用于增強免疫應答的方法和組合物與流程

發明領域

本發明涉及用于增強人類受試者中的免疫應答的方法和組合物。具體地，所述方法和組合物在人類受試者中提供對于針對免疫原的b細胞和t細胞活性的強誘導，所述方法和組合物可以用于在人類受試者中提供針對疾病諸如腫瘤或感染性疾病、更具體地為絲狀病毒感染的有效治療和/或保護。

背景技術：

疫苗可以用于提供針對病原體(諸如病毒、細菌、真菌或原生動物)以及癌癥的免疫保護。

感染性疾病為世界范圍內繼心血管疾病之后第二主要死亡原因，但是為嬰兒和兒童的主要死亡原因(lee和nguyen,2015,immunenetwork,15(2):51-7)。疫苗接種為用于預防多種感染性疾病的最有效的工具。疫苗接種的目標為產生病原體特異性免疫應答，從而提供針對感染的持久性保護。盡管疫苗已獲得大量成功，但是由于新病原體的出現、舊病原體的再次出現以及現有疫苗所賦予的次最佳保護而仍需要開發安全且強力的疫苗。最近重要的出現或再次出現的疾病包括：2003年的重度急性呼吸器官綜合癥(sars)、2009年的h1n1流感大流行以及2014年的埃博拉病毒。因此，需要開發針對新出現疾病的新穎且有效的疫苗。

癌癥為西方世界中的主要殺手之一，其中肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結腸直腸癌是最常見的(butterfield,2015,bmj,350:h988)。若干種癌癥治療的臨床方法為可用的，包括外科手術、化學療法、放射療法以及使用小分子信號傳導途徑抑制劑的治療。這些標準方法各自已顯示通過增加腫瘤內的腫瘤抗原的表達或者引起抗原從垂死腫瘤細胞中釋放并且通過促進治療益處的抗腫瘤免疫來調整抗腫瘤免疫。免疫療法為提供用于治療癌癥的替代方法的有前景領域。癌癥疫苗被設計為促進腫瘤特異性免疫應答，具體地為對腫瘤抗原特異的細胞毒性cd8+t細胞。必需提高臨床功效，以便使癌癥疫苗成為傳統癌癥治療的有效替代方案或補充方案。目前為止已進行適當的努力來更好地理解臨床上有效的癌癥疫苗的基本要求。最新數據強調的是，重要的要求以及其他要求為(1)使用多表位免疫原，其可能來源于不同腫瘤抗原；(2)選擇有效佐劑；(3)癌癥疫苗與藥劑締合能夠抵消腫瘤微環境中存在的調節環境；以及(4)需要在準確預先測試之后選擇確定疫苗制劑和方案以比較不同抗原制劑(fenoglio等，2013,humvaccinimmunother,(12):2543-7)。需要提供有免疫學功效和臨床功效的新一代癌癥疫苗來解決這些要求。

埃博拉病毒(諸如扎伊爾(zaire)埃博拉病毒(ebov)和蘇丹(sudan)埃博拉病毒(sudv))和近緣馬爾堡病毒(marv)與北美、歐洲和非洲的人類和靈長類動物中高致死性埃博拉出血熱(ehf)的爆發相關聯。這些病毒為已知感染人類和非人靈長類動物并伴隨嚴重健康后果(包括死亡)的絲狀病毒。絲狀病毒感染已在人類中導致高達90％的病例致死率。ebov、sudv和marv感染導致ehf，其中通常在感染后7至10天內發生死亡。ehf表現為急性發熱性綜合癥，其出現突然發熱、惡心、嘔吐、腹瀉、斑狀丘疹、不適、虛脫、增加的血管通透性的全身性體征、凝血功能異常以及先天性免疫應答調節障礙。大部分疾病似乎是由對感染的先天性免疫應答的調節障礙以及由血管內皮細胞中的病毒復制引起，所述病毒誘導宿主細胞的死亡和內皮屏障的破壞。絲狀病毒可通過小顆粒氣溶膠或通過與人類或nhp來源的感染血液、器官和體液直接接觸來傳播。據報道單個病毒粒子的感染足以在人類中引起埃博拉出血熱(ehf)。目前，不存在批準用于治療或預防ehf的治療劑或疫苗。支持性護理仍然是感染有絲狀病毒的個體的唯一批準的醫療干預。

作為嚴重人類疾病的原因，絲狀病毒作為天然感染的來源并且也作為可能的生物恐怖主義試劑而獲得持續關注。尚未明確鑒別出絲狀病毒在野外的儲層。已描述引起ehf的四種亞型的埃博拉病毒，即在扎伊爾、蘇丹、本迪布焦(bundibugyo)和象牙海岸地區的埃博拉病毒(sancheza.等，1996,pnasusa,93:3602–3607)這些亞型的埃博拉病毒具有相似的基因結構，例如含有七個線性排列的基因的負鏈rna病毒。結構基因產物包括例如以兩種替代形式存在的包膜糖蛋白、由rna編輯產生的分泌的可溶性糖蛋白(ssgp)和介導病毒進入的跨膜糖蛋白(gp)(sancheza.等，1996,pnasusa,93:3602–3607)。

已表明免疫可適用于針對埃博拉感染進行保護，因為埃博拉亞型內核苷酸多態性似乎比其他rna病毒更少(sancheza.等，1996,pnasusa,93:3602–3607)。直到最近，針對絲狀病毒的預防疫苗的發展已具有變化的結果，部分是因為對針對絲狀病毒感染的保護性免疫應答的要求知之甚少。另外，在天然儲層內循環的大量絲狀病毒使得設計針對所有種類的絲狀病毒進行保護的疫苗的努力復雜化。

目前，存在若干疫苗抗原遞送平臺，其在暴露于高感染劑量的絲狀病毒的非人靈長類動物(nhp)中證實有多種保護水平。疫苗候選物在發展中是基于多種平臺技術，包括具有復制能力的載體(例如水泡性口炎病毒；狂犬病病毒；副流感病毒)；不具有復制能力的載體(腺病毒、改性的安卡拉牛痘病毒)；包括細菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞中表達的病毒樣顆粒在內的蛋白質亞基；dna疫苗；和/或活的和殺死的減毒絲狀病毒(friedrich等，2012,viruses,4(9):1619-50)。ebov糖蛋白gp為針對暴露于相同種類的ebov進行保護的疫苗的必要組分。此外，包括來自ebov和sudv(兩種最致命種類的埃博拉病毒)的gp可保護猴子使其免于ebov和sudv肌內暴露，以及暴露于遠緣本迪布焦病毒(bdbv)、塔伊森林(forest)埃博拉病毒(tafv；以前稱為象牙海岸或科特迪瓦埃博拉病毒)種類。同樣，包括來自marv的gp可保護猴子使其免于肌內和氣溶膠marv暴露。用于這些病毒的醫學防護措施的發展為高度優先的，尤其是pan-絲狀病毒疫苗的發展—所述疫苗為針對全部致病絲狀病毒進行保護的一種疫苗。

復制缺陷型腺病毒載體(rad)為胞內免疫應答的強大誘導物并且因此已經充當基于基因的疫苗的載體，尤其是對于慢病毒屬和絲狀病毒以及其他非病毒病原體的疫苗(shiver等，2002,nature,415(6869):331-5；hill等，2010,humvaccin6(1):78-83；sullivan等，2000,nature,408(6812):605-9；sullivan等，2003,nature,424(6949):681-4；sullivan等，2006,plosmed,3(6):e177；radosevic等，2007,infectimmun,75(8):4105-15；santra等，2009,vaccine,27(42):5837-45)。

基于腺病毒的疫苗作為人類疫苗具有若干優勢，因為它們在gmp條件下可產生至高滴度并且已證明在人類中為安全的和免疫原性的(asmuth等，2010,jinfectdis201(1):132-41；kibuuka等，2010,jinfectdis201(4):600-7；koup等，2010,plosone5(2):e9015；catanzaro等，2006,jinfectdis,194(12):1638-49；harro等，2009,clinvaccineimmunol,16(9):1285-92)。盡管由于rad5在引起廣泛的抗體和cd8+t細胞應答中的顯著效能而使用所述rad5進行大多數初始疫苗工作，但是人類中預先存在的對rad5的免疫可限制功效(catanzaro等，2006,jinfectdis,194(12):1638-49；cheng等，2007,plospathog,3(2):e25；mccoy等，2007,jvirol,81(12):6594-604；buchbinder等，2008,lancet,372(9653):1881-93)。此性質可能限制rad5在許多疫苗的臨床應用中的使用，所述疫苗目前處在發展中并且包括埃博拉病毒(ebov)和馬爾堡病毒(marv)。

從腺病毒血清型26和血清型35衍生的復制缺陷型腺病毒載體rad26和rad35分別具有規避ad5預先存在的免疫的能力。rad26可在適于以大范圍且以臨床等級產生這些載體的ad5e1互補細胞系中生長至高滴度(abbink等，2007,jvirol,81(9):4654-63)，并且已顯示此載體在初免-加強疫苗策略中誘導體液介導和細胞介導的免疫應答(abbink等，2007,jvirol,81(9):4654-63；liu等，2009,nature,457(7225):87-91)。rad35載體在適于產生臨床等級的疫苗的細胞系上生長至高滴度(havenga等，2006,jgenvirol,87:2135-43)，并且已配制用于注射以及穩定的可吸入粉末(jin等，2010,vaccine28(27):4369-75)。這些載體顯示人類樹突狀細胞的高效轉導(degruijl等，2006,jimmunol,177(4):2208-15；lore等，2007,jimmunol,179(3):1721-9)，并且因此具有介導高水平的抗原遞送和呈遞的能力。

改性的安卡拉牛痘(mva)病毒與牛痘病毒有關，為痘病毒科中正痘病毒屬的成員。已知痘病毒因為其胞漿內表達而為cd8t細胞應答的良好誘導物。然而，它們不擅長于產生cd4mhcii類限制性t細胞(參見，例如haslett等，2000,journalofinfectiousdiseases,181:1264-72，第1268頁)。mva已被工程化為用作用于重組基因表達的病毒載體或用作重組疫苗。

為開發更安全的產物(諸如疫苗或藥物)，具有增強的安全性能的mva的病毒株已由bavariannordic育出。mva由bavariannordic進一步傳代并且指定為mva-bn，其代表樣品于2000年8月30日以登錄號v00083008儲存在歐洲細胞培養物保藏所(europeancollectionofcellcultures，ecacc；英國sp40jg，威爾特郡，索爾淄博里市，camr(camr,salisbury,wiltshiresp40jguk))。在wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中進一步描述mva-bn，所述兩份專利均以引用的方式整體并入本文。

mva-bn可連接并且進入人細胞，其中病毒編碼的基因非常有效地表達。mva-bn不具有復制能力，這意味著所述病毒并不在人類細胞中復制。在人類細胞中，表達病毒基因并且不產生感染病毒。根據美國疾病控制和預防中心，mva-bn被分類為生物安全等級1生物體。mva-bn和衍生物的制劑已施用至許多類型的動物和超過2000名人類受試者，包括免疫缺陷型個體。所有疫苗接種已經證明總體上安全并良好耐受的。盡管其高減毒作用和減少的毒性，在臨床前研究中已顯示mva-bn引發對疫苗和由克隆到mva基因組中的基因所編碼的異源基因產物的體液和細胞免疫應答兩者[e.harrer等(2005),antivir.ther.10(2):285-300；a.cosma等(2003),vaccine22(1):21-9；m.dinicola等(2003),hum.genether.14(14):1347-1360；m.dinicola等(2004),clin.cancerres.,10(16):5381-5390]。

對感染的保護性免疫依賴于先天性免疫應答和適應性免疫應答。適應性免疫應答包括由b細胞產生抗體(體液免疫應答)和cd8+效應t細胞(細胞免疫應答)與cd4+t細胞的細胞毒性活性，所述cd4+t細胞也稱為輔助性t細胞，其在體液免疫應答和細胞免疫應答中起到關鍵性作用。

cd4+t細胞被抗原刺激，以提供促進免疫應答的信號。cd4+t細胞通過細胞-細胞相互作用并釋放細胞因子來起作用，以幫助觸發b細胞活化和抗體產生、細胞毒性cd8+t細胞的活化和增殖以及巨噬細胞活性。

抗體介導的保護可以是歷時非常久的，并且在病原體接觸的時候存在的中和抗體可以預防而不是抵抗感染，從而實現‘消除性’免疫(swain等，2012,natrevimmunol,12(2):136-148)。在病毒感染之后，cd4+信號傳導為指導生發中心形成所必需的，其中cd4+細胞促進b細胞同種型轉換和抗體應答的親和力成熟以及b細胞記憶和長壽的產抗體漿細胞的產生。因此，cd4+細胞可能對于產生對大部分(如果不是所有的話)病原體的長久抗體應答和保護性免疫是重要的。

cd4+t細胞幫助初免的作用、效應物功能和cd8+t細胞的記憶在慢性感染的情況下，當cd8+t細胞取決于繼續的增殖循環時(對此而言，cd4+t細胞的細胞因子產生為關鍵的)是尤其重要的(swain等，2012,natrevimmunol,12(2):136-148)。

最新數據指示cd4+t細胞的作用進一步擴展超出細胞因子產生的作用。例如，cd4+t細胞可以將關鍵性淋巴樣群體募集到二級淋巴組織或病原體感染部位(sant和mcmichael,2012,jexpmed,209(8):1391-5)。確切地說，cd4+t細胞可以促進cd8+t細胞與二級淋巴組織中的樹突細胞接合，引起淋巴樣細胞流入到引流淋巴結中，并且將效應物募集到病毒復制部位。另外，cd4+t細胞還可以通過細胞溶解活性來防御病原體。

在分辨初次免疫應答之后或者在成功疫苗接種之后，大部分病原體特異性效應cd4+t細胞死亡，留下一小群長壽記憶細胞。記憶cd4+t細胞增強在組織中感染之后的早期先天性免疫應答，這有助于病原體控制(swain等，2012,natrevimmunol,12(2):136-148)。重要的是，cd4+t細胞提供對b細胞以及潛在地對cd8+t細胞的更快輔助，從而有助于產生更快且更強烈的免疫應答。

在免疫應答期間cd4+t細胞的功能范圍突出顯示了其在產生針對病原體的高效免疫保護方面的關鍵性作用。最新研究已提供cd4+t細胞作為抗病毒免疫中的直接效應物的新證據(sant等，2012,j.exp.med.209:1391-1395)。據報道預先存在的流感特異性cd4+t細胞與針對人類中的流感攻擊的疾病預防相關(wilkinson等，2012,naturemedicine,18:274-280)。

使用若干種測定來檢測免疫應答，所述測定包括例如elisa(酶聯免疫吸附測定)、elispot(酶聯免疫斑點法)和ics(細胞內細胞因子染色法)。elisa測定分析例如分泌型抗體或細胞因子的水平。當使用elisa測定來確定結合到特定抗原(體液免疫應答的指示物)的抗體水平時，它們還可反映cd4+t細胞活性，因為b細胞對高親和力抗體的產生取決于cd4+輔助t細胞的活性。elispot和ics為分析例如對特定抗原的t細胞應答的單細胞測定。elispot測定測量個別細胞的分泌活性，并且ics測定分析細胞內細胞因子的水平。cd4+特異性和cd8+特異性t細胞應答可以使用ics測定來確定。

存在使用動物諸如猴子和小鼠中的mva-ad初免-加強方案的出版論文的測試方法。然而，迄今為止沒有mva-ad初免-加強方案顯示比互補ad-mva初免-加強方案更有效地刺激免疫應答。例如，barouch等(2012,nature,482(7383):89-93)發現在猴子中，包含mva/ad26的異源方案“比ad26/mva或ad35/ad26相對更低效，所述ad26/mva或ad35/ad26使病毒載量設定點減小大于100倍”。具體地說，對于以0-24周時間表施用的mva/ad26初免-加強方案而言，在獼猴中對sivgag、pol和env的細胞免疫應答比相反的ad26/mva方案更不明顯，如通過ifn-γelispot和ics測定所測量的。對于mva/ad26方案而言，抗體應答也比ad26/mva方案更低效，如通過elisa測定所證明的，盡管程度較低。roshorm等(2012,eurjimmunol,42(12):3243-55)發現以0-4周時間表在小鼠中施用的mva/chadv68初免-加強方案并不比相反的chadv68/mva方案在誘導對hivgag的免疫應答方面更有效，如通過cd8+t細胞活性的ics測定所測量的。gilbert等(2002,vaccine,20(7-8):1039-45)發現以0-14周時間表在小鼠中施用的mva/ad5初免-加強方案比相反的ad5/mva方案在誘導對瘧原蟲cs的免疫應答方面稍微更低效，如通過elispot測定所測量的。當兩者均以0-10天時間表施用時，mva/ad5方案甚至比ad5/mva方案更低效。另外，mva/ad5方案在保護免疫小鼠使其免于攻擊性感染方面更低效(80％對比100％保護)。這些報道并未指示mva/ad方案可以在人類中引起比ad/mva方案更強的體液免疫應答和/或細胞免疫應答。

對于在人類中引發針對抗原蛋白的廣泛且強烈的免疫應答的改良疫苗并且尤其是提供針對致命埃博拉和馬爾堡絲狀病毒的保護性免疫的疫苗存在未滿足的需要。

發明概述

現在首次發現施用無復制能力載體的初免-加強方案的特定順序產生提高的有效免疫應答，所述免疫應答可適于在人類受試者中提供針對疾病諸如腫瘤或感染性疾病、更具體地為絲狀病毒感染的治療和/或保護。出人意料地，現在已發現，不同于先前報道的動物研究，使用mva載體作為初免物并使用腺病毒載體作為加強免疫物，產生針對免疫原的優異免疫應答，其特征在于t細胞活性的強誘導和高水平的對免疫原特異的抗體應答。

在本發明的某些實施方案中，無復制能力載體的mva-初免和腺病毒-加強組合在人類受試者中產生針對抗原蛋白或其免疫原性多肽的增強的免疫應答。所述抗原蛋白或其免疫原性多肽可以是任何抗原蛋白或其免疫原性多肽。例如，所述抗原蛋白或其免疫原性多肽可以來源于病原體，例如病毒、細菌、真菌、原生動物或腫瘤。

因此，本發明的一個總體方面涉及一種增強人類受試者中的免疫應答的方法，所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發免疫應答，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強免疫應答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對抗原蛋白的增強的免疫應答。

在本發明的一個優選的實施方案中，增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的抗體應答。

在本發明的一個優選的實施方案中，增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的cd4+和/或cd8+t細胞應答。

本發明的另一個方面涉及一種引發人類受試者中的免疫應答的方法，所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發免疫應答，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強免疫應答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得相對于在施用第二組合物進行初免并且施用第一組合物加強免疫應答的情況下觀察到的免疫應答增強的免疫應答。

在本發明的一個優選的實施方案中，通過所述方法產生的增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的抗體應答。此應答的特征可在于高比例應答者的存在，諸如超過50％、60％、70％、80％、90％或100％測試的受試者。

在本發明的一個實施方案中，通過所述方法產生的增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的cd8+t細胞應答[例如，應答的特征在于高比例cd8+應答者的存在，諸如超過50％、60％、70％、80％、90％或100％測試的受試者，如通過ics測定所確定的，其中平均總細胞因子應答為約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發明的另一個實施方案中，通過所述方法產生的增強的cd8+t細胞應答包括對抗原蛋白特異的多功能cd8+t細胞的增加或誘導。此多功能cd8+t細胞表達超過一種細胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。

在本發明的一個實施方案中，通過所述方法產生的增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的cd4+t細胞應答[例如，應答的特征在于高比例cd4+應答者的存在，諸如超過50％、60％、70％、80％、90％或100％測試的受試者，如通過ics測定所確定的，其中平均總細胞因子應答為約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發明的另一個實施方案中，通過所述方法產生的增強的cd4+t細胞應答包括對抗原蛋白特異的多功能cd4+t細胞的增加或誘導。此多功能cd4+t細胞表達超過一種細胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。

在本發明的另一個優選的實施方案中，增強的免疫應答還包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的抗體應答。此應答的特征可在于高比例的應答者的存在，諸如超過50％、60％、70％、80％、90％或100％測試的受試者。

在本發明的另一個實施方案中，通過所述方法產生的增強的免疫應答還包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的cd8+t細胞應答[例如，應答的特征在于高比例cd8+應答者的存在，諸如超過50％、60％、70％、80％、90％或100％測試的受試者，如通過ics測定所確定的，其中平均總細胞因子應答為約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發明的一個實施方案中，通過所述方法產生的增強的cd8+t細胞應答包括在人類受試者中對抗原蛋白特異的多功能cd8+t細胞的增加或誘導。

在本發明的一個更優選的實施方案中，增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的cd4+t細胞應答、增強的抗體應答和/或增強的cd8+t細胞應答。

在本發明的一個優選的實施方案中，腺病毒載體為rad26載體。

在本發明的另一個優選的實施方案中，加強步驟(b)在初免步驟(a)之后1-12周進行。在本發明的另一個實施方案中，加強步驟(b)在初始加強步驟之后重復一次或多次。

在本發明的一個優選的實施方案中，加強步驟(b)在初免步驟(a)之后2-12周進行。在本發明的另一個優選的實施方案中，加強步驟(b)在初免步驟(a)之后4-12周進行。在本發明的另一個優選的實施方案中，加強步驟(b)在初免步驟(a)之后1周進行。在本發明的另一個優選的實施方案中，加強步驟(b)在初免步驟(a)之后2周進行。在本發明的另一個優選的實施方案中，加強步驟(b)在初免步驟(a)之后4周進行。在本發明的另一個優選的實施方案中，加強步驟(b)在初免步驟(a)之后8周進行。

在本發明的一個實施方案中，抗原蛋白來源于病原體，諸如病毒、細菌、真菌或原生動物。在本發明的另一個實施方案中，抗原蛋白來源于腫瘤，優選地為癌癥。

在本發明的一個實施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸編碼相同的抗原蛋白或其免疫原性多肽。在本發明的另一個實施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸編碼相同抗原蛋白的不同免疫原性多肽或表位。在本發明的另一個實施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸編碼不同但相關的抗原蛋白或其免疫原性多肽。例如，相關抗原蛋白可以是來源于相同抗原蛋白的基本上相似的蛋白質或者來源于相同病原體或腫瘤的不同抗原蛋白。

根據本發明的實施方案中，本發明的方法為人類受試者提供針對與抗原蛋白相關的疾病諸如腫瘤或感染性疾病的保護性免疫。

在一個優選的實施方案中，無復制能力mva和腺病毒載體的初免-加強組合增強人類受試者中針對腫瘤的保護性免疫應答。

在另一個優選的實施方案中，無復制能力mva和腺病毒載體的初免-加強組合增強人類受試者中針對病原體，更優選地一種或多種絲狀病毒亞型，諸如埃博拉和/或馬爾堡絲狀病毒的免疫應答。

根據本發明的絲狀病毒亞型可以是任何絲狀病毒亞型。在一個優選的實施方案中，絲狀病毒亞型選自下組：扎伊爾、蘇丹、雷斯頓(reston)、本迪布焦、塔伊森林和馬爾堡。抗原蛋白可為來自包含抗原決定簇的任何絲狀病毒的蛋白質。在一個優選的實施方案中，抗原蛋白為糖蛋白或核蛋白。由包含在根據本發明的第一組合物和第二組合物中的mva載體或腺病毒載體編碼的抗原蛋白可以是來自任何絲狀病毒的任何抗原蛋白。

在另一個優選的實施方案中，第一組合物中的mva載體包含編碼至少四種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的核酸。優選地，mva載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的一種或多種抗原蛋白的核酸。最優選地，mva載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的四種抗原蛋白的核酸。

在某些實施方案中，第二組合物還包含至少一種腺病毒載體，所述腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的核酸。由腺病毒編碼的至少一種絲狀病毒亞型可以選自由mva載體編碼的四種絲狀病毒亞型中的任一種或不是由mva載體編碼的新亞型。在一個實施方案中,由腺病毒載體編碼的至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白具有選自由以下組成的組的氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。

在另一個實施方案中，第二組合物還包含超過一種腺病毒載體，每種腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的核酸。由超過一種腺病毒載體編碼的抗原蛋白可以是相同或不同的抗原蛋白。例如，第二組合物可以包含第一腺病毒載體，所述第一腺病毒載體包含編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的第一抗原蛋白的核酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。第二組合物可以還包含第二腺病毒載體，所述第二腺病毒載體包含編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的第二抗原蛋白的核酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。第二組合物可以另外包含第三腺病毒載體，所述第三腺病毒載體包含編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的第三抗原蛋白的核酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。第一腺病毒載體、第二腺病毒載體和第三腺病毒載體可以是相同或不同的。第一抗原蛋白、第二抗原蛋白和第三抗原蛋白可以是相同或不同的。

在一個優選的實施方案中，第二組合物包含第一腺病毒載體，所述第一腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。在另一個實施方案中，第二組合物還包含第二腺病毒載體，所述第二腺病毒載體包含編碼具有seqidno:2的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。在另一個實施方案中，第二組合物另外包含第三腺病毒載體，所述第三腺病毒載體包含編碼具有seqidno:3的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。

可以設想的是本文描述的方法、疫苗和組合物可體現在試劑盒中。例如，在一個實施方案中，本發明可以包括一種試劑盒，所述試劑盒包含：

(a)第一組合物，其包含免疫有效量的mva載體和藥學上可接受的載體，所述mva載體包含編碼第一絲狀病毒亞型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；以及

(b)第二組合物，其包含免疫有效量的腺病毒載體和藥學上可接受的載體，所述腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；

其中組合物(a)為初免組合物并且組合物(b)為加強組合物。

在一個優選的實施方案中，本發明涉及一種組合疫苗、一種試劑盒或一種用途，其中所述第一組合物中的mva載體包含編碼來自四種不同絲狀病毒亞型的具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的一種或多種抗原蛋白，優選所有四種抗原蛋白的核酸；并且其中所述第二組合物中的腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。

在另一個優選的實施方案中，本發明涉及一種組合疫苗、一種試劑盒或一種用途，其中組合物(a)中的mva載體包含編碼來自四種不同絲狀病毒亞型的具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的一種或多種抗原蛋白，優選所有四種抗原蛋白的核酸；并且其中所述第二組合物包含含有編碼具有seqidno:1的抗原蛋白的核酸的至少一種腺病毒、含有編碼具有seqidno:2的抗原蛋白的核酸的至少一種腺病毒和含有編碼具有seqidno:3的抗原蛋白的核酸的至少一種腺病毒。

在一個優選的實施方案中，包含在本發明的組合疫苗或試劑盒中的腺病毒載體或用于產生針對至少一種絲狀病毒亞型的保護性免疫應答的腺病毒載體為rad26或rad35載體。

在另一個優選的實施方案中，在第0周進行初免疫苗接種，隨后在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或隨后幾周進行加強疫苗接種。優選地，在第1-10周，更優選地在第1、2、4或8周施用加強疫苗接種。

根據本發明的實施方案，加強步驟(b)在初始加強步驟之后重復一次或多次。另外的加強施用可以在例如初免施用之后6個月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年或更晚進行。

在本發明的一個優選的實施方案中，所述方法包括使用免疫有效量的表達一種或多種絲狀病毒糖蛋白的一種或多種mva載體進行初免疫苗接種，隨后使用免疫有效量的表達一種或多種絲狀病毒糖蛋白或基本上相似的糖蛋白的一種或多種腺病毒載體(優選地為ad26載體)進行加強疫苗接種。

在本發明的優選的實施方案中，一種或多種絲狀病毒為埃博拉病毒或馬爾堡病毒。埃博拉病毒可以是任何種類，例如，扎伊爾埃博拉病毒(ebov)和蘇丹埃博拉病毒(sudv)、雷斯頓病毒、本迪布焦病毒、塔伊森林病毒。馬爾堡病毒(marv)可以是任何種類。合適的絲狀病毒抗原蛋白的示例性氨基酸序列示出在seqidno:1至seqidno:5。

本發明還涉及根據本發明的實施方案的第一組合物和第二組合物用于增強人類受試者中的免疫應答的用途，其中所述第一組合物施用于人類受試者以用于引發免疫應答，并且所述第二組合物施用于人類受試者以用于加強免疫應答，從而在人類受試者中獲得針對抗原蛋白的增強的免疫應答。

本發明還涉及：

a.第一組合物，其包含免疫有效量的mva載體，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.第二組合物，其包含免疫有效量的用于加強免疫應答的腺病毒載體，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

第一組合物和第二組合物用于在人類受試者中誘導針對抗原蛋白的增強的免疫應答，其中所述第一組合物施用于人類受試者以用于引發免疫應答，并且所述第二組合物施用于人類受試者一次或多次以用于加強免疫應答。

在一個優選的實施方案中，通過第一多核苷酸編碼的抗原蛋白或其免疫原性多肽來源于病原體或腫瘤。在另一個優選的實施方案中，通過第一多核苷酸編碼的抗原蛋白或其免疫原性多肽來源于絲狀病毒。在另一個實施方案中，抗原蛋白包含選自下組的氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。最優選地，mva載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的抗原蛋白的多核苷酸。

更優選地，腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3的氨基酸序列的至少一種抗原蛋白的多核苷酸。在一個更優選的實施方案中，腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1的氨基酸序列的抗原蛋白的多核苷酸。優選地，所述腺病毒載體為rad26載體。

本發明還涉及：

a.第一組合物，其包含免疫有效量的mva載體，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.第二組合物，其包含免疫有效量的用于加強免疫應答的腺病毒載體，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

其中所述第一組合物施用于人類受試者以用于引發免疫應答，并且所述第二組合物施用于人類患者以用于加強免疫應答，以供用于在人類受試者中誘導相對于在將施用第二組合物進行初免并且將施用第一組合物來加強免疫應答的情況下觀察到的體液免疫應答和/或細胞免疫應答增強的體液免疫應答和/或細胞免疫應答。

在本發明的一個實施方案中，通過所述組合物a.和b.產生的增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的抗體應答連同cd4+和cd8+應答的增強[例如，應答的特征在于高比例cd4+和cd8+應答者的存在，諸如超過50％、60％、70％、80％、90％或100％測試的受試者，如通過ics測定所確定的，其中平均總細胞因子應答為約0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發明的另一個實施方案中，通過所述組合物a.和b.產生的增強的cd4+和cd8+t細胞應答包括對抗原蛋白特異的多功能cd4+和cd8+t細胞的增加或誘導。此多功能cd4+t細胞表達超過一種細胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。

附圖簡述

當結合附圖閱讀時，上述概述以及本發明的以下詳述將更好地理解。應了解，本發明不限于附圖中所示的精確的實施方案。

專利或申請文件包含至少一幅以彩色繪制出的繪圖。在提出請求并支付必要費用后，本事務所將提供具有一張或多張彩色附圖的本專利或專利申請公布的副本。

在附圖中：

圖1匯總動物研究中的分組；

圖2示出研究的實驗設計；

圖3示出使用攻擊性病毒株埃博拉扎伊爾基奎特1995(ebolazairekikwit1995)進行攻擊的結果；

圖4示出從動物研究觀察到的埃博拉扎伊爾糖蛋白特異性體液免疫應答(通過elisa評估)：獨立于疫苗接種方案獲得非常高的抗體滴度(nd＝未分析時間點)；

圖5示出從動物研究觀察到的蘇丹古盧(sudangulu)糖蛋白特異性體液免疫應答(通過elisa評估)：獨立于疫苗接種方案獲得非常高的抗體滴度(nd＝未分析時間點)；

圖6示出從動物研究觀察到的馬爾堡安哥拉(marburgangola)糖蛋白特異性體液免疫應答(通過elisa評估)：獨立于疫苗接種方案獲得非常高的抗體滴度(nd＝未分析時間點)；

圖7示出通過ifn-γelispot分析的對zebov、sebov和marvagp的特異性細胞免疫應答；

圖8示出通過抗ebovgpelisa分析的對zebovgp的特異性免疫應答，其中在加強免疫后21天，在使用mva作為初免物并使用ad26作為加強免疫物而非相反順序的疫苗來免疫的受試者中觀察到加強免疫后更高的體液免疫應答；

圖9示出通過elispot測定分析的人類中對zebovgp的特異性t細胞應答；

圖10示出通過ics測定分析的人類中對zebovgp的特異性cd8+細胞免疫應答；

圖11示出當使用28天初免加強間隔時，通過ics測定的人類中ebovgp-特異性cd8+t細胞應答的功能分布；

圖12示出當使用56天初免加強間隔時，通過ics測定的人類中ebovgp-特異性cd8+t細胞應答的功能分布；

圖13示出通過ics測定分析的人類中對zebovgp的特異性cd4+細胞免疫應答；并且

圖14示出當使用28天初免加強間隔時，通過ics測定的人類中ebovgp-特異性cd4+t細胞應答的功能分布；

圖15示出當使用56天初免加強間隔時，通過ics測定的人類中ebovgp-特異性cd4+t細胞應答的功能分布；

圖16示出通過使用ad26.zebov進行初免免疫隨后在14天后進行mva-bn-filo加強來誘導的通過elisa(a)、elispot(b)和ics(c和d)評估的免疫應答；

圖17示出通過抗-ebovgpelisa分析的對zebovgp的特異性免疫應答；

圖18示出通過elispot測定分析的人類中對zebovgp的特異性t細胞應答；

圖19示出當使用mva作為初免物并在14天后使用ad26作為加強免疫物，通過ics測定分析的人類中對zebovgp特異的強且平衡的cd4+(a)和cd8+(b)細胞免疫應答以及通過ics測定的人類中ebovgp-特異性cd8+(c)和cd4+(d)t細胞應答的功能分布。

圖20示出通過用由gpelisa測定的ad26.zebov/mva-bn-filo和mva-bn-filo/ad26.zebov方案進行的疫苗接種所引發的ebovmayingagp結合的抗體。疫苗接種方案指示于下方x軸。高im和標準im是指mvabnfilo的劑量和路徑。水平虛線指示lod。

發明詳述

在背景中和貫穿本說明書中引用或描述各種出版物、文章和專利；這些參考文獻各自以引用的方式整體并入本文。對本說明中已包括的文件、法案、材料、裝置、物品等的討論是出于提供本發明的上下文的目的。所述討論并非承認任何或全部的這些內容形成關于公開的或要求的任何發明的當前技術的部分。

除非另外定義，否則本文使用的所有技術術語和科學術語均具有與本發明所屬領域中的普通技術人員通常理解的相同的含義。另外，本文使用的某些術語具有本說明書中闡述的含義。本文引用的所有專利、公開的專利申請和公布以引用的方式并入，就如同完全在本文闡述一樣。必需指出，除非上下文另外清楚地指出，否則如本文和所附權利要求書中所用的，單數形式“一個/種(a/an)”和“所述”包括復數引用。

除非另外指明，否則在一系列要素前的術語“至少”應當理解為是指系列中的每一要素。本領域技術人員僅僅使用常規試驗將認識到或者能夠確定本文所描述的發明的具體實施方案的很多等效方案。所述等效方案意圖由本發明涵蓋。

貫穿本說明書和以下權利要求書，除非上下文另有要求，否則詞語“包含(comprise)”和變型諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”應理解為暗示包括所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。當在本文中使用時，術語“包含(comprising)”可由術語“含有(containing)”或“包括(including)”替代或者當在本文中使用時經常用術語“具有(having)”替代。當在本文中使用時，“由...組成”排除了在權利要求要素中未指明的任何要素、步驟、或成分。當在本文中使用時，“基本上由…組成”不排除本質上并不影響所述權利要求的基本特征和新穎特征的材料或步驟。在本文中的每種情況下，術語“包括”、“基本上由……組成”和“由……組成”中的任何術語可由其他兩個術語中的任一個代替。

如本文所用的，多個引用的要素之間的連接術語“和/或”應理解為包含單獨的和組合的選項兩者。例如，當兩個要素由和/或連接時，第一選項是指在不具有第二要素的情況下第一要素的應用。第二選項是指在不具有第一要素的情況下第二要素的應用。第三選項是指第一要素和第二要素一起的應用。這些選項中的任一個應理解為屬于所述含義之內，并且因此滿足如本文所用的術語“和/或”的要求。所述選項中的多于一個的同時應用也應理解為屬于所述含義之內，并且因此滿足術語“和/或”的要求。

如本文所用的，“受試者”意指將或已通過根據本發明的實施方案的方法處理的任何動物，優選地為哺乳動物，最優選地為人類。本文所用的術語“哺乳動物”包括任何哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限于牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人類等，更優選地為人類。

如本文所用的，術語“保護性免疫”或“保護性免疫應答”意指疫苗接種的受試者能夠控制與疫苗接種所針對的抗原蛋白或其免疫原性多肽相關的疾病或感染。通常，已發展“保護性免疫應答”的受試者僅發展輕度到中度的臨床癥狀或根本無癥狀。通常，具有針對某一抗原蛋白的“保護性免疫應答”或“保護性免疫”的受試者將不會因與所述抗原蛋白相關的感染或疾病而死亡。

抗原蛋白可以是來自病原體或腫瘤的天然蛋白或者基于來自病原體或腫瘤的天然蛋白的改性蛋白。

如本文所用的，術語“病原體”是指在其宿主中引起疾病的傳染劑，諸如病毒、細菌、真菌、寄生蟲或朊病毒。

如本文所用的，術語“增強”當相對于免疫應答諸如cd4+t細胞應答、抗體應答或cd8+t細胞應答來使用時是指在使用根據本發明的無復制能力mva和腺病毒載體的初免-加強組合施用的人類受試者中的免疫應答相對于從使用相反初免-加強組合施用的人類受試者中觀察到的對應免疫應答的增加，其中腺病毒載體作為初免物提供并且mva載體被提供來加強免疫應答，所述兩個組合使用相同的初免-加強間隔。

如本文所用的，術語“主要cd4+或cd8+t細胞應答”是指特征在于在疫苗接種后在總反應性t細胞群體內觀察到高比例的免疫原特異性cd4+t細胞的t細胞免疫應答。總免疫原特異性t細胞應答可以通過ifn-γelispot測定來確定。免疫原特異性cd4+或cd8+t細胞免疫應答可以通過ics測定來確定。例如，主要cd4+t細胞應答可以包括人類受試者中總抗原特異性t-細胞應答的超過50％，諸如51％、60％、70％、80％、90％或100％的抗原特異性cd4+t細胞應答。優選地，主要cd4+t細胞應答還代表人類受試者中總細胞因子應答的0.1％或更多，諸如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更多。

如本文所用的，術語“增強的抗體應答”是指在使用根據本發明的無復制能力mva和腺病毒載體的初免-加強組合施用的人類受試者中的抗體應答，所述抗體應答相對于從使用相反初免-加強組合施用的人類受試者中觀察到的對應免疫應答增加至少1.5倍、2倍、2.5倍或更多倍，其中腺病毒載體作為初免物提供并且mva載體被提供來加強免疫應答，所述兩種組合使用相同的初免-加強間隔。

如本文所用的，術語“多功能”當相對于cd4+或cd8+t細胞使用時意指表達超過一種細胞因子，諸如以下至少兩種的t細胞：il-2、ifn-γ和tnf-α。

“腺病毒衣殼蛋白”是指腺病毒(例如，ad26或ad35)的衣殼上的蛋白質，所述蛋白質涉及決定特定腺病毒的血清型和/或向性。腺病毒衣殼蛋白通常包含纖維、五鄰體蛋白和/或六鄰體蛋白。如本文所用的，“ad26衣殼蛋白”或“ad35衣殼蛋白”可以是例如包含ad26或ad35衣殼蛋白的至少一部分的嵌合衣殼蛋白。在某些實施方案中，衣殼蛋白為ad26或ad35的整個衣殼蛋白。在某些實施方案中，六鄰體蛋白、五鄰體蛋白和纖維屬于ad26或ad35。

術語“佐劑”和“免疫刺激劑”在本文中可互換使用，并且被定義為引起免疫系統刺激的一種或多種物質。在此上下文中，佐劑用于增強對本發明的腺病毒載體和/或mva載體的免疫應答。

當應用到序列中的氨基酸殘基的位置時，術語“對應于”意指當序列最佳比對時多個序列中對應的位置。

在兩個或更多個核酸或多肽序列(例如，絲狀病毒的糖蛋白和編碼所述糖蛋白的多核苷酸)的上下文中，術語“同一的”或“同一性”百分百是指在進行比較和比對以獲得最大對應性時，如使用以下序列比較算法之一或通過目視檢查所測量的，相同或具有指定百分比的相同氨基酸殘基或核酸的兩個或更多個序列或子序列。

針對序列比較，通常一個序列充當參比序列，測試序列與其比較。當使用序列比較算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機中，指定子序列坐標(如果需要)，并且指定序列算法的程序參數。隨后基于指定的程序參數計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。

可進行用于比較的序列的最佳比對，例如通過smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法；通過needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比對算法；通過pearson&lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444(1988)的相似性搜索方法；通過這些算法的計算機化實施方式(gap,bestfit,fasta,andtfastainthewisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi)，或通過目視檢查(通常參見currentprotocolsinmolecularbiology,f.m.ausubel等編輯,currentprotocols,ajointventurebetweengreenepublishingassociates,inc.andjohnwiley&sons,inc.,(1995supplement)(ausubel))。

適于測定序列同一性百分比和序列相似性的算法的實例為blast和blast2.0算法，所述算法分別描述于altschul等(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschuel等(1977)nucleicacidsres.25:3389-3402。用于執行blast分析的軟件是通過國家生物技術信息中心公共可利用的。這種算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度為w的短詞來鑒定高分數序列對(hsps)，所述短詞在與數據庫序列中具有相同長度的詞比對時匹配或滿足某些正值的閾值分數t。t稱為相鄰字評分閾值(altschul等，同上)。這些初始鄰域詞命中作為種子啟動搜索，用以尋找含有它們的較長hsp。接著該詞命中沿著每條序列在兩個方向延伸，遠至能夠提高累積比對分數。

對于核苷酸序列，利用參數m(一對匹配殘基的獎勵分數，通常>0)和n(非配對殘基的罰分，通常<0)計算累積分數。對于氨基酸序列，使用分數矩陣計算累積分數。字命中在每個方向上的延伸在下列情況時停止：累積比對評分由其達到的最大值降低數量x；由于一個或者多個負評分殘基比對的積累而使累積評分降至0或者以下；或者達到任一序列的末端。blast算法參數w、t和x決定所述比對的靈敏度和速度。blastn程序(對于核苷酸序列)使用的默認值是字長(w)為11，期望值(e)為10，m＝5，n＝-4并且進行兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，blastp程序使用的默認值是字長(w)為3，期望值(e)為10和blosum62評分矩陣(參見henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))。

除了計算序列同一性百分比之外，blast算法還進行兩個序列之間的相似性統計學分析(參見，例如karlin&altschul,proc.nat’l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。blast算法提供的一種相似性測定是最小總和概率(p(n))，其表示通過兩個核苷酸或者核酸序列之間偶然發生配對的概率。例如，如果在測試核酸與參比核酸的比較中，最小和概率小于約0.1、更優選地小于約0.01并且最優選地小于約0.001，認為核酸與參比序列相似。

兩個核酸序列或多肽基本上相同的另一個指示為：如下所述的，由第一核酸編碼的多肽與由第二核酸編碼的多肽具有免疫交叉反應。因此，多肽通常與第二多肽基本上相同，例如，在兩種多肽僅因保守取代而不同的情況下。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示為：如下所述的，兩個分子在嚴格條件下互相雜交。

在本發明的絲狀病毒抗原蛋白的上下文中術語“基本上相似”指示在10-20個氨基酸的比較窗上，多肽包含與參考序列具有至少90％、優選地至少95％的序列同一性的序列。序列同一性百分比通過在比較窗上比較兩個最佳比對的序列來確定，其中比較窗中的多核苷酸序列的部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)以用于兩個序列的最佳比對。所述百分比通過以下進行計算：確定兩個序列中出現相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數以得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗口中的位置總數，并且將結果乘以100以得到序列同一性百分比。

在本發明中發現，異源初免-加強組合(具體地說，用mva進行初免，隨后用ad26進行加強)出人意料地有效于在人類受試者中產生保護性免疫應答。

抗原蛋白

任何感興趣的dna均可以插入到本文所述的病毒載體中以便從所述載體中異源表達。用于插入到可表達形式的病毒的基因組中的外源基因可以使用用于分離所需基因的常規技術來獲得。對于含有dna基因組的生物體而言，編碼感興趣的抗原的基因可以從基因組dna中分離；對于具有rna基因組的生物體而言，所需基因可以從基因組的cdna拷貝中分離。抗原蛋白還可以通過基于天然存在的序列改性的重組dna編碼，例如以便優化抗原應答、基因表達等。

在本發明的某些實施方案中，無復制能力載體的mva-初免和腺病毒-加強組合在人類受試者中產生針對抗原蛋白或其免疫原性多肽的增強的免疫應答。抗原蛋白可以是與感染或疾病相關的任何抗原蛋白。

根據本發明的實施方案，抗原蛋白或其免疫原性多肽可以分離自或來源于病原體，諸如病毒(例如，絲狀病毒、腺病毒、蟲媒病毒、星狀病毒、冠狀病毒、柯沙奇病毒、巨細胞病毒、登革病毒、埃-巴二氏病毒(epstein-barrvirus)、肝炎病毒、皰疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、人嗜t淋巴細胞病毒、流感病毒、jc病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、麻疹病毒、傳染性軟疣病毒、腮腺炎病毒、諾瓦克病毒、細小病毒(parovirus)、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞體病毒、鼻病毒、輪狀病毒、輪狀病毒、風疹病毒、天花病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、西尼羅河病毒等)、細菌(例如，空腸彎曲菌、大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、結核分枝桿菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitides)、沙門氏菌、志賀氏桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等)、真菌(例如，粗球孢子菌、皮炎芽生菌、新型隱球菌、念珠菌屬、曲霉屬等)、原生動物(例如，瘧原蟲、利什曼蟲、錐體蟲、隱孢子蟲、等孢子球蟲屬、福氏耐格里阿米巴(naegleriafowleri)、棘阿米巴屬、巴拉姆希阿米巴、剛地弓形蟲、卡氏肺孢子蟲等)或者癌癥(例如，膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、白血病、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等)。

在一些實施方案中，核酸表達抗原結構域而不是整個抗原蛋白。這些片段可以具有對于免疫原性或抗原性而言足夠的任何長度。片段可以是至少四個氨基酸長度，優選8-20個氨基酸，但也可以是更長的，例如像100、200、660、800、1000、1200、1600、2000個氨基酸長度或更長或者在其之間的任何長度。

在一些實施方案中，編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的至少一種核酸片段插入到病毒載體中。在另一個實施方案中，編碼不同抗原蛋白的約2-8種不同核酸插入到一種或多種病毒載體中。在一些實施方案中，可以使用多個免疫原性片段或各種蛋白質的亞基。例如，來自單一蛋白質的不同位點或來自相同種類的不同蛋白質或來自不同種類的蛋白質直向同源物的若干種不同表位可以由載體表達。

絲狀病毒抗原蛋白

埃博拉病毒和遺傳相關性馬爾堡病毒為與北美、歐洲和非洲的人類和靈長類動物中高致死性出血熱的爆發相關聯的絲狀病毒(peters,c.j.等，在：fieldsvirology編輯fields,b.n.等1161-1176,philadelphia,lippincott-raven,1996；peters,c.j.等1994seminvirol5:147-154中)。盡管已定義了若干亞型，但這些病毒的基因結構為相似的，各自含有七個線性排列的基因。在所述病毒蛋白之間，包膜糖蛋白以兩種替代形式存在，即由rna編輯產生的50-70千道爾頓(kda)分泌蛋白(sgp)和介導病毒進入的130kda跨膜糖蛋白(gp)(peters,c.j.等，在：fieldsvirology編輯fields,b.n.等1161-1176,philadelphia,lippincott-raven,1996；sanchez,a.等1996pnasusa93:3602–3607中)。其他結構基因產物包括核蛋白(np)、基質蛋白vp24和vp40、假定非結構蛋白vp30和vp35以及病毒聚合酶(綜述于peters,c.j.等，在：fieldsvirology編輯fields,b.n.等1161-1176,philadelphia,lippincott-raven,1996中)。

包含在腺病毒和mva載體中的核酸分子可編碼任何絲狀病毒種類的結構基因產物，諸如扎伊爾亞型(典型種類，在本文中也稱為zebov)、蘇丹(在本文中也稱為sebov)、雷斯頓亞型、本迪布焦亞型和象牙海岸亞型。存在單一種類的馬爾堡病毒(在本文中也稱為marv)。

本發明的腺病毒載體和mva載體可用于表達抗原蛋白，所述抗原蛋白為包含多種多樣的絲狀病毒抗原的抗原決定簇的蛋白質。在一個典型和優選的實施方案中，本發明的載體包含編碼跨膜形式的病毒糖蛋白(gp)的核酸。在其他實施方案中，本發明的載體可編碼分泌形式的病毒糖蛋白(ssgp)或病毒核蛋白(np)。

本領域技術人員將認識到，編碼絲狀病毒抗原蛋白的核酸分子可以被改性，例如，只要改性的表達的蛋白質引發針對病原體或疾病的免疫應答，本文闡述的核酸分子就可以突變。因此，如本文所用的，術語“抗原蛋白”或“絲狀病毒蛋白”是指包含如上所述的絲狀病毒蛋白的至少一個抗原決定簇的蛋白質。所述術語包括絲狀病毒糖蛋白(即絲狀病毒的基因產物)或絲狀病毒核蛋白以及包含一個或多個絲狀病毒糖蛋白決定簇的重組蛋白。術語抗原蛋白也包括基本上相似的抗原蛋白。

在一些實施方案中，蛋白質可以突變來使得其對細胞的毒性更小(參見，例如wo/2006/037038)或者可在細胞中以增加或降低的水平表達。本發明也包括含有核酸分子的組合的疫苗。例如并且不限于，編碼扎伊爾、蘇丹、馬爾堡和象牙海岸/塔伊森林埃博拉病毒株的gp、ssgp和np的核酸分子可以任何組合方式組合在一種疫苗組合物中。

腺病毒

根據本發明的腺病毒屬于腺病毒科并且優選地為屬于哺乳動物腺病毒屬的腺病毒。腺病毒可為人類腺病毒，而且可為感染其他物種的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如，牛腺病毒3，badv3)、犬腺病毒(例如cadv2)、豬腺病毒(例如padv3或padv5)或猿腺病毒(其包括猴腺病毒和猿猴腺病毒，諸如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。優選地，腺病毒為人類腺病毒(hadv或adhu；在本發明中如果提及ad而未指示種類則意指人類腺病毒，例如簡寫符號“ad5”意指與hadv5相同，其為人類腺病毒血清型5)或猿腺病毒諸如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒(chad、adch或sadv)。

使用人類腺病毒進行最先進的研究，并且根據本發明的某些方面優選人類腺病毒。在某些優選的實施方案中，根據本發明的重組腺病毒是基于人類腺病毒。在優選的實施方案中，重組腺病毒是基于人類腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根據本發明的一個特別優選的實施方案，腺病毒為血清型26或35之一的人類腺病毒。

這些血清型的優點為人類群體中的低血清陽性率和/或低預先存在的中和抗體滴度。例如在wo2007/104792和在abbink等,(2007)virol81(9):4654-63中描述了rad26載體的制備，所述兩份文獻均以引用的方式整體并入本文。ad26的示例性基因組序列可見于genbank登錄ef153474和wo2007/104792的seqidno:1中。例如在美國專利號7,270,811中、在wo00/70071中以及在vogels等,(2003)jvirol77(15):8263-71中描述了rad35載體的制備，所有文獻均以引用的方式整體并入本文。ad35的示例性基因組序列可見于genbank登錄ac_000019和wo00/70071的圖6中。

猿腺病毒通常在人類群體中也具有低血清陽性率和/或低預先存在的中和抗體滴度并且報告了使用黑猩猩腺病毒載體的大量的工作(例如us6083716；wo2005/071093；wo2010/086189；wo2010085984；farina等，2001,jvirol75:11603-13；cohen等,2002,jgenvirol83:151-55；kobinger等,2006,virology346:394-401；tatsis等,2007,moleculartherapy15:608-17；也參見bangari和mittal的綜述,2006,vaccine24:849-62；以及lasaro和ertl的綜述,2009,molther17:1333-39)。因此，在其他優選的實施方案中，根據本發明的重組腺病毒是基于猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些實施方案中，重組腺病毒是基于猿腺病毒類型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或sa7p。

腺病毒載體rad26和rad35

在根據本發明的一個優選的實施方案中，腺病毒載體包含來自以下兩種稀有血清型的衣殼蛋白：ad26和ad35。在典型的實施方案中，載體為rad26或rad35病毒。

因此，可用于本發明的載體包括ad26或ad35衣殼蛋白(例如纖維、五鄰體或六鄰體蛋白)。本領域技術人員將認識到，將整個ad26或ad35衣殼蛋白用于本發明的載體中是不必要的。因此，包含ad26或ad35衣殼蛋白的至少一部分的嵌合衣殼蛋白可用于本發明的載體中。本發明的載體也可包含衣殼蛋白，其中只要至少一種衣殼蛋白來源于ad26或ad35，那么纖維、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白各自來源于不同的血清型。在優選的實施方案中，纖維、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白各自來源于ad26或各自來源于ad35。

本領域技術人員將認識到，來源于多種血清型的元件可組合在單個重組腺病毒載體中。因此，可產生組合來自不同血清型的所需性質的嵌合腺病毒。因此，在一些實施方案中，本發明的嵌合腺病毒可將ad26和ad35血清型預先存在的免疫的缺乏與各種特性組合，所述特性諸如溫度穩定性、組裝、錨定、產生率、重定向或改善的感染、目標細胞中dna的穩定性等等。

在某些實施方案中，適用于本發明的重組腺病毒載體主要或整個來源于ad35或ad26(即載體為rad35或rad26)。在一些實施方案中，腺病毒為復制缺陷型，例如因為它包含基因組的e1區域中的缺失。對于本發明的腺病毒，在來源于ad26或ad35的情況下，典型的是將腺病毒的e4-orf6編碼序列與人類亞型c(諸如ad5)的腺病毒的e4-orf6交換。這允許此類腺病毒在已熟知的表達ad5的e1基因的互補細胞系中增殖，所述細胞系例如像293細胞、per.c6細胞等等(參見，例如havenga等,2006,jgenvirol87:2135-43；wo03/104467)。在某些實施方案中，腺病毒為血清型35的人類腺病毒，其具有已克隆有編碼抗原的核酸的e1區域中的缺失，并且具有ad5的e4orf6區域。在某些實施方案中，腺病毒為血清型26的人類腺病毒，其具有在已克隆有編碼抗原的核酸的e1區域中的缺失，并且具有ad5的e4orf6區域。對于ad35腺病毒，典型的是在腺病毒中保留e1b55k開放閱讀框的3’末端，例如就在pix開放閱讀框上游的166bp或者就在pix起始密碼子上游的包含它的片段諸如243bp片段，通過bsu36i限制性位點在5’末端標記，因為這增加腺病毒的穩定性，因為pix基因的啟動子部分停留在此區域中(參見，例如havenga等,2006,同上；wo2004/001032)。

重組腺病毒載體的制備在本領域中為已熟知的。

例如在wo2007/104792和在abbink等，(2007)virol81(9):4654-63中描述了rad26載體的制備。ad26的示例性基因組序列可見于genbank登錄ef153474和wo2007/104792的seqidno:1中。例如在美國專利號7,270,811和vogels等,(2003)jvirol77(15):8263-71中描述了rad35載體的制備。ad35的示例性基因組序列可見于genbank登錄ac_000019中。

在本發明的一個實施方案中，適用于本發明的載體包括描述于wo2012/082918的那些載體，所述專利的公開內容以引用的方式整體并入本文。

通常，使用包含整個重組腺病毒基因組的核酸產生適用于本發明的載體(例如，質粒、粘粒或桿狀病毒載體)。因此，本發明也提供編碼本發明的腺病毒載體的分離的核酸分子。本發明的核酸分子可以是通過克隆或合成產生的rna形式或者dna形式。所述dna可以是雙鏈或單鏈的。

適用于本發明的腺病毒載體通常為復制缺陷型的。在這些實施方案中，通過使對病毒的復制至關重要的區域諸如e1區域缺失或失活來使得病毒成為復制缺陷型。所述區域可通過例如插入目標基因(通常連接到啟動子)來基本上缺失或失活。在一些實施方案中，本發明的載體可包含其他區域諸如e2、e3或e4區域中的缺失，或連接到啟動子的異源基因的插入。對于e2和/或e4突變的腺病毒而言，e2和/或e4互補細胞系通常用于產生重組腺病毒。腺病毒的e3區域中的突變無需由細胞系補充，因為e3對于復制是不需要的。

包裝細胞系通常用于產生足夠量的本發明的腺病毒載體。包裝細胞為包含在復制缺陷型載體中已缺失或失活的那些基因的細胞，因此允許病毒在細胞中復制。合適的細胞系包括例如per.c6、911、293和e1a549。

在一些實施方案中，腺病毒載體可表達編碼抗原肽的基因或基因部分。這些外來的、異源的或外源的肽或多肽可以包括免疫原性序列，例如像腫瘤特異性抗原(tsa)、細菌、病毒、真菌以及原生動物抗原。

如以上所指出，多種多樣的絲狀病毒糖蛋白可在載體中表達。如果需要，編碼絲狀病毒糖蛋白的異源基因可為密碼子優化的，以確保在治療的宿主(例如人類)中的適當表達。密碼子優化為本領域中廣泛應用的技術。通常，異源基因克隆到腺病毒基因組的e1和/或e3區域。

異源絲狀病毒基因可以處于腺病毒來源的啟動子的控制(即可操作地連接到)下或者可以處于異源啟動子的控制下。合適的異源啟動子的實例包括cmv啟動子和rsv啟動子。優選地，啟動子位于表達盒內目標異源基因的上游。

在本發明的一個優選的實施方案中，適用于本發明的腺病毒載體可包含對本領域技術人員已知的各種各樣的絲狀病毒糖蛋白。在本發明的另一個優選的實施方案中，rad載體包含選自由以下組成的組的一個或多個gp：扎伊爾埃博拉病毒(ebov)的gp、蘇丹埃博拉病毒(sudv)的gp、馬爾堡病毒(marv)的gp以及與它們基本上相似的gp。

mva載體

適用于本發明的mva載體利用來源于改性牛痘安卡拉病毒的減毒病毒，其特征在于所述病毒在人類細胞系中進行繁殖性復制的能力的損失。

在一些實施方案中，mva病毒可表達編碼抗原肽的基因或基因部分。這些外來的、異源的或外源的肽或多肽可以包括免疫原性序列，例如像腫瘤特異性抗原(tsa)、細菌、病毒、真菌以及原生動物抗原。

在其他實施方案中，mva載體表達各種各樣的絲狀病毒糖蛋白以及其他結構性絲狀病毒蛋白，諸如vp40和核蛋白(np)。在一方面，本發明提供一種重組改性的安卡拉牛痘病毒(mva)，所述病毒包含編碼絲狀病毒糖蛋白(gp)(具體地為包膜糖蛋白)的抗原決定簇的核苷酸序列。在另一方面，本發明提供一種重組mva載體，所述mva載體包含編碼絲狀病毒糖蛋白(具體地為包膜糖蛋白)的抗原決定簇的異源核苷酸序列，以及編碼另一絲狀病毒蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列。

通過對安卡拉真皮牛痘病毒株的雞胚胎成纖維細胞進行超過570次連續傳代[絨毛膜尿囊牛痘病毒安卡拉病毒，cva；關于綜述參見mayr等(1975),infection3,6-14]來產生mva，所述安卡拉真皮牛痘病毒株在土耳其安卡拉疫苗接種研究所(vaccinationinstitute,ankara,turkey)中保存許多年并且用作人類接種疫苗的基礎。然而，由于通常發生與牛痘病毒相關聯的嚴重接種后并發癥，所以多次試圖產生更加減毒、更加安全的天花疫苗。

在1960至1974時段期間，antonmayr教授通過在cef細胞中超過570次連續傳代成功使cva減毒[mayr等(1975)]。在多種動物模型中顯示，產生的mva為無毒的[mayr,a.&danner,k.(1978),dev.biol.stand.41:225-234]。作為mva的早期發展的一部分(作為天花前期疫苗的)，存在處于來自疫苗的不良反應的風險下的受試者中使用mva-517與listerelstree結合的臨床試驗[stickl(1974),prev.med.3:97-101；stickl和hochstein-mintzel(1971),munch.med.wochenschr.113:1149-1153]。在1976年，在德國，將來源于mva-571菌種儲備(對應于第571次傳代)的mva登記為兩階段腸胃外天花疫苗接種程序中的初免疫苗(primervaccine)。隨后，mva-572用于大約120,000個白種人個體中，大部分1歲與3歲之間的兒童中，他們未報告嚴重的副作用，即使許多受試者為具有與疫苗相關聯的并發癥的高風險的群體中(mayr等(1978),zentralbl.bacteriol.(b)167:375-390)。mva-572在1994年1月27日作為ecaccv94012707儲存在歐洲動物細胞培養物保藏所(europeancollectionofanimalcellcultures；英國sp40jg，威爾特郡，索爾淄博里市，camr(camr,salisbury,wiltshiresp40jguk))。

由于傳代用于將mva減毒，根據cef細胞中進行的傳代數目，存在許多不同病毒株或分離物。例如，在德國在天花根治項目期間將mva-572以小劑量用作前期疫苗，并且mva-575廣泛用作獸醫疫苗。與祖cva病毒相比，mva以及mva-bn缺少大約15％(來自六個區域的31kb)的基因組。所述缺失影響許多毒性和宿主范圍細胞以及甲型包涵體基因。mva-575在2000年12月7日在以登錄號v00120707儲存在歐洲動物細胞培養物保藏所(ecacc；英國sp40jg，威爾特郡，索爾淄博里市，camr(camr,salisbury,wiltshiresp40jguk))。通過cva在原代雞胚胎成纖維細胞上的連續增殖(超過570次傳代)獲得減毒的cva-病毒mva(改性安卡拉牛痘病毒)。

即使mayr等在20世紀70年代證實，mva在人類和哺乳動物中為高度減毒的和無毒的，但某些研究員已報告，mva在哺乳動物和人類細胞系中不是完全減毒的，因為可能在這些細胞中發生殘余的復制[blanchard等(1998),j.gen.virol.79:1159-1167；carroll&moss(1997),virology238:198-211；美國專利號5,185,146；ambrosini等(1999),j.neurosci.res.55:569]。假定這些公開中報告的結果已使用各種已知的mva病毒株來獲得，因為所使用的病毒在其性質方面，尤其是在各種細胞系中的生長行為方面基本不同。出于各種原因，包括與在人類中使用有關的安全考慮，此類殘余的復制是不需要的。

為開發更安全的產物(諸如疫苗或藥物)，具有增強的安全性能的mva的病毒株已由bavariannordic育出。mva由bavariannordic進一步傳代并且指定為mva-bn，其代表樣品于2000年8月30日以登錄號v00083008儲存在歐洲細胞培養物保藏所(europeancollectionofcellcultures，ecacc)。在wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中進一步描述mva-bn，所述兩份專利均以引用的方式整體并入本文。

mva-bn可連接并且進入人細胞，其中病毒編碼的基因非常有效地表達。mva-bn非常適于初代雞胚成纖維(cef)細胞并且不在人類細胞中復制。在人類細胞中，表達病毒基因并且不產生感染病毒。根據美國疾病控制和預防中心，mva-bn被分類為生物安全等級1生物體。mva-bn和衍生物的制劑已施用至許多類型的動物和超過2000名人類受試者，包括免疫缺陷型個體。所有疫苗接種已經證明總體上安全并良好耐受的。盡管其高減毒作用和減少的毒性，在臨床前研究中已顯示mva-bn引發對疫苗和由克隆到mva基因組中的基因所編碼的異源基因產物的體液和細胞免疫應答兩者[e.harrer等(2005),antivir.ther.10(2):285-300；a.cosma等(2003),vaccine22(1):21-9；m.dinicola等(2003),hum.genether.14(14):1347-1360；m.dinicola等(2004),clin.cancerres.,10(16):5381-5390]。

mva的“衍生物”或“變體”是指表現出與如本文所述的mva基本上相同的復制特性，但在其基因組的一個或多個部分中表現出差異的病毒。mva-bn以及mva-bn的衍生物或變體未能在人類和小鼠，甚至在嚴重免疫抑制小鼠體內繁殖性復制。更具體地，mva-bn或mva-bn的衍生物或變體也優選地也具有在雞胚胎成纖維細胞(cef)中復制性繁殖的能力，但是不具有在人類角質細胞系hacat[boukamp等(1988),j.cellbiol.106:761-771]、人類骨肉瘤細胞系143b(ecacc儲存號91112502)、人類胚胎腎細胞系293(ecacc儲存號85120602)和人類宮頸腺癌細胞系hela(atcc儲存號ccl-2)中復制性繁殖的能力。另外，mva-bn的衍生物或變體在hela細胞和hacat細胞系中具有比mva-575少兩倍，更優選地少三倍的病毒擴增率。mva變體的這些性質的測試和測定描述于wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中。

術語“不能繁殖性復制”或“不具有繁殖性復制的能力”描述于例如wo02/42480中，所述專利也教導如何獲得具有如上提及的所需性質的mva。所述術語適用于使用wo02/42480或美國專利號6,761,893中描述的測定在感染之后4天具有小于1的病毒擴增率的病毒，所述兩份專利均以引用的方式整體并入本文。

術語“未能繁殖性復制”是指在感染之后4天具有小于1的病毒擴增率的病毒。wo02/42480或美國專利號6,761,893中所描述的測定適用于測定病毒擴增率。

病毒的擴增或復制通常表示為由感染細胞產生的病毒(輸出)與最初用于首先感染細胞的量(輸入)的比率，所述比率稱為“擴增率”。“1”的擴增率定義在由感染細胞產生的病毒的量與初始用于感染細胞的量相同的情況下的擴增狀態，所述狀態意指感染細胞容許病毒感染和復制。相反，小于1的擴增率(即輸出與輸入水平相比的降低)指示繁殖性復制的缺少并且因此使病毒減毒。

基于mva的疫苗的優點包括其針對大范圍疫苗生產的安全性能以及可用性。臨床前測試顯示與其他mva病毒株相比，mva-bn展示出極好的減毒和功效(wo02/42480)。mva-bn病毒株另外的性質是當與dna初免/牛痘病毒加強方案相比時，在牛痘病毒初免/牛痘病毒加強方案中誘導基本上相同水平的免疫的能力。

重組mva-bn病毒為本文最優選的實施方案，其被視為安全的，因為它在哺乳動物細胞中有明顯的復制缺陷并且它有良好建立的無毒性。此外，除了重組mva-bn病毒的功效之外，工業規模生產的可行性也可為有利的。另外，基于mva的疫苗可遞送多種異源抗原并且允許同時誘導體液免疫和細胞免疫。

可使用本領域已知的方法，諸如在wo/2002/042480和wo/2002/24224中描述的方法制備適用于本發明的mva載體，所述專利的相關公開內容以引用的方式并入本文。

在另一方面，復制缺陷型mva病毒株也可為合適的，諸如病毒株mva-572、mva-575或任何相似減毒的mva病毒株。突變體mva也可以是合適的，諸如缺失的絨毛膜尿囊安卡拉牛痘病毒(dcva)。dcva包含mva基因組的缺失位點deli、delii、deliii、deliv、delv以及delvi。所述位點尤其適用于插入多個異源序列。dcva可在人類細胞系(諸如人類293、143b和mrc-5細胞系)中繁殖性復制(以大于10的擴增率)，然后使得通過對基于病毒的免疫策略有用的進一步突變來實現優化(參見wo2011/092029)。

在本發明的一個優選的實施方案中，mva載體包含編碼選自由以下組成的組的一個或多個抗原蛋白的核酸：扎伊爾埃博拉病毒(ebov)的gp、蘇丹埃博拉病毒(sudv)的gp、馬爾堡病毒(marv)的gp、塔伊森林病毒的np以及與它們基本上相似的gp或np。

絲狀病毒蛋白可以插入到mva的一個或多個基因間區(igr)中。在某些實施方案中，igr選自igr07/08、igr44/45、igr64/65、igr88/89、igr136/137和igr148/149。在某些實施方案中，少于5、4、3或2個igr的重組mva包含編碼絲狀病毒包膜糖蛋白和/或另一種絲狀病毒蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列。異源核苷酸序列可另外地或可替代地插入到一個或多個天然存在的缺失位點中，具體地為插入到mva基因組的主要缺失位點i、ii、iii、iv、v或vi中。在某些實施方案中，少于5、4、3或2個天然存在的缺失位點的重組mva包含編碼絲狀病毒包膜糖蛋白和/或另一種絲狀病毒蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列。

包含異源核苷酸序列的mva的插入位點的數目可為1、2、3、4、5、6、7個或更多，所述異源核苷酸序列編碼絲狀病毒蛋白的抗原決定簇。在某些實施方案中，異源核苷酸序列插入到4、3、2或更少個的插入位點中。優選地，使用兩個插入位點。在某些實施方案中，使用三個插入位點。優選地，重組mva包含至少2、3、4、5、6或7個插入到2或3個插入位點中的基因。

本文提供的重組mva病毒可通過本領域已知的常規方法產生。獲得重組痘病毒或將外源編碼序列插入到痘病毒基因組中的方法為本領域技術人員所熟知的。例如，標準分子生物技術方法，諸如dna克隆、dna和rna分離、蛋白質印跡分析、rt-pcr和pcr擴增技術描述于molecularcloning,alaboratorymanual(第二版)[j.sambrook等,coldspringharborlaboratorypress(1989)]，并且病毒的處理和操作技術描述于virologymethodsmanual[b.w.j.mahy等(編輯),academicpress(1996)]。相似地，mva的處理、操作和遺傳工程的技術和技能知識描述于molecularvirology:apracticalapproach[a.j.davison&r.m.elliott(編輯),thepracticalapproachseries,irlpressatoxforduniversitypress,oxford,uk(1993)(參見，例如，第9章：expressionofgenesbyvacciniavirusvectors)]和現代分子生物學方法[johnwiley&son,inc.(1998)(參見，例如，第16章，第iv章節：expressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaviralvector)]。

對于本文公開的各種重組mva的產生，不同的方法可以是適用的。待插入到病毒中的dna序列可放入到大腸桿菌質粒構建體中，與mva的dna區段同源的dna已插入到所述質粒構建體。單獨地，可將待插入的dna序列連接至啟動子。啟動子基因連鎖可定位在質粒構建體中，以使得啟動子-基因連鎖兩斷側接有與含有非必需基因座的mvadna區側接的dna序列同源的dna。所得質粒構建體可通過在大腸桿菌細菌內增殖來擴增并分離。包含待插入的dna基因序列的分離質粒可轉染到細胞培養物中，例如雞胚胎成纖維細胞(cef)的細胞培養物，同時用mva感染所述培養物。質粒中同源mvadna與病毒基因組之間的重組可分別產生通過外源dna序列的存在來改性的mva。

根據一個優選的實施方案，合適的細胞培養物的細胞諸如cef細胞可用痘病毒感染。隨后可用包含單個或多個外源或異源基因的第一質粒載體轉染感染的細胞，優選地在痘病毒表達控制元件的轉錄控制下。如上文所說明的，質粒載體也包含能夠引導外源序列插入到痘病毒基因組的選擇部分中的序列。任選地，質粒載體也含有包含可操作地連接到痘病毒啟動子的標記基因和/或選擇基因的盒。

合適的標記基因或選擇基因為例如編碼綠色熒光蛋白、β半乳糖苷、新霉素磷酸核糖基轉移酶或其他標記的基因。選擇基因盒或標記基因盒的使用簡化了所產生的重組痘病毒的鑒定和分離。然而，重組痘病毒也可通過pcr技術來鑒定。隨后，可以將另一種細胞用如上所述地獲得的重組痘病毒感染并且用包含單個或多個第二外源或異源基因的第二載體轉染。如果此基因應引入到痘病毒基因組的不同插入位點中，則第二載體在引導單個或多個第二外源基因整合到痘病毒基因組的痘病毒同源序列中有所不同。在發生同源重組后，可分離包含兩個或更多個外源或異源基因的重組病毒。為將另外的外源基因引入到重組病毒，可通過使用在先前的步驟中分離的重組病毒用于進行感染并且通過使用包含另一種單個或多個外源基因的另一種載體用于進行轉染來重復感染和轉染的步驟。

可替代地，如上所述的感染和轉染的步驟為可互換的，即合適的細胞可首先通過包含外源基因的質粒載體轉染并且然后用痘病毒感染。作為另一替代方案，可以將各個外源基因引入到不同病毒，使用所有獲得的重組病毒共同感染細胞并篩選包含全部外源基因的重組體。第三替代方案為將dna基因組與外源序列體外連接并且使用輔助病毒重建重組牛痘病毒dna基因組。第四替代方案為在大腸桿菌或另一種菌種內在克隆為細菌人工染色體(bac)的牛痘病毒基因組(諸如mva)與線性外源序列之間的同源重組，所述線性外源序列側接有與側接牛痘病毒基因組中所需的整合位點的序列同源的dna序列。

異源絲狀病毒基因可以在一個或多個痘病毒啟動子的控制下(即，可操作地連接到所述啟動子)。在某些實施方案中，痘病毒啟動子為pr7.5啟動子、雜合早期/晚期啟動子或prs啟動子、prs5e啟動子、合成或天然的早期或晚期啟動子或牛痘病毒ati啟動子。

免疫原性組合物

免疫原性組合物為包含免疫有效量的純化或部分純化的用于本發明的腺病毒或mva載體的組合物。根據本領域已熟知的方法，所述組合物可以配制為疫苗(也稱為“免疫原性組合物”)。所述組合物可包含增強免疫應答的佐劑。鑒于本公開，可以通過本領域技術人員已熟知的技術確定制劑中各種組分的最佳比率。

所述免疫原性組合物的制備和用途為本領域技術人員所熟知的。液態藥物組合物通常包含液態載體諸如水、石油、動物油或植物油、礦物油或合成油。可以包含生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇類諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

本發明的組合物還可包含任何抗原。這些抗原肽或多肽可以包括免疫原性序列，例如像腫瘤特異性抗原(tsa)、細菌、病毒、真菌以及原生動物抗原。

本發明的組合物可包含絲狀病毒抗原或者引發或加強接種可包含其他抗原。與本發明的腺病毒載體結合使用的其他抗原對本發明不是至關重要的并且可以是例如絲狀病毒抗原或表達所述抗原的核酸。

適用于本發明的免疫原性組合物可包含佐劑。

適于根據本發明共同施用的佐劑應為在人群中潛在安全的、良好耐受的且有效的佐劑，其包括qs-21、detox-pc、mpl-se、mogm-csf、titermax-g、crl-1005、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026,gsk-i、gcmaf、b-alethine、mpc-026、adjuvax、cpgodn、betafectin、alum以及mf59。

可以施用的其他佐劑包括凝集素、生長因子、細胞因子和淋巴因子諸如α干擾素、γ干擾素、血小板衍化生長因子(pdgf)、粒細胞集落刺激因子(gcsf)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gmcsf)、腫瘤壞死因子(tnf)、表皮生長因子(egf)、il-i、il-2、il-4、il-6、il-8、il-io和il-12或因此的編碼核酸。

本發明的組合物可包含藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩定劑或本領域技術人員所熟知的其他物質。所述物質應為無毒的并且應不干擾活性成分的功效。載體或其他物質的確切性質可取決于施用路徑，例如肌內、皮下、口服、靜脈內、皮膚、黏膜內(例如腸內)、鼻內或腹腔路徑。

用于增強免疫應答的方法

本發明提供一種在人類受試者中使用mva載體與腺病毒載體的組合引發并加強對任何抗原蛋白或其免疫原性多肽的免疫應答的方法。

根據本發明的一個總體方面，在人類受試者中誘導免疫應答的方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發免疫應答，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強免疫應答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對抗原蛋白的增強的免疫應答。

根據本發明的實施方案，增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的抗體應答。

優選地，增強的免疫應答還包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的cd4+應答或增強的cd8+t細胞應答。通過根據本發明的一個實施方案的方法產生的增強的cd4+t細胞應答可以是例如在人類受試者中針對抗原蛋白的主要cd4+t細胞應答的增強或誘導和/或對抗原蛋白特異的多功能cd4+t細胞的增加或誘導。多功能cd4+t細胞表達超過一種細胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。通過根據本發明的一個實施方案的方法產生的增強的cd8+t細胞應答可以是例如在人類受試者中對抗原蛋白特異的多功能cd8+t細胞的增加或誘導。

更優選地，由根據本發明的一個實施方案的方法產生的增強的免疫應答包括在人類受試者中針對抗原蛋白的增強的cd4+t細胞應答、增強的抗體應答和/或增強的cd8+t細胞應答。

在本發明的一個或多個實施方案中，一種或多種mva載體用于引發免疫應答，并且一種或多種rad26或rad35載體用于加強免疫應答。

在相應初免和加強組合物中的抗原(然而采用許多加強組合物)無需相同，但是應共享抗原決定簇或彼此基本上相似。

包含載體的免疫原性組合物的施用通常為肌內的或皮下的。然而也可設想其他施用方式諸如靜脈內、皮膚、皮內或經鼻施用。可以通過使用針注射腺病毒載體的懸浮液來實現免疫原性組合物的肌內施用。一種替代方案為使用無針注射裝置施用含有疫苗的組合物(使用，例如，biojector(tm))或凍干粉末。

對于靜脈內、皮膚或皮下注射或在患病位點注射，載體將為胃腸外可接受的水溶液形式，所述水溶液不含熱源并且具有合適的ph、等滲性和穩定性。本領域的技術人員能夠很好地使用例如等滲賦形劑諸如氯化鈉注射液、林格式注射液、乳酸林格式注射液制備合適的溶液。在需要時可以包含防腐劑、穩定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其他添加劑。也可采用緩慢釋放的制劑。

通常，施用將具有在感染或癥狀發展之前產生針對抗原的免疫應答的預防目的。可以根據本發明治療或預防的疾病和病癥包括免疫應答可以起保護或治療作用的疾病和病癥。在其他實施方案中，mva和腺病毒載體可以施用來用于暴露后預防。

將含有mva載體的免疫原性組合物施用于受試者，在受試者中產生免疫應答。組合物足以誘導可檢測免疫應答的量被定義為“免疫有效劑量”。如下所示的，本發明的免疫原性組合物誘導體液免疫應答以及細胞介導的免疫應答。在一個典型的實施方案中，免疫應答為保護性免疫應答。

施用的實際量以及施用的速率和時間過程將取決于所治療的疾病的性質和嚴重性。治療的處方(例如，劑量的確定等)在全科醫師和其他醫生的職責內，并且通常考慮待治療的病癥、個體患者的病狀、遞送的部位、施用的方法和醫師已知的其他因素。上文提及的技術和協議的實例可見于remington'spharmaceuticalsciences，第16版，osol，a編輯，1980。

在mva和腺病毒載體以及所述顆粒的任選制劑產生為組合物后，載體可以施用到個體，具體地為人類。

在一個示例性方案中，以含有約10⁴至10¹²個病毒顆粒/ml的濃度的約100μl至約10ml之間范圍的體積施用(例如，肌內地)腺病毒載體。優選地，以0.25與約1.0ml之間范圍的體積施用腺病毒載體。更優選地，以0.5ml的體積施用腺病毒載體。

通常，在一個施用期間以約10⁹至約10¹²個病毒顆粒(vp)的量，更通常地以約10¹⁰至約10¹²vp的量將腺病毒施用到人類受試者。在一個優選的實施方案中，以約5x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在另一個優選的實施方案中，以約0.8x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在另一個優選的實施方案中，以約2x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在另一個優選的實施方案中，以約4x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在某些實施方案中，腺病毒被配制為三價組合物，其中各自具有不同插入點的三種腺病毒混合在一起。在三價組合物中，各種不同的腺病毒優選地以約4x10¹⁰vp的量存在。在所述三價組合物中，每劑量腺病毒顆粒的總數達到約1.2x10¹¹vp。在另一個優選的實施方案中，三價組合物中各種不同的腺病毒優選地以約1x10¹¹vp的量存在。在所述三價組合物中，然后每劑量腺病毒顆粒的總數達到約3x10¹¹vp。在初始疫苗接種后為如上所述的加強疫苗接種。

在一個示例性方案中，以包含約1x10⁷tcid50至1x10⁹tcid50(50％組織培養感染劑量)或inf.u.(感染單位)的劑量的約100μl至約10ml之間范圍的體積的鹽溶液施用mva載體。優選地，以0.25與1.0ml之間范圍的體積施用mva載體。更優選地，以0.5ml的體積施用mva載體。

通常，在一個施用期間以約1x10⁷tcid50至1x10⁹tcid50(或inf.u.)的劑量將mva載體施用于人類受試者。在一個優選的實施方案中，以約5x10⁷tcid50至5x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在一個更優選的實施方案中，以約5x10⁷tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在一個更優選的實施方案中，以約1x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在另一個優選的實施方案中，以約1.9x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在又一個優選的實施方案中，以約4.4x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在一個更優選的實施方案中，以約5x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體

組合物在需要時可以存在于試劑盒、包裝或分配器中，其可以含有包含活性成分的一個或多個單位劑型。試劑盒例如可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包裝。試劑盒、包裝或分配器可以隨附施用說明書。

本發明的組合物可以單獨施用或與其他治療組合施用，同時或依次施用取決于待治療的病狀。

通常在施用初免組合物數周或數月后施用一次或多次加強組合物，例如，約1或2周、或3周、或4周、或6周、或8周、或12周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周或一到兩年。

優選地，在初免后1-12周或2-12周，更優選地在初免后1、2、4或8周給予初始加強接種。在一個優選的實施方案中，在初免后4或8周施用初始加強接種。在另外優選的實施方案中，在初免后至少1周、或至少2周、或至少4周進行初始加強。在另一個優選的實施方案中，在初免后4-12周或4-8周進行初始加強。

在根據所述方法的一個更優選的實施方案中，mva載體用于初免，隨后用rad26載體加強。優選地，在初免后1-12周，更優選地在初免后1、2、4或8周施用加強組合物。在一個優選的實施方案中，在初免后8周施用加強組合物。在另一個優選的實施方案中，在初免后1周施用加強組合物。在另一個優選的實施方案中，在初免后2周施用加強組合物。在另一個優選的實施方案中，在初免后4周施用加強組合物。

可以在初始加強之后進行一個或多次另外的加強施用。

在一個優選的實施方案中，加強組合物包含ad26載體。

在一個實施方案中，本發明涉及一種增強人類受試者中針對腫瘤的免疫應答的方法。所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發免疫應答，所述mva載體包含編碼由腫瘤細胞產生的抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強免疫應答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對腫瘤的增強的免疫應答。

優選地，增強的免疫應答為人類受試者提供針對腫瘤的保護性免疫。

在一個優選的實施方案中，在第一初免步驟后1-12周或2-12周進行加強步驟。也可以在比初免步驟后12周更晚時進行加強步驟。在另外優選的實施方案中，在初免步驟后至少2周或至少4周進行加強步驟。在其他優選的實施方案中，在初免步驟后4-12周或4-8周進行加強步驟。

在另一個實施方案中，加強步驟在初始加強施用之后重復一次或多次。

在另一個優選的實施方案中，腺病毒載體為ad26載體。

通過腫瘤細胞產生的抗原蛋白可以是任何腫瘤抗原。在一個優選的實施方案中，腫瘤抗原為僅存在于腫瘤細胞上的腫瘤特異性抗原。腫瘤抗原也可以是存在于一些腫瘤細胞上并且也存在于一些正常細胞上的腫瘤相關抗原。

根據另一個實施方案，本發明涉及一種增強在人類受試者中針對至少一種絲狀病毒亞型的免疫應答的方法。所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發免疫應答，所述mva載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強免疫應答，所述腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對至少一種絲狀病毒亞型的增強的免疫應答。

優選地，增強的免疫應答為人類受試者提供針對至少一種絲狀病毒亞型的保護性免疫。

在一個優選的實施方案中，在第一步驟后1-12周或2-12周，更優選地在初免后1、2、4或8周進行加強步驟。在另外優選的實施方案中，在初免后至少1周或至少2周進行加強步驟。在其他優選的實施方案中，在初免后4-12周或4-8周進行加強步驟。

也可以在比初免后12周更晚時進行加強步驟。

在另一個實施方案中，加強步驟在初始加強施用之后重復一次或多次，諸如初免后6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年。

在另一個優選的實施方案中，腺病毒載體為ad26載體。

在另一個優選的實施方案中，抗原蛋白為線狀病毒亞型的糖蛋白或核蛋白。

在本發明的一個實施方案中，在第一組合物中的mva載體包含編碼來源于超過一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的多核苷酸。更優選地，第一組合物中的mva載體包含編碼來自四種絲狀病毒亞型的具有seqidno:1、2、4和5的氨基酸序列的四種抗原蛋白或其免疫原性多肽的多核苷酸。

在本發明的另一個實施方案中，第二組合物包含至少一種腺病毒載體，其包含編碼來源于絲狀病毒亞型的抗原蛋白的多核苷酸，所述絲狀病毒亞型與由mva載體編碼的絲狀病毒亞型相同或不同。例如，腺病毒載體可以包含編碼具有選自由seqidno:1-5組成的組的氨基酸序列的抗原蛋白的多核苷酸。優選地，第二組合物可以包含超過一種腺病毒載體，所述腺病毒載體編碼來自超過一種絲狀病毒亞型的超過一種抗原蛋白或其免疫原性多肽。例如，第二組合物可以包含編碼具有seqidno:1、2和3的氨基酸序列的一至三種抗原蛋白的一至三種腺病毒載體。

實施例

提供以下實施例來說明，但并非限制所要求保護的發明。

實施例1

以鑒定針對多種[例如，馬爾堡、埃博拉(又稱扎伊爾)和蘇丹]絲狀病毒具有≥80％的實際功效的多價絲狀病毒疫苗為目標進行動物研究，以用于繼續推進發展。研究使用兩或三種疫苗接種測試延長的疫苗接種時間表并且測試使用異源(與同源相反)疫苗組合對于隨后對目標絲狀病毒的nhp免疫應答的影響。使用埃博拉病毒基奎特攻擊疫苗接種的nhp以測試所應用的疫苗接種的功效。

動物操作

這些研究符合動物福利法規最終條例(finalrulesoftheanimalwelfareactregulations)的所有適用章節(cfr第9篇，第1、2和3部分)和實驗室動物護理和使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)–nationalacademypress,washingtond.c.第八版(theguide)。

總計16只短尾獼猴(食蟹猴)(nhp)(12只雄性和4只雌性)，毛里求斯來源，短尾獼猴，4-5歲，每只大約4-8kg，購自primgen(hines,il)。動物在疫苗接種之前通過elisa在實驗上首次接種雷斯頓病毒(restv)。排除先前暴露于分枝桿菌肺結核、猿免疫缺陷病毒(siv)、猿t淋巴細胞病毒-1(stlv-1)、恒河猴皰疹病毒1(b型皰疹病毒)和猿逆轉錄病毒(srv1和srv2)的動物，測試沙門氏菌和志賀氏菌的活性感染并且確認對結核桿菌呈陰性。

絲狀病毒為危險組4(高度封閉的)病原體；因此在cdc認可的生物安全水平(bsl)-4/動物生物安全水平(absl-4)封閉設施下進行涉及扎伊爾埃博拉病毒、蘇丹埃博拉病毒或馬爾堡病毒的全部操作。

疫苗材料

通過crucellhollandb.v.生產rad載體。所述載體為包含在e1位點插入的腺病毒糖蛋白(gp)基因的純化的e1/e3缺失的復制缺陷型重組腺病毒類型26或類型35疫苗載體(分別為ad26和ad35)。這些載體在細胞中得以復蘇，噬斑純化，放大并且然后通過兩步cscl顯帶程序來純化，并且隨后在基于tris的制劑緩沖液中配制并且儲存在-65℃之下。這些載體的體內使用釋放包括生物載量測試、低內毒素水平(<5eu/ml)和轉基因的表達和完整的確認。

具體地，rad載體表達ebovmayingagp(seqidno:1)、sudv古盧gp(seqidno:2)和marv安哥拉gp(seqidno:3)。各種rad載體表達一種單一抗原蛋白(gp)。

mva載體由bavariannordic生產。具體地，mva多重載體(mva-bn-filo)表達4種不同的抗原蛋白：ebovmayingagp(seqidno:1)；sudv古盧gp(seqidno:2)；marv莫索克(musoke)gp(seqidno:4)；以及塔伊森林病毒(tafv)np(seqidno:5)。

疫苗材料儲存在-80℃溫控冷凍機中。

疫苗接種和實驗設計

關于研究分組和實驗設計，參見圖1和圖2。

已使用兩種不同的疫苗平臺對短尾獼猴(食蟹猴)(nhp)進行疫苗接種，每組2只動物，此外對照組由兩個首次(空載體)攻擊對照組成。在圖1所示的組中首先用重組載體對動物進行疫苗接種。將每只獼猴麻醉并且接受疫苗到左后大腿的肌內(im)注射。間隔4周或8周給予初免和加強劑量(圖1)。各個劑量的腺病毒由到左后大腿的單一im注射組成。皮下施用mva載體。

在第28天、第56天和第63天在室溫下將edta或肝素全血連夜運輸到texasbiomed。另外，當在texasbiomed飼喂動物時，在第77天收集肝素或edta全血。在所有這些時間點，將在texasbiomed處理edta全血以獲得pbmc和血漿。

使用埃博拉扎伊爾肽庫1和2、蘇丹古盧肽庫1和2、埃博拉病毒共有肽庫、馬爾堡安哥拉肽庫1和2以及馬爾堡病毒共有肽庫，連同僅dmso陰性對照和抗cd3刺激陽性對照，將pbmc用于ifn-gelispot測定。一式兩份進行全部刺激，合計每nhp20個孔。

另外，在第0天、第28天、第56天和第68天在bioqual處理不具有抗凝劑的全血以獲得血清并且在第77天在texasbiomed處理以獲得血清。在bioqual收集的等分試樣的血清將在第68天冷凍發送到texasbiomed。在zebovgp特異性elisa中測定各個血清。另外，在sebovgp和marvagp特異性elisa(兩種不同的測定)中測定來自第0天、第56天和第77天的血清。

表1：在用埃博拉病毒攻擊之前測量的參數

用于動物攻擊的絲狀病毒接種體

如圖2所示，在加強疫苗接種后約4周，用ebov攻擊動物。具體地，ebov基奎特-9510621用于動物攻擊并且由texasbiomed供應。ebov基奎特9510621的第二次細胞培養傳代(p2)在2012年獲自tomksiazek博士(在utmb健康加爾維斯頓國家實驗室的niaid的wrceva)并且在veroe6細胞中在texasbiomed第三次增殖并且具有2.1x10⁵pfu/ml的滴度。ebov基奎特-9510621。產品目錄號2012099171。

在收獲時的滴度：2.1x10⁵pfu/ml用于研究。

通過在與基因庫p2共有序列的僅有1個snp差異的情況下進行深測序來確認攻擊儲備物為野生型ebov基奎特9510621。攻擊儲備物作為包含含有10％fbs的培養基(mem)的500±50μl等分試樣儲存在液態氮蒸汽相中。對于100pfu攻擊，將絲狀病毒攻擊劑以磷酸緩沖鹽水稀釋至200pfu/ml的目標劑量。簡言之，通過以pbs進行三次連續的1:10稀釋來稀釋儲備病毒以獲得200pfu/ml攻擊材料濃度。給予每只動物合計0.5ml的攻擊材料。

在病毒注射之前，通過肌內注射telazol(2至6mg/kg；5至8mg/kg氯胺酮imprn，以用于輔助麻醉)來使猴子鎮靜。在研究的第0天，收集血液并且隨后通過在臂右三角肌中進行肌內注射來用0.5ml體積中的100pfu目標劑量的ebov攻擊每只猴子。記錄攻擊位點。

在施用病毒之后，將每只猴子返回居住籠并且觀察猴子直到其從麻醉中恢復(胸骨橫臥/維持直立姿勢的能力)。此研究中的終點為存活/未存活。通過患有終端疾病或處在瀕死狀態的動物來定義未存活。通過每日臨床觀察評分表來評估動物的健康。

抗ebovgpiggelisa

通過改性的酶聯免疫吸附測定(elisa)在表1描述的時間點測定絲狀病毒特異性體液應答，如先前sulivan等(2006)(immuneprotectionofnonhumanprimatesagainstebolaviruswithsinglelow-doseadenovirusvectorsencodingmodifiedgps.plosmedicine3,e177)所述，所述文獻以引用的方式整體并入本文。簡言之，用10μg/ml雪花蓮(galanthusnivalis)凝集素過夜涂覆elisa板。然后，在封端后，用埃博拉或馬爾堡病毒株特異性gp上清液涂覆所述板。通過用編碼缺失跨膜區和胞質尾區的絲狀病毒糖蛋白的表達質粒瞬時轉染hek293t來產生這些上清液。在以1:50開始的4倍稀釋系列中測試猴子血清樣品。通過在492nm處的比色法檢測結合igg。計算針對絲狀病毒糖蛋白病毒株特異性參考血清的相對血清滴度。在圖4-圖6中示出elisa測定的結果。

ifn-gelispot測定

通過干擾素γ酶聯免疫吸附測定(elisapot)在表1描述的時間點測定絲狀病毒特異性細胞免疫應答，如先前ophorst等2007(increasedimmunogenicityofrecombinantad35-basedmalariavaccinethroughformulationwithaluminiumphosphateadjuvant.vaccine25,6501-6510)所述，所述文獻以引用的方式整體并入本文。用于各種埃博拉和馬爾堡病毒株糖蛋白的刺激的肽庫由通過11個氨基酸重疊的15聚體組成。為將庫中太高數目的肽的不需要的影響最小化，將各個糖蛋白肽庫分成兩半，一個n末端和一個c末端。將與三種埃博拉病毒(扎伊爾、蘇丹和塔伊大森林)或兩種馬爾堡病毒(馬爾堡和ravn病毒)內超過九種連續氨基酸重疊的肽組合在共有庫中。在每種單一肽1μg/ml最終濃度下使用肽庫和單一肽。在圖7中示出elispot測定的結果。

如圖3-7中匯總的結果所示，本文的動物研究顯示rad和mva載體在用于預防靈長類動物中絲狀病毒感染的初免-加強組合中的實用性。具體地，一種或多種表達一種或多種類型的絲狀病毒的gp的rad26載體或者表達多重絲狀病毒抗原的mva載體的施用引起對一種或多種類型的絲狀病毒的體液應答的高效初免。在第8周用異源載體加強免疫后，全部疫苗方案對一種或多種類型的絲狀病毒誘導了相似的體液和細胞免疫應答并且提供針對高度致病的埃博拉扎伊爾攻擊的100％保護。

實施例2

進行第二個nhp研究，以確認在0-4周和0-8周間隔2個初免加強方案的免疫原性和保護功效。一個方案包括將單價ad26.zebov疫苗作為初免物并且將mva-bn-filo作為加強免疫物；另一個方案包括將mva-bn-filo作為初免物并且將ad26.zebov作為加強免疫物。全部免疫軍為肌內免疫。將ad26.zebov(5x10¹⁰vp)用作0-8周方案的初免物，并且將其與1x10⁸tcid50mva-bn-filo(4只nhp)和5x10⁸tcid50mva-bn-filo(4只nhp)的加強免疫物組合，以評定所述方案中標準劑量和高劑量的mva的影響。分別用1x10⁸tcid50mva-bn-filo和5x10⁸tcid50mva-bn-filo初免兩個另外組的4只nhp；隨后在兩種情況下在4周后用ad26.zebov(5x10¹⁰vp)加強，以測試4-周方案中mva-bn-filo劑量作為初免物的影響。另外，先用ad26.zebov(5x10¹⁰vp)隨后通過1x10⁸tcid50mva-bn-filo初免2只nhp。最終，用空ad26載體(不表達任何絲狀病毒抗原，5x10¹⁰vpim)免疫2只nhp并且tbs作為研究的陰性免疫對照。在最后用100pfu的ebov基奎特1995野生型p3攻擊病毒進行免疫的4周后攻擊全部動物。此研究的分組匯總在表2中。

表2：用ebov攻擊的非人靈長類動物中的保護研究的實驗分組

縮寫：tbs:tris-緩沖鹽水；tcid50：50％組織培養感染劑量；vp：病毒顆粒。粗體表示100％存活。

免疫原性

nhp中的免疫應答特征為與絲狀病毒gp結合和中和抗體(elisa)以及產細胞因子t細胞(elispot)有關。

elisa：

通過針對全部時間點的gp特異性elisa來分析ebovmayingagp反應抗體(參見圖20)。如實驗1中所述地進行抗ebovgpiggelisa。在對照疫苗接種的動物中未觀察到elisa滴度。疫苗方案在全部動物中均為免疫原性的。在b組中觀察到最高滴度，該組以8-周間隔接受ad26.zebov和高劑量的mva-bn-filo。

保護功效

8-周ad26.zebov/mva-bn-filo初免/加強方案兩者使得在ebov攻擊之后能完全存活，而不論mva-bn-filo的劑量(1×10⁸tcid50或5×10⁸tcid50)如何。另外，ad26.zebov/mva-bn-filo的4-周方案在2只nhp的2只中給予保護。4-周mva-bn-filo/ad26.zebov方案兩者在4只nhp的2只中給予保護。

實施例3

在人類中使用1x10⁸tcid50劑量的mva-bn-filo和5x10¹⁰vp劑量的ad26.zebov進行臨床研究以評估方案的安全性、耐受性和免疫原性。研究由兩部分組成。

主要的研究為在72位健康成人受試者中進行的隨機的、安慰劑對照的、觀察者雙盲的研究，所述受試者之前未接受過實驗性埃博拉候選疫苗并且不具有已知的對埃博拉病毒的暴露或埃博拉疾病的診斷。在此研究中測試4種方案：2種方案以28或56天間隔將mva-bn-filo作為初免物并將ad26.zebov作為加強免疫物，并且2個方案以28或56天間隔將ad26.zebov作為初免物并將mva-bn-filo作為加強免疫物。

子研究由評估方案的安全性、耐受性和免疫原性的開放性、無對照的非隨機化治療臂組成，所述方案用5x10¹⁰vp劑量的ad26.zebov作為初免物并在14天后用1x10⁸tcid50劑量的mva-bn-filo作為增強免疫物，并且在15位健康成人受試者中進行所述子研究。

研究由疫苗接種周期組成，其中在基線(第1天)處疫苗接種受試者，隨后在第15天、第29天或第57天進行加強，并且進行加強后隨訪，直到全部受試者已進行其21天加強后訪問(第36天、第50天或第78天)或更早中斷。

主要研究中的受試者加入各有18位健康受試者的4個不同組。總之，在組內以5:1比率隨機分配受試者，以如下通過im注射(0.5ml)接受活性疫苗或安慰劑(0.9％生理鹽水)：

·在第1天注射mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)，隨后在第29天(組1)或第57天(組2)進行ad26.zebov(5x10¹⁰vp)的加強注射，或者

·在第1天注射ad26.zebov(5x10¹⁰vp)，隨后在第29天(組3)或第57天(組4)進行mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)的加強注射。

子研究中的15位受試者如下通過im注射(0.5ml)接受活性疫苗：

·在第1天注射ad26.zebov(5x10¹⁰vp)，隨后在第15天(組5)進行mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)的加強注射。

示例性研究疫苗接種時間表匯總在表3中。

表3：研究疫苗接種時間表

n：接受研究疫苗的受試者的數目；tcid50：50％組織培養感染劑量；vp：病毒顆粒

通過收集訴求的局部和全身性不良事件、未訴求的不良事件和嚴重不良事件并且通過身體檢查來評定安全性。另外，在多個時間點評定標準化學參數、血液學參數(包括凝血參數)和尿分析參數。

使用匯總在表4和表5中的免疫學測定評定免疫原性。探索性測定包可包括但不限于列出的測定。

表4：免疫學測定的匯總(血清學)

表5：免疫學測定的匯總(細胞)

安全性測定

通過收集訴求的局部和全身性不良事件、未訴求的不良事件和嚴重不良事件并通過身體檢查來評定安全性。另外，在多個時間點評定標準化學參數、血液學參數(包括凝血參數)和尿分析參數。

首先來自人類的這些參數的安全性數據顯示，兩種疫苗在具有通常預期來自疫苗接種的瞬時反應的階段似乎為良好耐受的。無顯著不良事件與疫苗方案相關聯。大多數事件為溫和的,發生在疫苗接種后一至兩天并且平均持續一至兩天。觀察到非常少的發熱情況。

免疫應答的評定

加強免疫達21天后使用elisa測定分析結合到ebovgp的抗體，使用elispot測定分析ebovgp特異性t細胞應答，并且使用ics測定檢測對ebovgp的cd4+和cd8+t細胞應答，從而評定免疫原性。在第1天、第8天、第29天、第36天和第50天在組1和組3中并且在第1天、第8天、第29天、第57天、第64天和第78天為組2和組4收集用于分析由研究疫苗誘導的體液和細胞免疫應答的樣品。

體液免疫應答的評定

通過抗ebovgpelisa測定來評定研究疫苗誘導的結合抗體應答(圖8)。重要的是，接受疫苗方案的全部受試者在加強免疫21天后顯示血清轉化。當在7％至40％的受試者中僅觀察到用mva-bn-filo初免后產生的低水平的ebovgp特異性免疫應答時，通過在初免28天或56天后施用的ad26.zebov進行加強后觀察到強抗原特異性應答。出人意料地，所述應答的強度高于加強免疫21天后在相同的初免-加強時間間隔由相反的疫苗方案誘導的應答的強度(組3和組4分別用ad26.zebov初免，隨后在28或56天后用mva-bn-filo加強)[對于組1和組3分別為具有eu/ml10573(6452；17327)和4274(2350；7775)的95％置信區間的幾何平均滴度，并且對于組2和組4分別為具有eu/ml18729(12200；28751)和7553(511；1115)的95％置信區間的幾何平均滴度]。

必須指出，在非人靈長類動物(nhp)中，加強用ad26進行的mva初免引起ebovgp特異性免疫應答，所述應答在強度上相當于在相同的初免-加強時間間隔時由相反的疫苗方案(ad/mva)誘導的應答(參見圖4)，或者在強度上更低(圖20)。因此，對于nhp的一個特異性初免-加強方案觀察到的免疫應答不預測在人類中在相同的初免-加強方案后觀察到的免疫應答。

細胞免疫應答的評定

通過干擾素γ(ifn-γ)elispot和ics測量ebovgp特異性細胞免疫應答。為評定細胞免疫應答，將儲存的pbmc(外周血單核細胞)解凍并用2個庫(庫1和庫2)中組織的肽刺激。在圖9中示出每個庫中刺激的t細胞應答的總和。

通過elispot分析(圖9)，在用ad26.zebov引發免疫后第29天在50％至60％受試者中可容易地檢測ifn-γ應答(對于組3和組4，平均ifn-γ應答分別為103個和58個斑點形成單位/每百萬pbmc)并且在ad26.zebov引發免疫后第57天在86％受試者中可容易地檢測ifn-γ應答(組4，平均ifn-γ應答為283個斑點形成單位/百萬(sfu/10⁶)pbmc)。通過在第29天或第57天用mva-bn-filo進行免疫來進一步加強這些應答(對于組3，87％的應答者，平均ifn-γ應答為463sfu/10⁶pbmc；對于組4，86％的應答者，648sfu/10⁶pbmc)并且這些應答維持在加強后第21天的水平(對于組3，79％應答者，平均ifn-γ應答為390sfu/10⁶pbmc并且對于組4，100％應答者，464sfu/10⁶pbmc)。

相比之下，在mva初免后僅可檢測到非常低水平的ebovgp-特異性ifn-γ分泌細胞(對于組1和組2而言，在第29天分別有7％和0％應答者)。然而，分別在第29天和第57天加強的93％和100％受試者中出乎意料地觀察到強ifn-γ應答，在ad26.zebov加強后7天達到峰值(平均應答為882和440水平高于使用相同時間表的ad26.zebov-prime/mva-bn-filo-加強組合之后觀察到的水平(組3和組4)。

圖10-圖15中示出通過ics進行的測量特異性cd4+和cd8+t細胞應答的細胞測定的結果。

正如預期的，在安慰劑免疫的個體中未觀察到ebovgp特異性cd8+或cd4+t細胞應答(圖10和圖13)。在用mva-bn-filo引發免疫后第29天或第57天未觀察到cd8+細胞因子應答(組1和組2)。然而，在用ad26.zebov加強7天后在53％的受試者中觀察到疫苗誘導的cd8+t細胞應答(當分別在第29天或第57天施用ad26加強免疫時，平均總細胞因子應答為：0.08％和0.07％；圖10)。在加強免疫后第21天維持此應答(當分別在第29天或第57天施用ad26來加強免疫時，平均總細胞因子應答為：0.1％和0.06％；圖10)。相比之下，接受使用ad26.zebov引發免疫(組3和組4)的57％受試者在第29天顯示cd8+t細胞應答(平均總細胞因子應答：分別為0.12％和0.05％)，在ad26.zebov引發免疫(組4)后第57天86％的受試者顯示cd8+t細胞應答(平均總細胞因子應答：0.19％)。在第29天用mva-bn-filo加強免疫后進一步增強此應答，在加強的7和21天后分別有67％和73％的受試者應答(平均應答：兩天皆為0.27％)。

出人意料地，雖然與組3(ad26-mva初免-加強0-28天時間表)相比，在組1中觀察到更小百分比的應答者(mva-ad26初免-加強0-28天時間表)，但是在這些應答者中由mva-ad26初免-加強方案誘導的多功能cd8+t細胞(表達超過一種細胞因子的cd8+t細胞)的比例相比于由ad26-mva初免-加強方案誘導的多功能cd8+t細胞的比例在加強后更高(圖11)。在第57天施用初免物和加強免疫物時，未觀察到此差異。使用此時間表，mva初免ad26加強方案(組2)和ad26初免mva加強(組4)方案兩者相似地誘導高比例的多功能cd8+t細胞(圖12)。

出人意料地，先用mva-bn-filo引發免疫，隨后以28天間隔用ad26.zebov加強免疫(組1)來誘導非常激烈的cd4+t細胞應答，所述應答在加強免疫7天后達到峰值(93％應答者，平均總細胞因子應答為0.37％；圖13)。在峰值處，所述cd4+t細胞應答的強度比先用ad26.zebov引發免疫隨后以28天間隔用mva-bn-filo加強免疫后(67％應答者，平均總細胞因子應答為0.11％)的組3中可見的強度更高。在加強21天后，由兩種方案誘導的cd4+t細胞應答為相當的。將mva-bn-filo/ad26.zebov方案的間隔時間延長到56天，這引起更低的cd4+t細胞應答。ad26.zebov/mva-bn-filo方案在28天間隔時誘導略低的cd4+t細胞應答并且在56天間隔時誘導相當的應答。由兩種疫苗組合誘導的cd4+t細胞主要為多功能的(圖14和圖15)。

評定先用5x10¹⁰vp的ad26.zebov初免隨后在14天后用1x10⁸tcid50mva-bn-filo加強的免疫原性的子研究的結果匯總如下。

總之，使用初免和加強之間的14天間隔的此相對短的方案已顯示為免疫原性的。通過elisa評定對疫苗接種的體液免疫應答。當對更長的間隔進行觀察時，全部受試者通過加強免疫21天后顯示血清轉化(圖16a)。此外，加強免疫21天后在92％的受試者中通過elispot觀察到細胞免疫應答(圖16b)。此細胞免疫應答由cd4+(67％應答者，加強后第21天平均應答為0.08％)和cd8+(64％應答者，加強后第7天平均應答為0.15％)特異性t細胞兩者組成。使用在初免與加強之間的2周間隔誘導的免疫應答比在使用更長間隔時誘導的應答略低(參考之前的章節)。

實施例4

進行隨機的、安慰劑對照的、觀察者雙盲的研究(在合計6名標記研究受試者的初始開放性疫苗接種之前)，以評估如下異源方案的安全性、耐受性和免疫原性：(a)將單一劑量的mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)或安慰劑(0.9％生理鹽水)作為初免物隨后在不同時間點(初免后14、28或56天；組1至組3)用單一劑量的ad26.zebov(5x10¹⁰vp)或安慰劑作為加強免疫物，以及(b)將單一劑量的ad26.zebov(5x10¹⁰vp)或安慰劑作為初免物隨后在初免28天后用單一劑量的mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)或安慰劑作為加強免疫物后(組4)。

為獨立評定2種疫苗的安全性，包括組5和組6，其中2個單一劑量的mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)或安慰劑或2個單一劑量的ad26.zebov(5x10¹⁰vp)或安慰劑的同源方案以1和15天的更短初免-加強時間表來施用。在大約92位年齡在18歲與50歲(包括50歲)之間的健康受試者的目標中進行所述研究，所述受試者之前未接受過實驗性埃博拉候選疫苗并且不具有已知的對埃博拉疾病的暴露或診斷。

研究由疫苗接種時段組成，其中受試者在其基線訪問(第1天)時進行疫苗接種，隨后在第15天、第29天或第57天進行加強，并且加強后隨訪直到全部受試者已進行其21天加強后訪問或更早中斷。此時，研究將為非盲的。

受試者加入6個不同組，各組包含18位(組1至組4)或10位(組5和組6)健康受試者。在組1至組4內，在整個研究中以5:1的比率隨機分配患者以接受活性疫苗或安慰劑。組5和組6各自以按開放方式接受活性疫苗的3位受試者的標記群組開始，隨后為以6:1比率隨機分配以接受活性疫苗或安慰劑的7位受試者的雙盲群組。

不同組中的研究疫苗接種時間表匯總在表6中。

表6：研究疫苗接種時間表

在全部組中mva-bn-filo劑量水平為1x10⁸tcid50(50％組織培養感染劑量)；在全部組中ad26.zebov劑量水平為5x10¹⁰vp(病毒顆粒)；安慰劑為0.9％生理鹽水

通過收集訴求的局部和全身性不良事件、未訴求的不良事件和嚴重不良事件并且通過身體檢查來評定安全性。另外，在多個時間點評定標準化學參數、血液學參數(包括凝血參數)和尿分析參數。

使用匯總在表7和表8中的免疫學測定評定免疫原性。探索性測定包可包括但不限于列出的測定。

表7：免疫學測定的匯總(血清學)

表8：免疫學測定的匯總(細胞)

伊森林病毒；tnf：腫瘤壞死因子

臨床研究正在進行。如下描述一些初始結果。

體液免疫應答的評定

如圖17所示，當通過elisa評定時，全部受試者在加強免疫21天后顯示血清轉化。與先前的實驗相似，當將mva用作初免物并且在28天后將ad26作為加強免疫物施用時(組2，幾何平均濃度eu/ml6987)，與相反的疫苗免疫順序(組4，幾何平均濃度eu/ml2976)相比，在加強免疫21天后觀察到更高的免疫反應。

體液免疫應答的強度和初免與加強之間的間隔相關聯，與更短時間表相比(組1，14天間隔，幾何平均濃度eu/ml4418，以及組2，28天間隔，幾何平均濃度eu/ml6987)，當使用mva初免與ad26加強之間的56天間隔時(組3，幾何平均濃度eu/ml14048)觀察到更高抗體濃度。

出人意料地，當將mva-bn-filo用作初免物并且隨后在14天后用ad26.zebov加強免疫時，觀察到激烈的體液免疫應答，如由elisa評定的。接受疫苗方案的全部受試者在加強免疫21天后顯示血清轉化，并且比起當使用28天間隔的ad26初免mva加強組合，在此時間點的抗體濃度達到相似或更高的水平(幾何平均濃度分別為eu/ml4418和2976)。出人意料地，由14天間隔的此mva/ad26初免加強組合誘導的抗體濃度明顯高于由相同初免加強時間間隔的相反疫苗方案誘導的應答(參考實施例2，圖16a，幾何平均濃度eu/ml915)。這確認mva初免ad26加強組合誘導激烈的免疫應答以及當使用短初免加強間隔時(14天)所述組合的優勢。

細胞免疫應答的評定

通過干擾素γ(ifn-γ)elispot和ics測量ebovgp特異性細胞免疫應答。為評定細胞免疫應答，將儲存的pbmc(外周血單核細胞)解凍并用2個庫(庫1和庫2)中組織的肽刺激。在圖18-圖19中示出每庫中刺激的t細胞應答的總和。

出人意料地，當使用mva-bn-filo作為初免物隨后用ad26.zebov作為加強免疫物時，與由28天間隔(組2，73％和67％應答者，在加強后第7天和第21天的平均應答為427和375sfu/10⁶pbmc)或56天間隔(組3，47％應答者，在加強后第7天和第21天的平均應答為118和153sfu/10⁶pbmc)誘導的應答相比，當使用初免與加強之間更短的14天間隔時(對于組1，87％和93％應答者，在加強后第7天和第21天分別為395和577sfu/10⁶pbmc)觀察到更強的應答。

顯著地，由14天間隔的mva-bn-filo初免ad26.zebov加強誘導的細胞免疫應答與ebovgp特異性cd8+和cd4+t細胞應答兩者取得良好平衡(對于cd4+和cd8+t細胞兩者有73％應答者，在加強后第7天和第21天cd4+平均總細胞因子應答分別為0.15％和0.19％；在加強后第7天和第21天cd8+平均總細胞因子應答分別為0.19％和0.34％；圖19a和圖19b)。由此疫苗組合誘導的cd8+和cd4+t細胞兩者主要為多功能的(圖19c和圖19d)。

出乎意料地，由14天間隔的此mva/ad26初免加強組合誘導的細胞免疫應答明顯高于由使用相同初免加強時間間隔的相反疫苗方案誘導的應答(參考實施例2，圖16b、圖16c和圖16d)。這證實當使用短初免加強時間間隔(14天)時mva初免ad26加強組合的潛能。

以下表9-12呈現為本文表現的臨床研究的匯總。在實施例3和4中呈現的研究分別為編號的研究1001和1002。

表9為實施例3和4所述的研究期間在elisa測定中確定的體液免疫應答的匯總。

表9：臨床研究中elisa滴度的概況

數據呈現為以elisa/ml計的幾何平均濃度(gmc)。各個時間點應答者的百分比指示在括號中；ad26：用ad26.zebov進行免疫；mva：用mva-bn-filo進行免疫；初免加強時間表指示在表頭中。0，14：初免與加強免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強免疫之間的56天間隔；*：加強的天數；gmc：幾何平均濃度。研究1001描述于實施例3并且研究1002描述于實施例4。

表10為實施例3和4所述的研究期間在elispot測定中確定的細胞免疫應答的匯總。

表10：在臨床研究中通過elispot測定的細胞免疫應答的概況

數據呈現為平均sfu/10⁶pbmc。各個時間點應答者的百分比指示在括號中；ad26：用ad26.zebov進行免疫；mva：用mva-bn-filo進行免疫；初免加強時間表指示在表頭中。0，14：初免與加強免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強免疫之間的56天間隔；加強的天數；sfu：斑點形成單位；pbmc：外周血單核細胞。研究1001描述于實施例3并且研究1002描述于實施例4。

表11為實施例3和4所述的研究期間通過細胞內細胞因子染色(ics)確定的cd4+t細胞應答的匯總。

表11：臨床研究中通過ics測定的cd4+t細胞免疫應答的概況

數據呈現為以％計的平均總體cd4+細胞因子應答。各個時間點應答者的百分比指示在括號中；ad26：用ad26.zebov進行免疫；mva：用mva-bn-filo進行免疫；初免加強時間表指示在表頭中。0，14：初免與加強免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強免疫之間的56天間隔；*：加強的天數。研究1001描述于實施例3并且研究1002描述于實施例4。

表12為實施例3和4所述的研究期間通過細胞內細胞因子染色(ics)確定的cd8+t細胞應答的匯總。

表12：臨床研究中通過ics測定的cd8+t細胞免疫應答的概況

數據呈現為以％計的平均總體cd8+細胞因子應答。各個時間點應答者的百分比指示在括號中；ad26：用ad26.zebov進行免疫；mva：用mva-bn-filo進行免疫；初免加強時間表指示在表頭中。0，14：初免與加強免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強免疫之間的56天間隔；*：加強的天數。研究1001描述于實施例3并且研究1002描述于實施例4。

應該理解本文所描述的實施例和實施方案僅出于說明目的，并且將建議本領域技術人員根據它們進行各種修改或變化，并且它們被包括在本申請的精神和范圍以及隨附權利要求書的范圍之內。

序列表

seqidno:1

糖蛋白埃博拉扎伊爾病毒，mayinga病毒株(氨基酸序列)：

mgvtgilqlprdrfkrtsfflwviilfqrtfsiplgvihnstlqvsdvdklvcrdklsstnqlrsvglnlegngvatdvpsatkrwgfrsgvppkvvnyeagewaencynleikkpdgseclpaapdgirgfprcryvhkvsgtgpcagdfafhkegafflydrlastviyrgttfaegwaflilpqakkdffsshplrepvnatedpssgyysttiryqatgfgtneteylfevdnltyvqlesrftpqfllqlnetiytsgkrsnttgkliwkvnpeidttigewafwetkknltrkirseelsftvvsngaknisgqspartssdpgtntttedhkimasenssamvqvhsqgreaavshlttlatistspqslttkpgpdnsthntpvykldiseatqveqhhrrtdndstasdtpsattaagppkaentntskstdfldpatttspqnhsetagnnnthhqdtgeesassgklglitntiagvaglitggrrtrreaivnaqpkcnpnlhywttqdegaaiglawipyfgpaaegiyieglmhnqdglicglrqlanettqalqlflrattelrtfsilnrkaidfllqrwggtchilgpdcciephdwtknitdkidqiihdfvdktlpdqgdndnwwtgwrqwipagigvtgviiavialfcickfvf

seqidno：2

糖蛋白埃博拉蘇丹病毒，古盧病毒株(氨基酸序列)：

mgglsllqlprdkfrkssffvwviilfqkafsmplgvvtnstlevteidqlvckdhlastdqlksvglnlegsgvstdipsatkrwgfrsgvppkvvsyeagewaencynleikkpdgseclppppdgvrgfprcryvhkaqgtgpcpgdyafhkdgafflydrlastviyrgvnfaegviaflilakpketflqsppireavnytentssyyatsyleyeienfgaqhsttlfkidnntfvrldrphtpqflfqlndtihlhqqlsnttgrliwtldaninadigewafwenkknlseqlrgeelsfealslnetedddaassritkgrisdratrkysdlvpknspgmvplhipegettlpsqnstegrrvgvntqetitetaatiigtngnhmqistigirpsssqipssspttapspeaqtptthtsgpsvmateepttppgsspgptteaptlttpenittavktvlpqestsnglitstvtgilgslglrkrsrrqtntkatgkcnpnlhywtaqeqhnaagiawipyfgpgaegiyteglmhnqnalvcglrqlanettqalqlflrattelrtytilnrkaidfllrrwggtcrilgpdcciephdwtknitdkinqiihdfidnplpnqdnddnwwtgwrqwipagigitgiiiaiiallcvckllc

seqidno：3

糖蛋白馬爾堡安哥拉病毒(氨基酸序列)：

mkttcllisliliqgvktlpileiasniqpqnvdsvcsgtlqktedvhlmgftlsgqkvadspleaskrwafragvppknveytegeeaktcynisvtdpsgksllldpptnirdypkcktihhiqgqnphaqgialhlwgafflydriasttmyrgkvftegniaamivnktvhkmifsrqgqgyrhmnltstnkywtssngtqtndtgcfgtlqeynstknqtcapskkplplptahpevkltststdatklnttdpnsddedlttsgsgsgeqepyttsdaatkqglsstmpptpspqpstpqqggnntnhsqgvvtepgktnttaqpsmpphntttistnntskhnlstpsvpiqnatnyntqstapeneqtsapskttllptenpttakstnstksptttvpnttnkystspsptpnstaqhlvyfrrkrnilwregdmfpfldglinapidfdpvpntktifdessssgasaeedqhaspnisltlsyfpkvnentahsgenendcdaelriwsvqeddlaaglswipffgpgieglytagliknqnnlvcrlrrlanqtakslelllrvtteertfslinrhaidfllarwggtckvlgpdccigiedlsrniseqidqikkdeqkegtgwglggkwwtsdwgvltnlgillllsiavlialscicriftkyig

seqidno：4

糖蛋白馬爾堡莫索克病毒(氨基酸序列)：

mkttcflisliliqgtknlpileiasnnqpqnvdsvcsgtlqktedvhlmgftlsgqkvadspleaskrwafrtgvppknveytegeeaktcynisvtdpsgksllldpptnirdypkcktihhiqgqnphaqgialhlwgafflydriasttmyrgkvftegniaamivnktvhkmifsrqgqgyrhmnltstnkywtssngtqtndtgcfgalqeynstknqtcapskippplptarpeikltstptdatklnttdpssddedlatsgsgsgerephttsdavtkqglsstmpptpspqpstpqqggnntnhsqdavteldknnttaqpsmpphntttistnntskhnfstlsaplqnttndntqstiteneqtsapsittlpptgnpttakstsskkgpattapnttnehftsppptpsstaqhlvyfrrkrsilwregdmfpfldglinapidfdpvpntktifdessssgasaeedqhaspnisltlsyfpninentaysgenendcdaelriwsvqeddlaaglswipffgpgieglytavliknqnnlvcrlrrlanqtakslelllrvtteertfslinrhaidflltrwggtckvlgpdccigiedlskniseqidqikkdeqkegtgwglggkwwtsdwgvltnlgillllsiavlialscicriftkyig

seqidno：5

核蛋白埃博拉塔伊森林/象牙海岸病毒(氨基酸序列)：

mesrahkawmthtasgfetdyhkiltaglsvqqgivrqrviqvhqvtnleeicqliiqafeagvdfqesadsfllmlclhhayqgdykqflesnavkyleghgfrfevrkkegvkrleellpaassgksirrtlaampeeetteanagqflsfaslflpklvvgekaclekvqrqiqvhseqgliqyptawqsvghmmvifrlmrtnflikfllihqgmhmvaghdandaviansvaqarfsgllivktvldhilqktehgvrlhplartakvknevnsfkaalsslaqhgeyapfarllnlsgvnnlehglfpqlsaialgvatahgstlagvnvgeqyqqlreaateaekqlqkyaesreldhlglddqekkilkdfhqkkneisfqqttamvtlrkerlaklteaitstsllktgkqydddndipfpgpindnenseqqdddptdsqdttipdiivdpddgrynnygdypsetanapedlvlfdledgdeddhrpssssennnkhsltgtdsnktsnwnrnptnmpkkdstqnndnpaqraqeyardniqdtptphraltpiseetgsnghneddidsipplesdeenntettitttknttappapvyrsnsekeplpqeksqkqpnqvsgsentdnkphseqsveemyrhilqtqgpfdailyyymmteepivfstsdgkeyvypdslegehppwlsekealnednrfitmddqqfywpvmnhrnkfmailqhhk

序列表

<110>巴法里安諾迪克有限公司

詹森疫苗及預防私人有限公司.

美利堅合眾國,由健康及人類服務部部長代表

<120>用于增強免疫應答的方法和組合物

<130>bn0088pct-ii

<150>us62/045,522

<151>2014-09-03

<150>us62/116,021

<151>2015-02-13

<150>us62/159,823

<151>2015-05-11

<150>us62/189,109

<151>2015-07-06

<160>5

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>676

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>糖蛋白埃博拉扎伊爾病毒(ebolaviruszaire)，病毒株mayinga

<400>1

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151015

thrserphepheleutrpvalileileleupheglnargthrpheser

202530

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leuleuglnargtrpglyglythrcyshisileleuglyproaspcys

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lysphevalphe

675

<210>2

<211>676

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>糖蛋白埃博拉蘇丹病毒(ebolavirussudan)，病毒株古盧(gulu)

<400>2

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151015

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202530

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505560

servalglyleuasnleugluglyserglyvalserthraspilepro

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859095

valsertyrglualaglyglutrpalagluasncystyrasnleuglu

100105110

ilelyslysproaspglyserglucysleuproproproproaspgly

115120125

valargglypheproargcysargtyrvalhislysalaglnglythr

130135140

glyprocysproglyasptyralaphehislysaspglyalaphephe

145150155160

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<213>人工序列

<220>

<223>糖蛋白馬爾堡安哥拉病毒(marburgvirusangola)

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<213>人工序列

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<223>糖蛋白馬爾堡莫索克病毒(marburgvirusmusoke)

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asnprohisalaglnglyilealaleuhisleutrpglyalaphephe

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145150155160

thrgluglyasnilealaalametilevalasnlysthrvalhislys

165170175

metilepheserargglnglyglnglytyrarghismetasnleuthr

180185190

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proprothrglyasnprothrthralalysserthrserserlyslys

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proproprothrproserserthralaglnhisleuvaltyrphearg

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arglysargserileleutrparggluglyaspmetphepropheleu

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aspglyleuileasnalaproileasppheaspprovalproasnthr

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lysthrilepheaspgluserserserserglyalaseralagluglu

465470475480

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aspalagluleuargiletrpservalglngluaspaspleualaala

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glyleusertrpileprophepheglyproglyilegluglyleutyr

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thralavalleuilelysasnglnasnasnleuvalcysargleuarg

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565570575

thrthrglugluargthrpheserleuileasnarghisalaileasp

580585590

pheleuleuthrargtrpglyglythrcyslysvalleuglyproasp

595600605

cyscysileglyilegluaspleuserlysasnilesergluglnile

610615620

aspglnilelyslysaspgluglnlysgluglythrglytrpglyleu

625630635640

glyglylystrptrpthrserasptrpglyvalleuthrasnleugly

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ileleuleuleuleuserilealavalleuilealaleusercysile

660665670

cysargilephethrlystyrilegly

675680

<210>5

<211>739

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>核蛋白埃博拉塔伊森林/象牙海岸病毒(ebolavirustaiforest/ivorycoast)

<400>5

metgluserargalahislysalatrpmetthrhisthralasergly

151015

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202530

glnglyilevalargglnargvalileglnvalhisglnvalthrasn

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leuglugluilecysglnleuileileglnalapheglualaglyval

505560

asppheglngluseralaaspserpheleuleumetleucysleuhis

65707580

hisalatyrglnglyasptyrlysglnpheleugluserasnalaval

859095

lystyrleugluglyhisglypheargphegluvalarglyslysglu

100105110

glyvallysargleuglugluleuleuproalaalaserserglylys

115120125

serileargargthrleualaalametprogluglugluthrthrglu

130135140

alaasnalaglyglnpheleuserphealaserleupheleuprolys

145150155160

leuvalvalglyglulysalacysleuglulysvalglnargglnile

165170175

glnvalhissergluglnglyleuileglntyrprothralatrpgln

180185190

servalglyhismetmetvalilepheargleumetargthrasnphe

195200205

leuilelyspheleuleuilehisglnglymethismetvalalagly

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hisaspalaasnaspalavalilealaasnservalalaglnalaarg

225230235240

pheserglyleuleuilevallysthrvalleuasphisileleugln

245250255

lysthrgluhisglyvalargleuhisproleualaargthralalys

260265270

vallysasngluvalasnserphelysalaalaleuserserleuala

275280285

glnhisglyglutyralaprophealaargleuleuasnleusergly

290295300

valasnasnleugluhisglyleupheproglnleuseralaileala

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