粘土產物減少蝦中的細菌性疾病的效果的用途的制作方法

相關申請和通過引用的結合

本申請要求2014年8月1日提交的美國臨時專利申請序號62/032,238的權益和優先權。

前述申請，和其中或在它們的執行期間引用的所有文獻(“申請引用的文獻”)和在該申請引用的文獻中引用或參考的所有文獻，和在此引用或參考的所有文獻(“在此引用的文獻”)，以及在此引用的文獻中引用或參考的所有文獻，與在此或在此通過引用結合的任何文獻中提及的任何產品的任何制造商的指示、描述、產品說明，和產品表格一起，均由此通過引用結合到本文中，并可用于實施本發明。更特別地，所有的參考文獻通過引用而結合，如同各個獨立的文獻被特別地和單獨地指明通過引用結合到本文中的程度一樣。

發明領域

本發明涉及一種給予粘土或粘土共混物至蝦，以減少早期死亡綜合征(ems)/急性肝胰腺壞死病(ahpnd)的影響的方法。

發明背景

弧菌是分泌引起家禽、動物、人、魚和蝦的疾病的毒素的細菌屬。由副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)產生的一種或多種未知的毒素，已表明會引起蝦中的疾病。

引起早期死亡綜合征(ems)，一種在東南亞新出現的蝦病(更專業地稱為急性肝胰腺壞死病(ahpnd)，并且也稱為急性肝胰腺壞死綜合征(ahpns))的難以捉摸的病原體被鑒定。ems由細菌刺激物(agent)引起，其經口傳播，定居在蝦的胃腸道并產生造成組織破壞和蝦的稱為肝胰腺的消化器官功能障礙的毒素，但不影響人。

ems/ahpnd病原體作為相對常見的細菌的獨特菌株，副溶血弧菌，可被噬菌體感染，這可能導致其釋放強效毒素。一個類似的現象發生在人類疾病霍亂中，其中噬菌體使霍亂弧菌(vibriocholerae)細菌能產生引起霍亂的致命性腹瀉的毒素。然而，在蝦中的ems的情況下，噬菌體對于從細菌釋放的毒素可能是或可能不是必要的。

關于診斷試驗發展的研究繼續用于快速檢測ems/ahpnd病原體，這將能夠改進孵卵處和池塘的管理，并幫助產生疾病的長期解決方案。它也將能夠更好地評估與從受ems影響的國家進口冷凍蝦或其它產品相關的風險。

自從中國于2009年首次報告ems以來，其已經傳播至越南、馬來西亞和泰國、印度，和墨西哥，并且現在造成超過10億美元(u.s.$)的年度虧損。ems爆發通常發生在一個新建成的養蝦池塘放養后的首個30天內，且死亡率可超過70%。

除了診斷試驗外，目前沒有治療這種疾病的可以利用的方法。重要的是，在中國和其它國家已經發現抗生素對ems無效。敏感性試驗已表明細菌已對整個范圍的抗生素產生了抵抗力。

本申請中任何文獻的引用或鑒定并不承認這樣的文獻可用作本發明的現有技術。

發明概述

存在治療蝦中的ems/ahpnd的需求。在幾個體內實驗中，申請人已表明粘土和粘土共混物產品有助于緩解由來自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(cperfringens)的細菌毒素在雞中引起的壞死性腸炎。本發明還涉及粘土和粘土共混物產品作為食物補充劑以改進生長和飼養效率的用途。

在蝦中，ems/ahpnd被發現由副溶血弧菌引起。這些細菌也釋放損害腸道的屏障(包括肝胰腺)的毒素。雖然所述毒素仍未被鑒定，它們可應用類似于許多其它損害腸道的毒素，例如來自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的α-毒素和netb毒素的機制。calibrin^?-z是一種可結合極性和非-極性毒素的廣譜多毒素粘合劑。由于calibrin?-z可結合細菌α-毒素和netb毒素，它可能能夠結合來自副溶血弧菌的未知的細菌毒素。

這導致了進行這樣的研究，以了解粘土或粘土共混物產品是否將減少細菌毒素引起蝦中的疾病早期死亡綜合征(ems)/急性肝胰腺壞死病(ahpnd)的作用。

該產品的優選的實施方案可以是100%calibrin^?-z，鈣蒙脫土粘土，其已被加熱至減少水分的溫度并被研磨至細粒徑。這種處理，加熱至400℃-800℃之間，和/或精細研磨(平均粒徑32-36μm)，已表明增加粘土的跨多種真菌和細菌毒素的毒素結合能力。

除了優選的實施方案，能夠結合毒素的其它材料也可以代替calibrin?-z，如可以使用其它粘土或吸附劑礦物質、硅藻土、硅酸鹽，或用其它工藝，包括增加或減少干燥溫度或時間或最終水分含量制造的這些材料(包括用于calibrin?-z的基礎材料)、煅燒材料、添加表面活性劑的粘土，或研磨成較大或較小粒徑的材料。

除了優選的實施方案，具有粘土的其它產品的共混物；如酵母來源，或酵母發酵產物、酵母甘露聚糖，或全酵母或酵母細胞的組分(如酵母細胞壁)或來自其它酵母菌種的酵母或酵母組分也可使用。甘露聚糖寡糖，和/或β葡聚糖的來源，或酵母的其它主要組分也可使用，包括但不限于，其它纖維或碳水化合物來源。除酵母外，任何其它來源如谷物、蘑菇，和可產生β-葡聚糖和甘露聚糖寡糖的細菌也可使用。谷氨酸鹽的來源，或其它產生能量的氨基酸(包括但不限于：α-酮戊二酸鹽、谷氨酰胺、天冬氨酸鹽或支鏈氨基酸)，其它功能氨基酸或功能蛋白也可使用。

材料的包含百分比可從優選的實施方案中的那些增加或減少。

雖然優選的實施方案已表明具有抵抗由給予用副溶血弧菌培養物污染的飼料食物引起的ems/ahpnd的價值，它可能還具有在任何蝦或養殖魚物種，或其它物種如豬、牛、綿羊、山羊、馬，或人中抵抗其它基于弧菌或梭菌或球菌的疾病或其它腸疾病的類似的作用。

因此，本發明的目的是在本發明范圍內不涵蓋任何先前已知的產品、制備產品的工藝，或使用產品的方法，使得申請人保留權利并由此公開放棄任何先前已知的產品、工藝，或方法。還要注意到，本發明不打算在本發明范圍內涵蓋不滿足uspto(35u.s.c.§112，第一段)或epo(epc的第83條)的書面描述和實施要求的任何產品、工藝，或制備產品或使用產品的方法，使得申請人保留權利并由此公開放棄任何先前描述的產品、制備產品的工藝，或使用產品的方法。

要注意在本公開且特別是在權利要求書和/或各段中，術語如“包含”、“包括”、“含有”等可具有在美國專利法中賦予它的含義；例如，它們可意味著“包括”、“包含”、“包納”等；并且術語如“基本由…組成”和“基本由…構成”具有在美國專利法中歸屬于它們的含義，例如，它們允許未明確描述的要素，但排除在現有技術中發現的或影響本發明的基本或新的特征的要素。

這些和其它實施方案被公開或從以下的詳細描述中變得顯而易見并由以下的詳細描述涵蓋。

附圖簡述

以下的詳細描述(通過舉例給出，但不打算將本發明僅僅限制于描述的具體實施方案)在結合附圖時可得到最好的理解。

圖1描述來自副溶血弧菌的蛋白毒素，其用和不用calibrin?-z培養并使用凝膠電泳以千道爾頓(kda)測量。在凝膠電泳中測量toxa的重的藍色帶(在第6道無calibrin?-z)為17千道爾頓(kda)和toxb為50kda。用calibrin?-z培養毒素減少toxa(如在第4、3、2和1道中所見到的)和toxb(如在第2和1道中所見到的)。

圖2描述了從反向填喂(reversegavage)注入單獨的ems毒素的上清液(0:1)或用增加的calibrin?-z與毒素的比率的時候開始，按小時記錄蝦的總死亡率，以百分比計。大多數死亡率發生在反向填喂后頭4個小時內。在無毒素(pbs)組中，或當calibrin?-z用毒素按500:1或250:1的比率培養時，在頭6個小時觀察到沒有蝦死亡。單獨用ems毒素注射給予的蝦在4個小時的觀察后，蝦100%死亡。

發明詳述

申請人已表明粘土和粘土共混物產品有助于緩解由來自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的細菌毒素在雞中引起的壞死性腸炎。

本發明也涉及粘土和粘土共混物產品作為食物補充劑來改進生長和飼養效率的用途。

該產品的優選的實施方案可以是100%calibrin^?-z，一種鈣蒙脫土粘土，其已被加熱至減少水分的溫度并被研磨至細粒徑。這種處理，加熱至400℃-800℃之間，和/或精細研磨(平均粒徑32-36μm)，已表明增加粘土的跨多種真菌和細菌毒素的毒素結合能力。

除了優選的實施方案，能夠結合毒素的其它材料也可以代替calibrin?-z，如可使用其它粘土或吸附劑礦物質、硅藻土、硅酸鹽，或用其它工藝，包括增加或減少干燥溫度或時間或最終水分含量制造的這些材料(包括用于calibrin?-z的基礎材料)、煅燒材料、添加表面活性劑的粘土，或研磨成較大或較小粒徑的材料。

除了優選的實施方案，具有粘土的其它產品的共混物；如酵母來源，或酵母發酵產物、酵母甘露聚糖，或全酵母或酵母細胞的組分(如酵母細胞壁)或來自其它酵母菌種的酵母或酵母組分也可使用。甘露聚糖寡糖，和/或β葡聚糖的來源，或酵母的其它主要組分也可使用，包括但不限于，其它纖維或碳水化合物來源。除酵母外，任何其它來源如谷物、蘑菇，和可產生β-葡聚糖和甘露聚糖寡糖的細菌也可使用。谷氨酸鹽的來源，或其它產生能量的氨基酸(包括但不限于：α-酮戊二酸鹽、谷氨酰胺、天冬氨酸鹽或支鏈氨基酸)，其它功能氨基酸或功能蛋白也可使用。

所述材料的包含百分比可從優選的實施方案中的那些增加或減少。

雖然優選的實施方案已表明具有抵抗由給予用副溶血弧菌培養物污染的飼料食物引起的ems/ahpnd的價值，它可能還具有在任何蝦或養殖魚物種，或其它物種如豬、牛、綿羊、山羊、馬，或人中抵抗其它基于弧菌或梭菌或球菌的疾病或其它腸疾病的類似的作用。

本發明涵蓋用于治療ems/ahpnd的抗毒素和任選的酵母，和msg-樣材料。其它材料被認為是抗毒素的，例如其它粘土或礦物質、酵母或酵母組分、其它來源的纖維、β葡聚糖，或酶。其它免疫調節劑如酵母或酵母組分，或其它纖維、免疫球蛋白，或免疫球蛋白來源、甲殼素或皮質類固醇。腸道粘膜能量的其它來源例如有功能蛋白、谷氨酸、蘇氨酸，或功能蛋白來源如血漿，或功能肽。如在此所用的，肽可以是短鏈氨基酸，如2-4個分子的谷氨酸鹽或不同氨基酸與或不與谷氨酸鹽的組合。

本發明也涉及在300和800℃之間加熱粘土至多1小時。

本發明也涉及加熱粘土，因為它可影響粘土的有效性。這可以使用馬弗爐靜態進行，或者在回轉干燥爐或閃蒸干燥器中動態進行。該產品的優選的實施方案可以是約50-70%(w/w)的抗毒素、約25-45%(w/w)的免疫調節劑，其可以是酵母和約0.01-15%的腸道增強劑如谷氨酸單鈉。抗毒素可以是鈣蒙脫土粘土，其被有利地加熱至100-800℃之間，有利地加熱至400-800℃之間的溫度，以減少水分并被研磨至細粒徑。這種處理，加熱至100-800℃之間，和/或精細研磨(具有大約20和50微米之間的平均粒徑)已表明增加粘土的跨多種毒素的毒素結合能力。

酵母可以是在產生檸檬酸期間通過控制發酵過程產生的畢赤酵母(pichiayeast)產物并且也稱為檸檬酸壓濾餅。酵母可以是畢赤酵母。在有利的實施方案中，酵母是季也蒙畢赤酵母(pichiaguilliermondiiyeast)。其它畢赤酵母菌種包括，但不限于，異常畢赤酵母(p.anomala)、解磷畢赤酵母(p.farinose)、黑迪氏畢赤酵母(p.heedii)、克魯維畢赤酵母(p.kluyveri)、膜璞畢赤酵母(p.membranifaciens)、挪威畢赤酵母(p.norvegensis)、奧默畢赤酵母(p.ohmeri)、巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)、甲醇畢赤酵母(p,methanolica)和亞膜畢赤酵母(p.subpelliculosa)。

谷氨酸單鈉是氨基酸谷氨酸鹽的一種形式。

除了優選的實施方案，能夠結合毒素的其它材料可替代amlan產品，如可使用其它粘土或吸附劑礦物質、硅藻土、硅酸鹽、沸石、綠坡縷石、海泡石組，或用其它工藝，包括增加或減少干燥溫度或時間或最終水分含量制造的這些材料或這些材料的組合(包括用于amlan產品的基礎材料)、煅燒材料，或研磨成較大或較小粒徑的材料。除了研磨外，產生較小粒徑的任何其它方法包括剝落至納米尺寸也為本發明所考慮。

粘土可被加熱至約100℃、約125℃、約150℃、約175℃、約200℃、約225℃、約250℃、約275℃、約300℃、約325℃、約350℃、約375℃、約400℃、約425℃、約450℃、約475℃、約500℃、約525℃、約550℃、約575℃、約600℃、約625℃、約650℃、約675℃、約700℃、約725℃、約750℃、約775℃、約800℃、約825℃、約850℃、約875℃、約900℃、約925℃、約950℃，或約1000℃。它可被加熱1分鐘至至多4小時。

粘土的平均粒徑可以小至10納米至高達500微米。平均粒徑可有利地在20和50微米之間。

在一些實施方案中，粘土還可包含表面活性劑。表面活性劑可以是泥土表面活性劑或含有烷氧基化多元醇、濕潤劑、烷基聚葡萄糖苷酯，和聚羧酸酯、鈉鹽的表面活性劑。表面活性劑也可包含泥土表面活性劑和濕潤劑復合物的組合。

其它酵母來源，或酵母發酵產物、酵母甘露聚糖，或全酵母或酵母細胞的組分(如酵母細胞壁)或它們的混合物，或來自其它酵母菌種的酵母或酵母組分也可采用。甘露聚糖寡糖，和/或β葡聚糖的來源，或酵母的其它主要組分也可使用，包括但不限于，其它纖維或碳水化合物來源。益生元或益生元的共混物的其它來源也可使用。

谷氨酸鹽的其它來源、谷氨酸，或任何它們的鹽，或其它產生能量的氨基酸(包括但不限于：α-酮戊二酸鹽、谷氨酰胺、天冬氨酸鹽或支鏈氨基酸、l-谷氨酸或l-谷氨酰胺)，其它功能氨基酸、功能肽，或功能蛋白，或核苷酸也被考慮用于本發明。

所述材料的包含百分比可從優選的實施方案中的那些增加或減少。

當本發明的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物被摻入蝦或其它動物的飼料或水或飼養蝦或其它水生動物的水中時，這可以本領域技術人員已知的方式進行。在優選的實施方案中，本發明的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物被摻入預混料中。預混料將優選地包括粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物、生理學上可接受的載體和任選的飼料。預混料通常以相對濃縮的形式呈現并適合于用其它材料如一種或多種其它載體、維生素和礦物質補充劑和飼料稀釋，以形成最終的動物飼料。預混料優選地包含0.1-70%重量，優選0.5-50%重量的范圍內，更優選約0.25%重量的濃度的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物。最佳濃度將取決于治療是否是預防性的、用于控制或補救，以及本發明的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物是否是唯一的活性劑或它是否用于與其它材料的伴隨療法，并且取決于受體的物種和年齡或生命階段。

在優選的實施方案中，粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物的濃縮組合物以受控釋放形式存在。受控釋放形式將包含粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物和聚合材料，用于提供從受控釋放體系的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物的受控釋放并特別用于加入到固體飼料材料中的組合物。由于受控釋放制劑，粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物的釋放可以延遲，使得主要發生在十二指腸。受控釋放聚合物也可由于味道或用于直腸栓劑而最大限度地減少組合物的排斥反應。

在本發明中，術語"受控釋放體系"被用于如在"控制藥物遞送(controlleddrugdelivery)"(robinson&lee,1987)中引用的相同的上下文中，并且包括如在其中引用的相同范圍的實例。本領域(robinsonandlee,1987)已知的許多其它ph敏感性受控釋放體系可替代丙烯酸聚合物或丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物。例如，可溶性的和陰離子的，或不溶性交聯的和陰離子的纖維質體系；或可溶性的和陰離子的，或不溶性交聯的和陰離子的聚合物可衍生自任何通用丙烯酸聚合物和/或其衍生物。這樣的交聯和不溶性聚合物是優選的，因為它們膨脹，并且也不太可能被代謝。

本發明也提供包含本發明的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物及飼料的動物飼料組合物。粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物優選地以全部飼料組合物的0.0001-25%且優選全部飼料組合物的0.0001-5%，更優選全部飼料組合物的約0.25%的量存在。

在另一個優選的實施方案中，本發明的粘土，或粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物可被配制以加入到其中飼養蝦的水中。

本發明的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物優選地以0.05-5000mg/kg體重/天，更優選100-1000mg/kg/天的量給予。

用于給予本發明的粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物的組合物的合適惰性載體的實例包括水、橄欖油、花生油、芝麻油、向日葵油、紅花油、落花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯、聚乙烯醇、部分水解的聚醋酸乙烯酯及其混合物。

口服或直腸給予的固體形式可含有藥學上或獸醫學上可接受的粘合劑、甜味劑、崩解劑、稀釋劑、調味劑、包衣劑、防腐劑、潤滑劑和/或時間延遲劑。合適的粘合劑包括阿拉伯樹膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖或類黃酮苷如新橙皮苷二氫查爾酮(neohesperidinedihydrochalcone)。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、膨潤土、藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸氫二鈣。合適的調味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、橙子或山莓調味劑。合適的包衣劑包括聚合物或丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯的共聚物，和/或它們的酰胺、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠或谷蛋白(gluten)。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素e、α-生育酚、抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石粉。合適的時間延遲劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于給予的懸浮劑還可包括分散劑和/或助懸劑。合適的助懸劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鈉或鯨蠟醇。合適的分散劑包括卵磷脂、聚氧乙烯酯或脂肪酸如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇單或二油酸酯、單或二硬脂酸酯或單或二月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖單或二油酸酯、單或二硬脂酸酯或單或二月桂酸酯等。

粘土、酵母和谷氨酸鹽混合物的組合物還可包含一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括如上所例舉的分散劑或天然樹膠如阿拉伯樹膠或黃蓍膠。

用于以本發明的方法給予的組合物可通過用于制備組合物的領域(如獸醫和藥物組合物領域)已知的方式制備，包括共混、研磨、均質化、懸浮、溶解、乳化、分散和在合適時，將所述成分與選擇的賦形劑、稀釋劑、載體和輔助劑混合在一起。

對于口服給予，藥物或獸醫組合物可以呈現為片劑、含片、丸劑、糖錠劑、膠囊、酏劑、粉末(包括凍干粉末)、溶液、顆粒、懸浮劑、乳化劑、糖漿劑和酊劑的形式。緩釋或延遲釋放的形式也可以例如以包衣顆粒、多層片劑或微粒劑的形式制備。

進行研究以檢查兩種產品對由蝦中的ems引起的死亡率的影響。產品是先前已表明可減少雞中的細菌腸疾病壞死性腸炎的影響的產品。所述產品是：產品a)一種100%的粘土產品，calibrin?-z(a)；和產品b)是粘土、酵母產品，和谷氨酸單鈉的共混物(b)。這些產品均以兩種濃度0.25%和0.5%的食物進行試驗。

喂食補充有粘土或粘土、酵母產品，和谷氨酸單鈉的組合的食物并用副溶血弧菌培養物感染以誘導ems/ahpnd的蝦表現出降低的死亡率。在研究結束時，喂食0.5%的產品a的蝦的存活率是95%，而喂食0.25%的產品a的蝦的存活率是85%。喂食0.5%包含率的產品b的那些蝦具有52.5%的存活率，而喂食0.25%包含率的產品b的那些蝦具有50%的存活率。喂食對照食物且未感染副溶血弧菌的組的存活率是92.5%，而喂食對照食物且被感染的那些組具有7.5%的存活率。組織學檢查顯示喂食含有產品a的食物的蝦未顯示出肝胰腺損害。

在口腔暴露于副溶血弧菌(引起急性肝胰腺壞死疾病的刺激物)之前，對幼小凡納濱對蝦(juvenilepenaeus(litopenaeus)vannamei)喂食4種含有由美國oil-dricorporation供應的專有產品的食物之一，持續7天以確定所述產品是否對存活率有影響。

在研究結束時，喂食產品a(0.5%包含率)的組的存活率是95%，而喂食產品a(0.25%包含率)的組的存活率是85%。產品b(0.5%包含率)的組的最終存活率是52.5%，而喂食產品b(0.25%包含率)的組的存活率是50%。在陽性對照組中，喂食對照食物的存活率是7.5%，而在陰性對照組中，也喂食對照食物的存活率是92.5%。

用于這項研究的動物最初從蝦改進系統(shrimpimprovementsystems)獲得。總共240只spf(無特定病原體)的凡納濱對蝦(p.vannamei)從uaz的西校區spf設施運來并儲存在12個90l養魚缸(aquaria)中，每缸20只動物。

8缸喂食用所述產品配制的食物(每種食物2缸)。2缸被指定為陽性對照和2缸用作陰性環境對照。陽性對照缸被喂食市售丸狀蝦食(rangen,inc.,40%蛋白)并用副溶血弧菌攻擊，以確保攻擊方法有作用并作為存活率的比較。陰性對照缸也喂食市售丸狀對照食物，但不用副溶血弧菌攻擊。對于完整的儲存細節見表1。

所有的缸在研究期間喂食它們各自5%體重的食物，一天1次。所有的養魚缸配備有牡蠣殼濾器、通氣裝置并用塑料薄膜覆蓋，以減少交叉污染的風險。陰性對照缸被單獨保持在一個單獨的建筑物中并在副溶血弧菌攻擊缸之前喂食。

兩種產品被用于這項研究。第一種產品被標記為產品a，而第二種被標記為產品b。4種食物包括：

?產品a-0.5%包含率

?產品a-0.25%包含率

?產品b-0.5%包含率

?產品b-0.25%包含率

將試驗材料與rangen(rangeninc.,11513ave.so.buhl,idaho)40%蛋白市售蝦預混料、40%水，和粘合劑羧甲基纖維素(3%包含率)結合，然后通過絞肉機冷擠出。將產生的飼料在40℃干燥過夜，然后破碎成適當大小的丸料。

在ahpnd攻擊之前，每缸喂食適當的食物總共7天。一旦ahpnd研究開始，則對所有的缸每天檢查垂死的或死亡的動物。幾只垂死的動物被保存在davidson的afa固定劑中并進行常規組織學處理。不是所有的死亡動物都通過固定保存，而是將所有的死亡的動物從缸中取出并冷凍。在研究結束時，將每缸中的2只活動物保存在davidson的afa固定劑中并將所有的剩余的動物冷凍。研究在最初暴露于ahpnd后15天結束。

在研究的ahpnd攻擊部分的第0天，所有的攻擊養魚缸均喂食適當的食物(產品a或b或者對照食物)，所述食物已被浸泡在具有1.57光密度的誘導ahpnd的副溶血弧菌的肉湯中。到感染后(p.i.)第1天尚未在任何缸中注意到有死亡，因而在p.i.第2天，以在第0天的相同方式再次攻擊所有的缸，但這次使用1.26光密度的肉湯。

到p.i.第7天，除了一個陽性對照缸外，在任何缸中未注意到有死亡，因此再次重新攻擊缸，但這次它們在一天內被給予兩種飼料。在ahpnd攻擊的p.i.第8天，所有的ahpnd攻擊養魚缸喂食市售丸狀蝦食(rangeninc.,35%蛋白)，其已被浸泡在具有1.88光密度的誘導ahpnd的副溶血弧菌的肉湯中。在p.i.第8天下午，所有的ahpnd攻擊養魚缸喂食第二劑量的相同副溶血弧菌肉湯，但這次將肉湯在喂食前加入到各自的oil-dri食物中。

在研究期間，在陰性對照缸未注意到死亡或垂死的動物，雖然注意到數目減少，而丟失的動物被歸因于同類相食。在感染后第15天(總共22天)研究結束時，從第一個缸收集在第0天儲存20只動物中的總共20只活動物，而從第二個缸收集20只動物中的17只活動物。組合的最終存活率是92.5%，其單獨的存活率分別是100%和85%。對于陰性對照缸二者的完整的存活率數據，請參閱表2。

食物1(0.5%包含率的產品a)：在ems暴露后第9天，一個喂食食物1的攻擊缸中注意到1只垂死的動物。在這組缸中未注意到其它死亡或垂死的動物，雖然到感染后的第13天在一個缸中注意到數目減少。在感染后的第15天研究結束時，從第一個缸收集到總共18只活動物，而從第二個缸收集到20只活動物，導致存活率分別為90%和100%。該組的組合存活率是95%。對于每缸的存活率和死亡率值，請參閱表2和3。

食物2(0.25%包含率的產品a)：在研究期間，在喂食食物2的任一缸中未注意到死亡或垂死的動物，雖然在感染后的第13天注意到數目減少。丟失的動物可能是體弱的和在它們能從缸中取出前被完全同類相食。在研究結束時，從第一個缸收集到18只活動物，而從第二個缸收集到16只活動物，導致缸的存活率分別為90%和80%。對于該組的組合存活率是85%。對于每缸的存活率和死亡率值，請參閱表2和3。

食物3(0.5%包含率的產品b)：在暴露后第10天(最終暴露后第2天)，在喂食食物3的一個缸中注意到第一只死亡和垂死的動物。每天從第一個缸收集死亡和垂死的動物，直至p.i.第12天死亡終止時。在研究期間，從第二個缸未收集到死亡或垂死的動物，雖然在感染后第13天注意到數目減少。在研究結束時，從第一個缸收集到3只活動物，導致15%的存活率，而從第二個缸收集到18只活動物，導致90%的存活率。對于該組的組合最終存活率是52.5%。對于每缸的存活率和死亡率值，請參閱表2和3。

食物4(0.25%包含率的產品b)：在ems暴露后的第9天，在喂食食物4的兩個缸中注意到第一只死亡和垂死的動物。每天收集死亡的動物，直至在暴露后第11天死亡終止。在研究結束時，從一個缸收集到4只活動物，導致20%的存活率，而從第二個缸收集到16只動物，導致80%的存活率。對于該組的組合最終存活率是50%。對于每缸的存活率和死亡率值，請參閱表2和3。

ahpnd陽性對照組(對照食物)：在感染后第3天，在一個凡納濱對蝦(p.vannamei)ahpnd陽性對照缸中注意到第一只死亡的動物。每天從第一個缸收集死亡和垂死的動物，直至在感染后第9天死亡停止。在感染后第9天，在第二個缸中注意到第一只死亡的動物，且繼續直至第10天死亡停止時。在研究結束時，從第一個缸收集到總共2只活動物，導致5%的存活率，而從第二個缸收集到2只活動物，導致10%的存活率。在陽性對照組中的組合存活率是7.5%(見表2和3)。

代表性垂死的或存活的動物的組織學檢查示于表4中，其從這個實例概述了組織學結果。

表1.用于ahpnd攻擊的所有缸的定義

表2.ahpnd攻擊的存活率結果

表3.ahpnd攻擊的缸的每日死亡率

注釋：第1天=引入副溶血弧菌至所有的攻擊缸后1天.

表4.來自ahpnd攻擊的組織學發現的概述

注釋：

1)ahpnd/ems=急性肝胰腺壞死疾病，也稱為早期死亡綜合征的損害診斷。

2)g-痕跡至g4=感染/損害的嚴重性等級，依據所附的嚴重性等級表。在括號左側的數字表示受影響的蝦的數目。

附表1

使用calibrin?-z重復研究，因為在先前的研究中，已表明它對由蝦中的早期死亡綜合征(ems)或急性肝胰腺壞死病(ahpnd)引起的死亡率具有最有益作用。在食物的兩個濃度(0.25%和0.5%)下對這種產品進行試驗。

喂食補充有calibrin?-z的食物且用副溶血弧菌培養物感染以誘導ems/ahpnd的蝦與未喂食calibrin?-z的攻擊組比較，顯示出減少的死亡率。在研究結束時，喂食0.25%包含率的calibrin?-z組的存活率是66.7%，而在喂食0.5%包含率的calibrin?-z的組中，存活率是39.8%。陽性對照組(用副溶血弧菌攻擊且喂食對照食物的組)的存活率是1.5%，而也喂食對照食物的陰性(未攻擊的)對照組的存活率是100%。組織學檢查顯示，喂食含有calibrin?-z的食物的蝦未顯示出肝胰腺損害。

在口腔暴露于副溶血弧菌(引起ahpnd的刺激物)之前，對幼小凡納濱對蝦(juvenilepenaeus(litopenaeus)vannamei)喂食含有由美國oil-dricorporation供應的專有產品的兩種食物(0.25或0.5%包含率)之一達7天，以確定該產品是否將對存活率具有影響。

在研究結束時，喂食0.25%包含率的calibrin?-z的組的存活率是66.7%，而喂食0.5%包含率的calibrin?-z的那些組具有39.8%的存活率。陽性對照組(喂食對照食物)的存活率是1.5%，而也喂食對照食物的陰性對照組(唯一未攻擊的組)的存活率是100%。

用于這項研究的動物最初從蝦改進系統(shrimpimprovementsystems)獲得。總共264只spf(無特定病原體)的凡納濱對蝦(p.vannamei)從arizona大學西校區spf設施(universityofarizona’swestcampusspffacility)運來并儲存在12個90l養魚缸中，每缸22只動物。

6缸喂食用所述產品配制的食物(每種食物3缸)。3缸被指定為陽性對照和3缸用作陰性環境對照。陽性對照缸被喂食市售丸狀蝦食并用副溶血弧菌攻擊，以確保攻擊方法有作用并作為存活率的比較。陰性對照缸也喂食市售丸狀對照食物，但不用副溶血弧菌攻擊。一個陰性對照缸放置在ahpnd攻擊缸旁邊，而余下的兩個缸被單獨保持在一個單獨的建筑物中。對于完整的儲存細節見表5。

所有的缸在研究期間喂食它們各自5%體重的食物，一天1次。所有的養魚缸配備有牡蠣殼濾器、通氣裝置并用塑料薄膜覆蓋，以減少交叉污染的風險。所有的陰性對照缸被單獨保持在一個單獨的建筑物中并在副溶血弧菌攻擊魚缸之前喂食。

產品calibrin?-z被用于這項研究。制得的3種食物包括：食物1-0.25%包含率的calibrin?-z，食物2-0.50%包含率的calibrin?-z和食物3-對照食物(無calibrin?z)。

將試驗材料與rangen(rangeninc.,11513ave.so.buhl,idaho)40%蛋白市售蝦預混料、40%水，和粘合劑羧甲基纖維素(3%包含率)結合，然后通過絞肉機冷擠出。將產生的飼料在40℃干燥過夜，然后破碎成適當大小的丸料。

在ahpnd攻擊之前，每缸喂食適當的食物總共7天。一旦ahpnd研究開始，則對所有的缸每天檢查垂死的或死亡的動物。幾只垂死的動物被保存在davidson的afa固定劑中并進行常規組織學處理。不是所有的死亡動物都通過固定保存，而是將所有的死亡的動物從缸中取出并冷凍。在研究結束時，將每缸中的1-2只活的幸存者保存在davidson的afa固定劑中并將任何剩余的動物冷凍。研究在最初暴露于ahpnd后7天結束。

與先前的研究不同，造成ahpnd的副溶血弧菌(越南分離株)(具有減少的1.5光密度)的18-20小時培養物被用于這項研究。在研究的ahpnd攻擊部分的第0天，所有的攻擊養魚缸均喂食市售丸狀蝦食(rangeninc.,40%蛋白)，其已被浸泡在含有0.071光密度的誘導ahpnd的副溶血弧菌(具有5.0x10⁵菌落形成單位)的肉湯中。到感染后的(第0天)下午，所有的ahpnd攻擊養魚缸喂食第二劑量的相同的副溶血弧菌肉湯，但這次將肉湯在喂食前加入到各自的食物中。同一天，對每缸中的所有動物計數，以獲得ahpnd攻擊當天(0天)的實際最初數目(見表6)。

到感染后第2天，尚未在任何攻擊缸中注意到有死亡，因而在感染后第3天，以在第0天的相同方式再次攻擊所有的缸，但這次使用1.75光密度的肉湯(具有1.1x10⁹菌落形成單位)。

在研究期間，在陰性對照缸中未注意到死亡或垂死的動物。在研究結束時，即感染后第10天，從所有的3個陰性對照缸收集到在感染后第0天計數的21只動物的總共21只活動物，導致單獨和組合存活率均為100%。對于關于所有3個陰性對照缸的完整的存活率數據，請參考表6。

食物1(0.25%包含率的calibrin?z)：在初始攻擊后的第4天開始，在喂食食物1的攻擊缸之一注意到第一只死亡的動物。每天從該缸收集死亡和垂死的動物，直至最后的動物在感染后第6天死亡。在攻擊研究期間，在剩余的兩個缸中未注意到死亡或垂死的動物。在研究結束時，在感染后第10天，從第一個缸未收集到幸存者，而從剩余的兩個缸中收集到19和20只幸存者，導致存活率分別為0%和100%。該組的組合存活率是66.7%。對于每缸的存活率和死亡率值，請參閱表2和3。

食物2(0.5%包含率的calibrin?z)：在感染后第3天開始，在喂食食物2的兩個缸中注意到第一只死亡和垂死的動物。從這兩個缸每天收集死亡和垂死的動物，直至在感染后第7天死亡停止。在攻擊研究期間，在該組的最后一缸中未注意到死亡或垂死的動物。在研究結束時，從第一個缸收集到3只活動物，從第二個缸收集到1只動物，而從最后一缸中收集到20只活動物。各缸的存活率分別是14%、5%和100%。該組的組合存活率是39.8%。對于每缸的存活率和死亡率值，請參閱表6和7。

ahpnd攻擊組(對照食物)：在感染后第3天，在一個ahpnd陽性對照缸中注意到第一只死亡的動物。在感染后第4天在第二個缸和在感染后第5天在第三個缸中注意到第一只死亡的動物。從所有3個缸中每天收集死亡和垂死的動物，直至在感染后第8天后死亡停止。在研究結束時，從兩個缸中未收集到活動物，而從最后一缸收集到1只活動物，導致兩個缸的0%存活率和最后一缸的4%存活率。陽性對照組的組合存活率是1.5%(見表6和7)。

代表性的垂死的或存活的動物的組織學檢查示于表8中，其從這個實例概述了組織學結果。

表5.用于amlanindustriesahpnd攻擊的所有的缸的定義.

進行另一項研究以檢查calibrin?-z對副溶血弧菌體外產生毒素的結合作用和通過反向填喂體內注入對蝦的毒性。用導致蝦中的早期死亡綜合征(ems)或急性肝胰腺壞死病(ahpnd)的兩種毒素培養calibrin?-z減少在溶液中游離的毒素的量。當在將上清液反向填喂注入蝦之前用毒素培養calibrin?-z時，死亡率從95%(對照)減少至5%(calibrin?-z)。

在體外研究中，用1mg誘導ems的副溶血弧菌的細菌毒素部分培養不同濃度(500、250、125、62.5和31.25mg)的calibrin?-z。從60%硫酸銨沉淀的誘導ems的副溶血弧菌的培養肉湯制備毒素部分，所述毒素在用calibrin?-z培養之前進行透析。

在室溫下，在伴有溫和攪拌30min的培養后，將混合的溶液離心(在4℃、6000rpm下持續15min)，且收集上清液并分成兩份。將1份上清液(約20μg總蛋白)用于體外研究，使用凝膠電泳(12%sds-page)，測出在上清液中剩余的毒素的量，且通過cbb-g250染色使圖案可視化。第二份(約40μg總蛋白)通過將上清液反向填喂注入活蝦內而用于進行體內研究。以相同方式制備對照組的上清液，但不加入calibrin-z。

用于體內研究的白蝦具有2-4克鮮重。對于每一治療的10只蝦被用于毒素注入，該研究重復兩次。經由反向填喂注入來自體外研究的上清液(用在非-calibrin?-z處理的上清液中給出10μg總蛋白/每克體重的相同體積)。在注入后首個6小時內的每小時觀察蝦死亡率，然后在24小時觀察。在實驗結束時，收集垂死的蝦并在davidson固定劑中固定用于組織學檢查，以證實死亡確由ems毒素引起。

體外：細菌毒素制劑含有稱為toxa和toxb的兩種毒素蛋白。toxa具有約17kda(千道爾頓)的重量，而toxb具有約50kda的重量。這可通過觀察圖1的第6道來發現并將在那里見到的藍帶與在最左邊見到的運行的標準重量比較。17kda的toxa帶在1mg毒素用125mgcalibrin?-z(第3道)培養后消失。toxb的減少和toxa帶的消失可在第2道中發現，其為當毒素用250mgcalibrin?-z培養的時候。當毒素制劑用500mgcalibrin?-z(第1道)培養時，毒素a和毒素b兩條帶完全消失。當重復該試驗時，發現類似的結果。

體內：在反向填喂注入后，在首個6小時內，每小時記錄蝦死亡率(exp1)，數據呈現于圖2中。死亡主要發生在注入后首個4小時內。死亡的蝦的肝胰腺檢查確定ems是死亡的原因。

不含毒素(pbs)的緩沖溶液，或500:1或250:1的calibrin?-z:毒素比率的治療組在觀察的6小時內沒有死亡。250:1和更高比率的calibrin?-z:毒素完全防止在這一期間ems誘導的死亡。對兩項研究在注入后24h所見到的死亡率示于表1中。只有來自毒素制劑用125、250和500mgcalibrin?-z培養和對照組的結果表示于表中，因為較低量的calibrin?-z未表現出有益的作用。結果的模式類似于體外研究的那些。500mg量的calibrin?-z是在治療中最有效的濃度。當calibrin?-z未加入時，死亡率高達95%，但當加入500:1的calibrin?-z:毒素時，死亡率僅為5%。這提示calibrin?-z可減少由引起ems的細菌毒素(toxa和toxb)誘導的死亡。

在家畜、家禽和水產養殖業中，細菌毒素是對全球動物蛋白生產的一種嚴重威脅。在這些研究中，calibrin?-z減少副溶血弧菌毒素(toxa和toxb)的量，該毒素是ems/ahpnd的病因。這可使用凝膠電泳和活蝦二者發現。總之，calibrin?-z提供毒素控制的層以減少由ems引起的死亡。

雖然本發明及其優點已得到詳細描述，應該理解各種改變、取代和變更可在此進行，而不偏離如在所附權利要求書中限定的本發明的精神和范圍。

如此詳細描述了本發明的優選實施方案，要理解由以上段落定義的本發明并不限于以上說明書中闡述的具體細節，因為其不偏離本發明的精神和范圍的許多明顯的變化是可能的。