c-肽的濃度。

通過灌注對葡萄糖刺激的胰島素釋放的短期反應的試驗。如前所述，在有或無水凝膠的情況下培養胰島(在第0天200個胰島/樣品)。在第28天，收集胰島并在微柱中將其捕獲夾在微珠(biorad，hercules，ca)的雙層之間，并在37℃下用krebseringer緩沖液灌注45分鐘，隨后用低葡萄糖緩沖液(3mm葡萄糖)灌注10分鐘，高葡萄糖(17mm葡萄糖)緩沖液灌注15分鐘，并最后用低葡萄糖緩沖液灌注。從首個3mm培養基開始每2分鐘收集流出液。根據制造商的方案，使用用于豬胰島素的酶聯免疫吸附測定(elisa)試劑盒(mercodia，winstonsalem，nc)分析實驗中收集的培養基樣品或流出物的胰島素濃度。

實施例6

代表性兩性離子共聚物水凝膠：t細胞包封

通過atrp、“點擊”反應和綴合的組合合成官能化的星形pcb聚合物。在圖7中示意性地示出合成。

合成具有不同分子量的二氟化環辛炔部分(difo3)-封端的pcb聚合物。通過在生理條件下將二氟化環辛炔部分封端的pcb(pcb-a)與可生物降解的疊氮-gg-(ke)20-gpqgiwgq-(ke)20-gg-疊氮混合在一起形成pcb水凝膠。可以通過調節聚合物的分子量和使用的聚合物的量來調節水凝膠的機械性能、平衡水含量(ewc)和孔徑尺寸。

通過atrp合成星形pcb聚合物。將cbma、2,2'-聯吡啶(bpy)、催化劑、四官能引發劑、季戊四醇四(2-溴異丁酸酯)置于10ml反應管中，將混合物進行三次冷凍-泵-解凍循環。將混合物保持在室溫下20分鐘，并以1:1的比例加入水和甲醇。在室溫攪拌下使反應繼續進行8h。在用氧化鋁處理后回收聚合物產物，且最后通過沉淀到丙酮中兩次純化。可以通過單體和引發劑之間的化學計量比調節聚合物的分子量。合成重均分子量為5000、20000和50000的星形聚合物。其它活性聚合法如可逆加成斷裂鏈轉移(raft)也可以用于合成聚合物。

通過點擊化學過程合成官能化的星形pcb聚合物。純化后，通過在水中與疊氮化鈉的親核取代反應將星形pcb的末端溴基團轉化為疊氮基。產物通過透析純化。使用凍干法去除水。然后在甲醇中以cubr/pmdeta為催化劑使pcb-n3鏈與炔-nh2化合物反應，以生成具有臂數量為4的星形pcb聚合物。純化后通過透析和凍干獲得胺封端的星形pcb。得到的聚合物通過edc/nhs反應進一步與difo3反應，并在純化后通過透析和凍干獲得所得的聚合物。

水凝膠膠凝性能評估。在37℃下在pbs中通過與各種聚合物重量百分含量的上述肽的溶液一起添加difo3封端的pcb形成pcb凝膠。用蒸餾水徹底洗滌所得水凝膠以去除未反應的聚合物。在37℃下使用重量法測定水凝膠的ewc。通過精密度為±0.1℃的恒溫水浴控制溫度。將樣品浸入0.1mpbs緩沖溶液(ph7.4)中至少24小時，然后取出，用濕濾紙吸干以去除表面上的水，并在微量天平上稱重。交聯后，使水凝膠在pbs中自由溶脹24小時。

體外t細胞包封和pcb水凝膠中的活力測試。在體外測試pcb水凝膠的生物相容性。在凝膠化過程中將人外周血cd4⁺cd45ra⁺t細胞加入到混合溶液中。將t細胞包封水凝膠置于rpmi1640培養基+10％胎牛血清中并培養。培養7天后，通過mmp蛋白溶解水凝膠，并通過離心收集細胞。通過臺盼藍檢測pcb水凝膠中包封的t細胞的活力。在整個培養過程中發現幾乎100％的活力(見圖8)。

雖然已經示出和描述了示例性的實施例，但是將被理解的是，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，可以在其中進行各種改變。