使用針對CD40L的域抗體治療自身免疫性疾病的方法與流程

本申請根據35 U.S.C.§119(e)要求于2014年9月10日提交的美國臨時專利申請No.62/048,459的優先權，將其全部內容并入本申請。

技術領域

提供了使用特異性結合人CD40L的抗體多肽治療自身免疫疾病，例如原發免疫性血小板減少癥、實體器官移植排斥、移植物相關疾病、尋常型天皰瘡、系統性硬化和重癥肌無力的方法。

序列表

本申請包含已經通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，將其全部內容通過提述并入本文。

背景

特發性血小板減少性紫癜(ITP)，也稱為原發免疫性血小板減少癥，是一種自身免疫性疾病，以在沒有其它可能與血小板減少有關的原因或障礙的情況下孤立的血小板減少(外周血血小板計數小于100×10⁹/L)為特征。Rodeghiero等，Blood，113(11)：2386-2393(2009)。ITP的病理生理學基礎歷來被歸因于抗體包被的血小板的破壞率增加。此外，新發現血小板產生障礙是一種促成ITP的血小板減少的重要機制。ITP的臨床表現可變性很大，小到無癥狀，大到災難性的出血。癥狀在很大程度上——盡管不是唯一地——與血小板計數有關。Rodeghiero等，Blood，113(11)：2386-2393(2009)。

對呈現ITP的患者的一線治療包括口服或靜脈內皮質類固醇(潑尼松是最常使用的類固醇)。在初始響應之后，當劑量減少時，常有復發。George等人，Blood，88(1)：3-40(1996)。只有約20-30％的患者出現長期響應。Provan等，Blood，115：168-186(2010)。對類固醇無響應者的早期管理包括靜脈內免疫球蛋白(IVIg)，其在約80％病例中與響應相關。Newman等人，J.Haematol.，112(4)：1076-1078(2001)。然而，血小板計數通常在3-4周內回到處理前水平。對一線治療失敗的慢性ITP患者的治療是極具挑戰性的。Provan等，Blood，115：168-186(2010)。這些患者誘發持久且完全的響應的幾率很小；因此，治療的目的是提供“安全”的血小板計數，以防止嚴重(包括可能致命)的出血，同時最小化治療相關的副作用。脾切除術是唯一的根治性治療模式，三分之二的進行脾切除術的患者將實現正常的血小板計數，且通常可在沒有另外的治療的情況下維持。Ghanima等人，Blood，120(5)：960-969(2012)。關于進行脾切除術的最佳時間尚無共識，對于預測脾切除術的響應和長期有效性亦無共識。在約30％的患者中，脾切除術不能誘導令人滿意的響應，這些患者需要額外的治療。Cuker等，Hematol.Am.Soc.Hematol.Educ.Program 2010，377-384(2010)。

目前ITP治療只在不確定的一部分患者中起作用，而且預測功效是不可能的。此外，ITP治療(例如皮質類固醇)解決的是這種疾病的破壞成分，而不解決其根本原因。大多數長期使用的治療(包括脾切除術)有明顯的耐受性問題，這些問題通常與免疫抑制相關；對于一些藥劑而言，甚至與死亡相關。這些藥劑極少在對照臨床試驗中得到過測試，沒有任何藥劑顯示了與低血小板計數相關的出血的顯著減少。絕大多數藥物是超標簽(例如硫唑嘌呤、達那唑、長春花生物堿和利妥昔單抗)處方的，并且對慢性ITP患者的功效反復不定，通常只是暫時的。Neunert等，Blood，117(16)：4190-4207(2011)。因此，慢性ITP患者的日常臨床管理是一個顯著的難題。

CD40-CD40L相互作用在免疫和炎癥反應中的關鍵作用使其成為治療病理性免疫炎性過程的有希望的靶標。通過特異性CD40L單克隆抗體(mAb)阻斷CD40-CD40L相互作用成功地防止了在靈長類動物中的同種異體移植排斥，并且在動物模型中治療自身免疫疾病和動脈粥樣硬化。Montgomery等，Transplantation，74：1365-1369(2002)。在人類中，兩種不同的抗CD40L mAb克隆已經用于臨床試驗中被用于治療不同的自身免疫疾病。Maribel等，Mol.Immunol.，45：937-944(2008)。然而，單克隆抗體可以顯示異常高的血栓栓塞(TE)并發癥，例如動脈粥樣硬化血栓形成性中樞神經系統事件，心肌梗死，肺栓塞和深靜脈血栓形成。例如，抗CD40L mAb克隆hu5c8(抗-CD40L mAb，Biogen)的有用性受到異常高的TE并發癥發生率的限制。這些抗體所致的TE被認為是由于mAb與血小板上膜結合的CD40L、或從血小板脫落的sCD40L形成高階免疫復合物(IC)，這些IC通過其FcgRIIa受體連接相鄰的血小板并由其導致相鄰的血小板聚集，導致血栓形成。血栓栓塞的風險已導致所有正在進行的臨床試驗中止。Boumpas等人，Arthritis Rheum.,48：719-727(2003)。

因此，本發明的目的是提供用于在沒有血栓栓塞風險的條件下治療患有ITP和其他自身免疫性疾病的受試者的改進方法。

概要

在某些方面，本發明涉及特異性結合并抑制人CD40L(也稱為“抗-CD40L抗體多肽”)并且可用于治療涉及CD40L激活的疾病的抗體多肽的用途。上述的抗體多肽有利地不引起血小板聚集。最終，用上述的抗體多肽靶向CD40L可以為抑制導致例如原發免疫性血小板減少、實體器官移植排斥、移植物相關疾病、尋常性天皰瘡、系統性硬化和重癥肌無力等的自身免疫過程并誘導持久的疾病緩解提供機會。因此，抗體多肽可以為自身免疫性疾病患者提供持久的治療益處。因此，抗體多肽提供了一種新治療模式，這種模式對現有的患者而言是不可得的。考慮到所有常規治療均失敗的自身免疫性疾病受試者缺乏治療選項，這種具有獨特的作用機制和已知的安全性特征的抗體多肽顯示出有利的風險/效益概況。

對ITP而言尚未滿足的醫療需求特別包括：1)對非選擇性免疫抑制劑治療不耐受(由于治療相關的副作用)或不適合(由于共病)，或用現有治療選項(包括脾切除術)難治的嚴重慢性ITP患者的管理，其中威脅生命的出血風險保持較高且生活質量下降；2)更有效和更安全的療法，可能能夠根治和/或誘導持久緩解(聚焦于減少PLT破壞)，能夠減少或消除對CS的需要，并且替代或顯著推遲脾切除。

提供了包含治療有效量的抗CD40L抗體多肽和藥學上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物可以進一步包含免疫抑制劑/免疫調節劑和/或抗炎劑。

在某些實施方案中，提供了治療有需要的患者的免疫疾病的方法。此類方法包括對患者施用治療有效量的本文所述的抗CD40L抗體多肽。免疫疾病可以是自身免疫疾病或移植物相關疾病。免疫疾病可以選自下組：阿狄森氏病，變態反應，強直性脊柱炎，哮喘，動脈粥樣硬化，耳的自身免疫性疾病，眼的自身免疫性疾病，自身免疫性肝炎，自身免疫性腮腺炎，結腸炎，冠心病，克羅恩病，糖尿病，包括1型和/或2型糖尿病，附睪炎，腎小球腎炎，移植物相關疾病，格雷夫斯病，格林巴利綜合征，橋本氏病，溶血性貧血，特發性血小板減少性紫癜(又稱原發免疫性血小板減少癥)，炎性腸病，對重組藥品(例如血友病中的因子VII)的免疫應答，系統性紅斑狼瘡，男性不育癥，多發性硬化，重癥肌無力，天皰瘡(例如尋常型天皰瘡和落葉狀天皰瘡)，銀屑病，風濕性發熱，類風濕性關節炎，結節病，硬皮病(系統性硬化癥)，干燥綜合征，脊椎關節病，甲狀腺炎，移植排斥和血管炎。自身免疫介導的病癥包括但不限于這樣的狀況，其中受影響的組織是初級靶標，并且在一些情況下是次級靶標。這樣的病癥包括但不限于AIDS，特應性變態反應，支氣管哮喘，濕疹，麻風，精神分裂癥，遺傳性抑郁癥，組織和器官移植(如實體器官移植)，慢性疲勞綜合征，阿爾茨海默病，帕金森病，心肌梗死，中風，孤獨癥，癲癇，Arthus現象，過敏反應，酒精成癮和藥物成癮。此外，移植物相關疾病可以包括實體器官、組織和/或細胞移植排斥。或者，移植物相關疾病是移植物抗宿主病(GVHD)。移植物相關疾病還可以是急性移植排斥。或者，移植物相關疾病可以是慢性移植排斥。在一個具體的實施方案中，自身免疫性疾病是特發性血小板減少性紫癜(ITP)。

還提供了治療患者的免疫疾病的方法，所述方法包括向患者施用治療有效量的抗CD40L抗體多肽(例如，BMS-986004)，其中至少一個劑量的抗體多肽以約75mg至約1500mg的劑量施用。劑量可以是至少約75mg，至少約225mg或至少約675mg。劑量可以是約75mg，約225mg，約675mg或約1500mg。或者，劑量可以為約200mg至約1200mg，或約500mg至約1000mg。任選地，該方法包括至少一個給藥周期(例如2周)。

抗體多肽可以配制在用于靜脈內施用的藥物組合物中。藥物組合物可以包含藥學上可接受的載體。例如，藥物組合物包含10mM磷酸鈉，pH 6.5，25mM精氨酸HCl，和250mM蔗糖。

抗體多肽可以靜脈內施用。抗體多肽的劑量可以是約200至約1500mg。可以施用至少2個劑量。任選地，可以施用至少7個劑量。當施用多個劑量時，各劑量可以相同或不同。劑量可以每2周施用一次。

所述方法可以使患者中的血小板計數正常化。任選地，患者的基線外周血血小板計數在治療后可以增加至少一倍。在治療后，患者的外周血基線血小板計數可以大于或等于50,000/mm³或大于或等于100,000/mm³。患者在治療后可以顯示外周血血小板計數增加20,000/mm³。患者在治療前可具有小于30,000/mm³的外周血血小板計數。患者在治療前可具有小于100×10⁹L或50×10⁹L的外周血血小板計數。患者可以在治療之前接受脾切除。任選地，患者在治療之前曾接受過ITP治療。或者，患者在治療之前未曾接受過ITP治療。

在某些實施方案中，本發明的方法還包括對患者施用免疫抑制劑/免疫調節劑和/或抗炎劑。免疫抑制劑/免疫調節劑和/或抗炎劑與抗CD40L抗體多肽可以順序或同時施用。

還提供了用于治療患者的免疫疾病的試劑盒，所述試劑盒包括：(a)一定劑量的抗CD40L抗體多肽(例如，BMS-986004)；和(b)使用所述抗體多肽的說明。

還提供了用于施用的抗CD40L抗體多肽(例如，BMS-986004)，其中至少一個劑量的抗CD40L抗體多肽以約75至約1500mg的劑量施用。

還提供了本文公開的抗CD40L抗體多肽在制備用于治療患者的藥物中的用途，其中所述患者患有或處于患有免疫性疾病的風險中。還提供了本文公開的抗CD40L抗體多肽在制備用于減輕有需要的患者中免疫疾病的至少一種癥狀的藥物中的用途。還提供了用于至少一個施用周期的抗CD40L抗體多肽(例如，BMS-986004)，其中對于每個周期，以約75至約1500mg的劑量施用一劑抗體多肽。

所述抗CD40L抗體多肽包含可變結構域。示例性的抗體多肽是包含單個可變域的域抗體(dAb)的形式。或者，所述dAb可以是雙特異性試劑，其包含可結合另一抗原的第二可變域，所述另一抗原例如人血清白蛋白(HSA)。

在某些實施方案中，本發明的抗體多肽包含特異性結合人CD40L的第一可變域，其中CD40L包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中第一可變域的氨基酸序列包含：(a)與BMS2h-572-633的CDR1區(SEQ ID NO:2)有至多三個氨基酸不同的CDR1區，(b)與BMS2h-572-633的CDR2區(SEQ ID NO:3)有至多三個氨基酸不同的CDR2區，(c)與BMS2h-572-633的CDR3區(SEQ ID NO:4)有至多三個氨基酸不同的CDR3區；并且其中所述抗體多肽以100pM至100nM的EC50抑制CD40L對CD40的結合。或者，第一可變域的氨基酸序列可以與BMS2h-572-633的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)相差至多達10個氨基酸(含)。此外，第一可變域的氨基酸序列可以與SEQ ID NO:5相差至多5個氨基酸(含)。第一可變域的氨基酸序列也可以與SEQ ID NO:5相差至多2個氨基酸(含)。或者，第一可變域與SEQ ID NO:5相差1個氨基酸。或者，抗體多肽的可變域包含與SEQ ID NO:5至少95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。

在某些具體實施方案中，抗體多肽的可變域包含：(1)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1區；(2)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2區；和(1)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3區。例如，抗體多肽的可變域包含SEQ ID NO:5(BMS2h-572-633)的氨基酸序列。優選地，抗體多肽是BMS-986004，并且包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

還提供了包含特異性結合人CD40L的第一可變域的抗體多肽，其中所述抗體多肽是域抗體(dAb)。抗體多肽可以是包含第一可變域和Fc域的融合多肽。或者，融合多肽可包含IgG4Fc域。融合多肽還可以包含IgG1Fc域。融合多肽可以還包含IgG1Fc域。或者，融合多肽可包含CT-長域。融合多肽還可以包含CT-短域。或者，融合多肽可以包含N297Q長Fc域。融合多肽可以備選地包含N297Q短Fc域。

還提供了包含特異性結合人CD40L的第一可變域的抗體多肽，其中所述抗體多肽還包含特異性結合第二抗原的第二可變域，其中所述第二抗原是不同于人CD40L的抗原。第二抗原可以是分化簇(CD)分子或主要組織相容性復合體(MHC)II類分子。或者，第二抗原可以是血清白蛋白(SA)。

附圖說明

圖1A描述了域抗體，其包含V_H可變結構域BMS2h-572-633與來自Abatacept IgG1的修飾的Fc尾部融合。

圖1B顯示BMS-986004(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。BMS-986004是一種Fc融合蛋白，包含BMS2h-572-633(SEQ ID NO:5)的可變域和來自Abatacept IgG1的修飾的Fc尾。這種Fc融合蛋白是分子量為77,984道爾頓的二聚體，每條多肽鏈由353個氨基酸組成。可變域通過接頭(加有下劃線的殘基“AST”)與人IgG1的突變的Fc構建體融合，所述Fc構建體中三個半胱氨酸殘基(前三個下劃線的“S”殘基)被絲氨酸取代，一個脯氨酸(最后一個加下劃線的“S”殘基)被絲氨酸殘基取代。

圖2顯示了FDA 1b/2期研究劑量遞增示意圖。

圖3顯示了受試者內劑量遞增的FDA 1b/2期研究示意圖。

詳細說明

本發明提供了使用特異性結合人CD40L的抗體多肽治療自身免疫性疾病(例如原發免疫性血小板減少癥)的方法。所述抗體多肽不激活血小板，并且所述抗體多肽可用于治療涉及CD40L激活的疾病，例如移植物相關疾病和自身免疫疾病。

“抗CD40L抗體多肽”和“抗體多肽”在本文中可互換使用。在一個方面，抗體多肽可以是含有單個可變域的域抗體。抗體多肽還可以包含另外的域，例如Fc域。例如，抗體多肽可以包含特異性結合人血清白蛋白(HSA)的第二可變域。例如，這種雙特異性抗體多肽可以具有增加的半衰期。在具體實施方案中，抗體多肽包含dAb BMS2h-572-633的可變域。在另一個具體的實施方案中，抗體多肽與dAb BMS2h-572-633競爭結合。

“固定劑量”是不管受試者體重如何而施用的劑量。

“治療有效量”是指(以用于該施用方式的劑量和時間)達到期望的治療結果的量。

如本文所用，“特異性結合”是指抗體多肽以約1μM或更低(例如通過表面等離振子共振(SPR)測量)的解離常數(Kd)對抗原的結合。合適的測定系統包括表面等離子體共振系統和動力學評價軟件(例如，2.1版)。特異性結合相互作用的親和力或K_d可以為約1μM或更低，約500nM或更低，或約300nM或更低。

術語“約”會是本領域的普通技術人員能理解的，并且依賴于其使用的上下文中將有一定程度的變化。通常，“約”包括為參考值的正/負10％的值的范圍。

根據該詳細描述，應用以下縮寫和定義。必須注意，除非上下文另外明確指出，否則本文所使用的單數形式“一”，“一個”和“該”包括復數指示物。因此，例如，提及“抗體”包括多個這樣的抗體，并且提及“劑量”包括提及本領域技術人員已知的一種或多種劑量及其等同物，等等。

1.CD40L和CD40L活性

提供結合人CD40L的抗體多肽。CD40L也稱為CD154、gp39、TNF相關活化蛋白(TRAP)、5c8抗原或T-BAM。人CD40L的相關結構信息可以在例如UniProt登錄號P29965找到。“人CD40L”是指包含以下氨基酸序列的CD40L：

本發明抗體多肽與CD40L的結合拮抗CD40L活性。“CD40L活性”包括但不限于：與APC上的MHC分子的T細胞受體刺激相關的APC共刺激和激活，所有免疫球蛋白同種型在細胞因子存在下的分泌，B細胞增殖的刺激，細胞因子產生，抗體類別轉換和親和力成熟。例如，患有X連鎖的高IgM綜合征的患者在其B細胞上表達功能性CD40，但是其活化的T細胞具有缺陷的CD40L蛋白，導致其不能激活B細胞并誘導免疫球蛋白同種型轉換。Aruffo等人，Cell，72：291-300(1993)。

CD40L活性可以通過與其他分子的相互作用來介導。“CD40活性”包括CD40L與以下分子之間的功能性相互作用：CD40(CD40L受體)，α5β1整聯蛋白和αIIbβ3。例如，CD40L結合其受體，CD40，后者在多種APC(例如B細胞，巨噬細胞和樹突細胞)上，以及在基質細胞、血管內皮細胞和血小板上表達。

如本文所用，術語“激活”/“活化”是指給定的可測量的CD40L活性相對于參比增加至少10％，例如至少10％，25％，50％，75％或甚至100％或更多。如果相對于拮抗劑不存在的情況，CD40L活性降低至少10％，并且在一個示例性實施方案中降低至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，或甚至100％(即，沒有可檢測的活性)，則CD40L活性被“拮抗”。例如，抗體多肽可以拮抗一些或全部CD40L活性。在一個實施方案中，抗體多肽不激活B細胞增殖。在另一個實施方案中，抗體多肽不激活T細胞或樹突細胞(DC)的細胞因子分泌，其中細胞因子是至少一種選自IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IL-13，IL-17，IL-23，TNF-α和IFN-γ的細胞因子。

2.抗體多肽

抗體多肽包含可變域。在一個實施方案中，抗體多肽是含有單個可變結構域的dAb形式。抗體多肽可以是包含通過二硫鍵互連的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的全長抗-CD40L免疫球蛋白分子。在該實施方案中，每條鏈的氨基末端部分包括約100-120個氨基酸的可變結構域(VL或VH)。其中包含的互補決定區(CDR)主要負責抗原識別，盡管框架殘基可能在表位結合中起作用。每條重鏈羧基末端的“一半”限定出主要負責效應子功能的恒定區(Fc)。

抗體多肽還可以是包含全長抗-CD40L免疫球蛋白分子的一部分的“片段”，其包含特異性結合CD40L的可變域。因此，術語“抗體多肽”包括抗原結合性重鏈、輕鏈、重鏈-輕鏈二聚體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)和dAb，舉例而言。因此，術語“抗體多肽”包括通過重組工程化和表達制備的多肽，以及通過雜交瘤細胞克隆的天然重組和分泌產生的單克隆抗體。

輕鏈分為kappa(κ)和lambda(λ)兩類，以本領域已知的特定恒定區C_L為特征。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，分別定義抗體的同種型為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG、IgD和IgA的重鏈恒定區由三個域(CH1，CH2和CH3)組成；IgM和IgE的重鏈恒定區由四個域(CH1，CH2，CH3和CH4)組成。抗CD40L抗體可以具有選自任何免疫球蛋白類別(IgA，IgD，IgG，IgM和IgE)的重鏈恒定區。

每個輕鏈可變域(V_L)和重鏈可變域(V_H)由三個CDR和四個框架區(FR)組成，從氨基末端到羧基末端以如下順序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4。輕鏈的三個CDR稱為“LCDR1、LCDR2、LCDR3”，重鏈的三個CDR稱為“HCDR1、HCDR2、HCDR3”。

如本文所用的，術語“Fc域”是指構成根據Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第5版，US Dept.Health&Human Services，Washington D.C.(1991)劃分的CH 2和CH 3恒定域的恒定區抗體序列。Fc域可以來源于例如IgG1或IgG4Fc區。

可變域可以與Fc域融合。當可變域融合于Fc域時，可變域(V_L或V_H域，包括dAb)的羧基末端可以連接或融合到Fc CH2域的氨基末端。或者，可變域的羧基末端可以連接到或融合于CH1域的氨基末端，CH1域本身與Fc CH2域融合。蛋白質可以包含CH1和CH2域之間的鉸鏈區的全部或部分。

CDR包含大部分與抗原形成特異性相互作用的殘基。在一個實施方案中，抗體多肽的可變域包含具有與BMS2h-572-633的CDR1、CDR2和CDR3區相同的氨基酸序列的CDR1，CDR2和CDR3區，或各自與BMS2h-572-633的CDR1、CDR2和CDR3區相差一個，兩個或三個氨基酸的CDR1、CDR2和CDR3區。

在某些具體實施方案中，抗體多肽的可變域包含：(1)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1區；(2)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2區；和(1)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3區。

“域抗體”(dAb)包含能夠特異性地且單價地結合抗原(例如CD40L)的單個可變(V_L或V_H)域。例如，dAb可以具有V_HH結構，這是駱駝科dAb的特征。如本文所用的“V_H域”意在包括V_HH結構。在另一個實施方案中，V_H域(包括作為本文實施方案提供的所有特征和特征的組合)不是V_HH域。dAb可以在溶液中形成同二聚體或異二聚體。不受任何特定理論的限制，相信本文公開的dAb不引起血小板聚集，因為含有突變的Fc構建體的抗體不結合血小板表面上的FcγRIIa(也稱為CD32a)，并且不激活血小板。

在具體實施方案中，本發明提供抗CD40L VH dAb BMS2h-572-633的用途。BMS2h-572-633(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列如下所示，包含CDR1序列(WELMG；SEQ ID NO:2)；CDR2序列(GIEGPGDVTYYADSVKG；SEQ ID NO:3)和CDR3序列(KDAKSDY；SEQ ID NO:4)。

BMS2h-572-633(SEQ ID NO:5；CDR1-3區加有下劃線)：

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN WELMGWARQA PGKGLEWVSG IEGPGDVTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCVKVG KDAKSDYRGQ GTLVTVSS

如本文所用的，術語“可變域”是指由Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.Health&Human Services，Washington，D.C.(1991)定義的免疫球蛋白可變域。可變域內的CDR氨基酸殘基的編號和定位符合公知的Kabat編號慣例。

術語“人”，當應用于抗體多肽時，是指抗體多肽具有來源于人免疫球蛋白的序列，例如框架區和/或CH域。若某個序列(a)是分離自人個體或分離自來自人個體的細胞或細胞系的，(b)是分離自克隆的人抗體基因序列或人抗體可變域序列的文庫的；或(c)是自一種或多種上述多肽通過突變和選擇而多樣化的，則該序列“衍生自”人免疫球蛋白編碼序列。如本文所用的“分離的”化合物是指該化合物與與該化合物在自然界中天然伴隨的至少一種組分分開。

可以向患者施用抗體多肽，同時在很大程度上避免施用來自其他物種(例如小鼠)的抗體時常引起的抗-抗體免疫應答。例如，根據本領域熟知的方法，可以通過將鼠CDR嫁接到人可變域FR上來將鼠抗體“人源化”。然而，本文公開的人抗體可以無需對鼠抗體序列的遺傳操作而產生。

可變域可以包含一個或多個這樣的FR：其具有與由人種系抗體基因區段編碼的相應框架區相同的氨基酸序列。例如，域抗體可以包含V_H種系基因區段DP47，DP45或DP38，V_κ種系基因區段DPK9，J_H區段JH4b，或J_κ區段J_κ1。

可以對抗體多肽序列進行改變，同時保留特異性結合CD40L的能力。具體地，抗體多肽(例如dAb)可以包含這樣的變體可變域：其保留dAb BMS2h-572-633的特異性結合CD40L的功能。在一個實施方案中，變體可變域可以與BMS2h-572-633競爭與CD40L的特異性結合。如下文實施例中公開的易錯親和力成熟(error-prone affinity maturation)是一種示例性的制備和鑒定具有特異性結合CD40L的變體序列的抗體多肽的方法。

在某些實施方案中，變體可變域可以與BMS2h-572-633(SEQ ID NO:5)的可變域相差最多達10(或其間的任何整數值)個氨基酸，其中所述變體可變域特異性結合CD40L。或者，變體可變域相對于本文序列表中所列的序列可以具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性)。兩個序列之間差異的非同一(non-identical)氨基酸殘基或氨基酸可以表現為氨基酸取代、添加或缺失。當通過任何適當的氨基酸序列比對算法(如BLASTSM)比對兩個序列時，該兩個序列之間不同的殘基表現為非同一位置。

在一個具體的實施方案中，抗體多肽的可變域包含SEQ ID NO:5(BMS2h-572-633)的氨基酸序列。優選地，抗體多肽是BMS-986004，并且包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

可以利用關于重鏈和輕鏈基因的V_L或V_H域的邊界的信息設計PCR引物，從編碼已知結合CD40L的抗體多肽的克隆的重鏈或輕鏈編碼序列中擴增出可變域。可以將擴增出來的可變域插入合適的表達載體，例如pHEN-1(Hoogenboom等人，Nucleic Acids Res.19:4133-4137(1991))，并使用本領域熟知的技術單獨表達或作為與另一多肽序列的融合體表達。基于所公開的氨基酸和多核苷酸序列，融合蛋白可以僅使用常規技術在任何合適的哺乳動物宿主細胞系，如CHO、293、COS、NSO等中產生和純化，隨后使用一種或多種方法的組合，包括蛋白A親和層析，離子交換，反相技術等，加以純化。

在一個方面，抗體多肽是包含特異性結合人CD40L的第一可變域的“雙特異性”抗體多肽。雙特異性抗體多肽包含特異性結合除人CD40L之外的第二抗原的第二可變域。

在另一個實施方案中，第二抗原可以是免疫效應細胞的細胞表面分子，或者可溶性分子，例如細胞因子。雙特異性抗體多肽的結合可用于拮抗CD40L和拮抗第二抗原的生物活性。免疫效應細胞的細胞表面分子包括分化簇(CD)分子。代表性的CD標記在互聯網上以超文本傳輸協議http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_clusters_of_differentiation(最后于2012年8月8日修改)列出。免疫效應細胞的細胞表面分子還包括II型主要組織相容性復合物(MHC)分子。針對這些細胞表面分子的抗體是本領域已知的，并且可以用作可變域的來源來構建雙特異性抗體多肽。

在一個實施方案中，雙特異性配體的抗體多肽可以通過“氨基酸接頭”或“接頭”連接。例如，一個dAb可以融合到氨基酸接頭的N末端，另一個dAb可以融合到接頭的C末端。盡管氨基酸接頭可以是任何長度，并可以由氨基酸的任何組合組成，但是接頭長度可以相對較短(例如，5個以下的氨基酸)以減少被連接的域之間的相互作用。還可以調節接頭的氨基酸組成以減少具有大側鏈的氨基酸、或可能引入二級結構的氨基酸的數目。合適的氨基酸接頭包括但不限于長度最多達3、4、5、6、7、10、15、20或25個氨基酸的那些。

第二抗原的結合可以增加抗體多肽的體內半衰期。例如，雙特異性抗體多肽的第二可變域可以特異性結合血清白蛋白(SA)，例如人血清白蛋白(HSA)。具有結合I的格式的抗體多肽相對于相同的非格式抗體多肽可以具有增加的體內t-α(“α半衰期”)或t-β(“β半衰期”)半衰期。t-α半衰期和t-β半衰期度量物質在體內分布和從體內消除的速度。與I的連接可以通過，例如，將抗體多肽與能夠特異性結合I的第二可變域融合來實現。抗人血清白蛋白抗體是本領域公知的。參見例如可以在互聯網上以超文本傳輸協議www.abcam.com/index.html獲得的人血清白蛋白抗體ab10241，ab2406和ab8940，或者可以在互聯網上以超文本傳輸協議www.genwaybio.com獲得的GenWay，ALB抗體。可以從這些抗體中的任一種獲得特異性結合I的可變域，然后使用本領域熟知的重組技術將其與本公開的抗體多肽融合。

或者，抗體多肽與I的連接可通過使用技術人員熟知的技術將抗體多肽序列直接融合至I編碼序列來實現。I編碼序列可以通過PCR來獲得，其中PCR使用的引物來源于，例如，可自登錄號NM000477獲得的cDNA序列。

在一個實施方案中，I連接的域抗體組合物的tα半衰期增加10％或更多。在另一個實施方案中，I-連接的域抗體組合物的tα-半衰期在0.25小時至6小時的范圍內。在另一個實施方案中，I連接的域抗體組合物的tβ半衰期增加10％或更多。在另一個實施方案中，I連接的域抗體組合物的tβ半衰期在12至48小時的范圍內。

在另一個實施方案中，抗體多肽可以通過聚乙二醇化格式化以增加其體內半衰期。在一個實施方案中，PEG是共價連接的。在另一個實施方案中，PEG連接在抗體多肽的半胱氨酸或賴氨酸殘基處。在另一個實施方案中，PEG連接的抗體多肽具有至少24kD的流體動力學尺寸。在另一個實施方案中，總PEG大小為20至60kD(包括端值)。在另一個實施方案中，PEG連接的域抗體具有至少200kD的流體動力學尺寸。

PEG化可以使用若干PEG附接部分實現，包括但不限于N-羥基琥珀酰亞胺活性酯，琥珀酰亞胺基丙酸酯，馬來酰亞胺，乙烯基砜或硫醇。PEG聚合物可以在預定位置與抗體多肽連接，或者可以隨機連接至域抗體分子。PEG化也可以通過連接到域抗體的肽接頭來介導。也就是說，PEG部分可以連接到與抗體多肽融合的肽接頭上，其中該接頭為PEG連接提供位點(例如游離半胱氨酸或賴氨酸)。PEG化抗體的方法是本領域眾所周知的，如Chapman等人，“PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy：a review”，Adv.Drug Deliv.Rev.，54(4)：531-545(2002)。

抗體多肽也可以被設計成形成二聚體、三聚體、四聚體或其他多聚體。抗體多肽(例如dAb)可以通過數種本領域已知的方法連接以形成多聚體，這些方法包括，但不限于：單體作為融合蛋白表達、通過單體之間的肽接頭連接兩個或多個單體、或通過在翻譯后將單體化學接合，化學接合或者是直接彼此接合，或者是通過二硫鍵借助接頭接合，或通過連接到二價、三價或多價連接部分(例如多臂PEG)上來接合。在一個實施方案中，多聚體可以結合單個CD40分子。

3.藥物組合物和治療方法

在某些實施方案中，本發明提供了用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的抗CD40L抗體多肽和藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體包括例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它們的組合。藥學上可接受的載體可以進一步包含少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑，防腐劑或提高融合蛋白的保存期或有效性的緩沖液。可以配制組合物以提供給藥后活性成分的快速、持續或延遲釋放。合適的藥物組合物及其制備方法是本領域公知的。參見例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro,A.等人編，Mack Publishing Company(2005)。

藥物組合物可以進一步包含免疫抑制劑/免疫調節劑和/或抗炎劑。在有需要的患者中治療免疫疾病的方法可以包括給予患者治療有效量的所述藥物組合物。拮抗CD40L介導的T細胞活化可以抑制不期望的T細胞應答，例如在自身免疫、移植排斥或過敏反應期間發生的不期望的T細胞應答。抑制CD40L介導的T細胞活化可以調節這些疾病的進展和/或嚴重性。

如本文所用，“患者”是指動物，例如哺乳動物，包括人。患者可以已被診斷患有免疫疾病。“治療”是指涉及減輕癥狀、病癥、狀況或疾病的進展或嚴重程度的過程。“免疫疾病”是指任何與個體中免疫反應(包括細胞和/或體液免疫反應)的發展相關的疾病。免疫疾病的實例包括但不限于移植物相關疾病，炎癥，過敏和自身免疫疾病。自身免疫疾病可以選自特發性血小板減少性紫癜(ITP)，系統性紅斑狼瘡，多發性硬化，類風濕性關節炎，糖尿病，銀屑病，硬皮病，動脈粥樣硬化，炎性腸病和潰瘍性結腸炎。

可以通過施用所述藥物組合物治療的疾病可以選自阿狄森氏病，變應反應，強直性脊柱炎，哮喘，動脈粥樣硬化，耳的自身免疫性疾病，眼的自身免疫性疾病，自身免疫性肝炎，自身免疫性腮腺炎，結腸炎，冠心病，克羅恩病，糖尿病，包括1型和/或2型糖尿病，附睪炎，腎小球腎炎，移植物相關疾病，格雷夫斯病，格林巴利綜合征，橋本氏病，溶血性貧血，特發性血小板減少性紫癜(又稱原發免疫性血小板減少癥)、炎性腸病、對重組藥品(例如血友病中的因子VII)的免疫反應，系統性紅斑狼瘡，男性不育癥，多發性硬化癥，重癥肌無力，天皰瘡(例如尋常型天皰瘡和落葉型天皰瘡)，銀屑病，風濕熱，類風濕性關節炎，結節病，硬皮病(系統性硬化癥)，干燥綜合征，脊椎關節病，甲狀腺炎，移植排斥和血管炎。自身免疫介導的狀況包括但不限于其中受影響的組織是初級靶標、并且在一些情況下是次級靶標的狀況。這樣的狀況包括但不限于AIDS，特應性變應反應，支氣管哮喘，濕疹，麻風，精神分裂癥，遺傳性抑郁癥，組織和器官移植(如實體器官移植)，慢性疲勞綜合征，阿爾茨海默病，帕金森病，心肌梗死，中風，孤獨癥，癲癇，Arthus現象，過敏反應，酒精成癮和藥物成癮。

在某些具體實施方案中，本發明提供使用抗CD40L抗體多肽(例如BMS-986004)治療特發性血小板減少性紫癜(ITP)的方法。該方法可以使患者中的血小板計數正常化。任選地，患者的基線外周血血小板計數在治療后可以至少增加一倍。在治療后，患者的外周血基線血小板計數可以大于或等于50,000/mm³或大于或等于100,000/mm³。患者在治療后可以顯示外周血血小板計數增加20,000/mm³。患者在治療前可具有小于30,000/mm³的外周血血小板計數。在治療之前，患者可具有小于100×10⁹L或50×10⁹L的外周血血小板計數。患者可以在治療之前進行脾切除。任選地，在治療之前，患者先前接受過ITP治療。或者，在治療之前，患者未曾接受過ITP治療。

藥物組合物可以單獨施用，或者與免疫抑制劑/免疫調節劑和/或抗炎劑的組合療法中(即同時或順序)施用。不同的免疫疾病可能需要使用對治療免疫疾病有用的特定輔助化合物，這可以根據患者個案確定。例如，藥物組合物可以與一種或多種合適的佐劑，例如細胞因子(例如IL-10和IL-13)或其它免疫刺激劑，例如趨化因子，腫瘤相關抗原和肽組合施用。合適的佐劑是本領域已知的。

任何合適的方法或途徑可用于施用抗體多肽或藥物組合物。給藥途徑包括例如口服，靜脈內，腹膜內，皮下或肌肉內給藥。例如，抗體多肽可以配制在用于靜脈內施用的藥物組合物中，其可以包括藥學上可接受的載體。例如，藥物組合物可以包含10mM磷酸鈉，pH6.5；25mM精氨酸HCl；一級250mM蔗糖。治療有效劑量包括在配制劑中。

施用的抗體多肽的治療有效劑量取決于許多因素，包括例如所治療的免疫疾病的類型和嚴重性，組合療法的使用，抗體多肽或藥物組合物的施用途徑，以及患者的體重。治療有效量的域抗體的一個非限制性范圍是相對于患者的體重0.1-20mg/kg，在一方面，為1-10mg/kg。疾病狀態的體外和/或體內模型中CD40拮抗作用所需要的抗體多肽的量可以進一步指導抗體多肽的劑量。

在某些實施方案中，抗體多肽可以約75至約1500mg的劑量施用。該劑量可以每2周施用一次。任選地，劑量可以是至少75mg，至少225mg，至少675mg，約75mg，約225mg，約675mg，或約1500mg。例如，可以靜脈內施用100至750mg的抗體多肽。或者，劑量可以為約200mg至約1200mg，或約500mg至約1000mg。該方法包括至少一個給藥周期(例如2周)。任選地，可以施用至少2個劑量。在某些實施方案中，施用至少7個劑量。當施用多個劑量時，各劑量可以相同或不同。例如，劑量可以按設定的治療方案施用(例如每兩周一次(例如，在第1/第0周，第2周，第4周，第6周，第8周，第10周和第12周))，共施用7劑。

以下實施例僅僅是說明性的，并且不應被解釋為以任何方式限制本公開的范圍，因為本領域技術人員在閱讀本公開時會容易想到許多變化和等同物。

在本申請中引用的所有參考文獻、條目、專利和公開的專利申請的內容通過引用明確地并入本文。

實施例1

臨床藥理學和安全性

在一項雙盲，隨機，安慰劑對照，上升單劑量研究中，在健康和KLH攻擊的男性和女性(非育齡女性)受試者測試BMS-986004的安全性和功效(首次人體試驗)。將安慰劑或BMS-986004以0.6mg(最小預期生物效應水平[MABEL])、1.3mg、3.75mg、18.75mg、75mg和225mg的劑量，分別代表劑量組1-6，施用給75名健康受試者。劑量組1-3中的各9名受試者以2:1的比率隨機化以接受BMS-986004(N＝6)或安慰劑(N＝3)。在劑量組4-6中的各16名受試者以3:1的比率隨機化以接受BMS-986004(N＝12)或安慰劑(N＝4)。劑量組1-4中的受試者完成了研究，劑量組5-6中的受試者正在完成研究。

沒有報告嚴重不良事件。75名受試者中有43名報告了非嚴重不良事件(57.3％)。報告了一百二十三(123)個不良事件。在該123個事件中，9個(7.3％的事件)被指定為與治療相關，114個(92.7％的事件)被指定為不相關。總共7名受試者經歷了相關事件，包括劑量組3中的1名受試者(1例牙齦潰爛)，劑量組4(1例口瘡口炎，1例視野缺損，3例頭痛[同一受試者])中的3名受試者，劑量組5(1例肌痛，1例頭痛)，和劑量組6中的1名受試者(1例呼吸困難)。最常報道的事件是頭痛(18.7％的受試者)，鼻漏(9.3％的受試者)，咽炎(8.0％的受試者)和咳嗽，上呼吸道感染(6.7％的受試者)，大多數事件與治療無關。

系統器官類(SOC)的神經系統病癥是最常見的不良事件，頻率最高(22.7％的受試者)。最常報道的不良事件是頭痛(18.7％的受試者)。該SOC中的所有事件，除了5個事件(4個頭痛和1個視野缺損)相關之外，均為無關。“呼吸系統、胸部和縱隔病癥”，“肌肉骨骼和結締組織病癥”，“感染和侵染”、和“胃腸道病癥”等SOC分別占21.3％、18.7％、14.7％和13.3％的受試者頻率。報道的唯一感染是咽炎(8％的受試者)和上呼吸道感染(6.7％的受試者)，所有這些被指定為無關，且為1級或2級。沒有報道機會性感染、惡性腫瘤和血栓栓塞(TE)事件。

劑量組5(75mg)和劑量組6(225mg)的分析表明，就事件的頻率和跨越SOC的分布而言，不良事件概況與所有劑量組合并的不良事件概況相當。在劑量組5和劑量組6中，不良事件的總頻率分別為50.0％和43.8％，相比之下，所有劑量組合并的不良事件的總頻率為57.3％。

臨床試驗研究人員觀察受試者是否有靜脈和動脈TE的任何臨床表現。通過監測TE生物標志的變化進一步評估血栓栓塞的風險。在一組初級TE生物標志(即：D-二聚體，TAT，凝血酶原F1+2，aPTT，肌鈣蛋白I和血小板計數)中沒有鑒定到顯著的異常變化。此外，在體外沒有藥物誘導的血小板-白細胞聚集或藥物誘導的血小板-白細胞聚集性增加的證據(在多個時間點通過流式細胞術測量血小板單核細胞和血小板-中性粒細胞聚集體，作為血小板激活的敏感標記)。

在所有受試者中仔細評估肝功能，包括丙氨酸氨基轉移酶[ALT]、天冬氨酸轉氨酶[AST]和總膽紅素。在任何肝功能測試中沒有臨床上顯著的變化，并且沒有藥物誘導的肝損傷的跡象(根據eDISH和Hy's Law評估)。對所有受試者進行常規ECG，沒有受試者在給藥后經歷新的QTcF值>500毫秒的發作。此外，密切監測受試者的紅細胞(RBC)計數、血紅蛋白濃度、血細胞比容和網織紅細胞百分比，沒有觀察到貧血。研究者還監測了受試者的白細胞參數，白細胞參數沒有顯示包括絕對中性粒細胞數，絕對淋巴細胞數和CD4淋巴細胞計數在內的實驗室值的任何顯著降低。還監測了血清免疫球蛋白水平，IgG水平保持高于500mg/dL，有3名受試者除外(劑量組41名受試者，劑量組52名受試者)，他們的IgG僅瞬時下降到低于500mg/dL。沒有受試者由于安全問題被從研究中移除。此外，沒有滿足停止劑量遞增的安全擔憂/標準。

實施例2

BMS-986004的藥代動力學

BMS-986004的半衰期在高于18.75mg的劑量下是穩定的，在這些劑量下半衰期接近約4-5天。最大血清濃度發生在輸注結束時，其后的濃度多指數下降。平均暴露(C_max和AUC)以大致與劑量成比例的方式從18.75mg增加。

在該初步人體研究(首次人體試驗)中沒有發現臨床上顯著的健康風險，非臨床研究中的安全范圍(safety margin)是有利的。因此，正在ITP患者群體中評估BMS-986004。

實施例3

ITP患者中BMS-986004的整體風險/效益評估

施用BMS-986004藥物組合物可以使患有免疫性血小板減少性紫癜的患者中的血小板計數正常化。患者的基線外周血血小板計數可以在治療后至少增加一倍。在治療后，患者的外周血基線血小板計數可以大于或等于50,000/mm³或大于或等于100,000/mm³。患者可以顯示治療后外周血血小板計數增加20,000/mm³。

進行1b/2期多中心開放標簽研究以評價BMS-986004在患有ITP的受試者中的安全性、功效、劑量響應和藥理學(PK、靶點作用(target engagement)和PD)。該研究使用75mg開始，該劑量顯示相對低的免疫抑制效果，并且在初步人體研究中沒有表現出臨床上顯著的風險。在仔細審查所有累積安全性信息后，以遞增方式(從75mg作為最低劑量開始)將人ITP患者納入劑量組中。累積安全性數據包括初步人體研究中可用的所有數據以及ITP研究期間收集的其他數據。

ITP受試者從BMS-986004中獲得臨床益處，并幫助指導劑量選擇和未來研究在BMS-986004的臨床開發中的設計。主要功效評估包括達到下述者的患者的比例：至少≥30,000/mm³的血小板計數，血小板計數從基線計數增加至少2倍、以及沒有出血。(根據ITP國際工作組，“沒有出血”可以包括輕微的出血癥狀，例如皮膚中1級出血癥狀的單個事件，其可能與ITP無關。參見Rodeghiero等人，Blood，113(11)：2386-2393(2009))。

實施例4

患者納入和排除標準

BMS-986004可用于患有如美國血液學協會(ASH)指南所定義的持續性或慢性ITP的受試者。人類受試者在治療前可具有小于30,000/mm³的外周血血小板計數。在治療之前，人類患者可具有小于100×10⁹L或50×10⁹L的外周血血小板計數。這些受試者可能已經經過常規治療失敗，包括免疫抑制治療，脾切除術和TPO模擬物/激動劑。在先的ITP治療可包括例如皮質類固醇、免疫球蛋白、硫唑嘌呤、達那唑、環磷酰胺和/或利妥昔單抗。人類患者可能在治療之前已切除脾。受試者在至少一次在先的ITP治療后可能難治或復發，即，到他先前的ITP治療為止未能實現持續(超過3個月)的血小板計數≥50000/mm³。

基于以下標準選擇實施例15中的研究的患者：在研究藥物施用前21天進行確定受試者合格性的篩選評價。患者的血小板計數(自在篩選期和預治療期期間在一周內取得的2次計數的平均值計算)小于35,000/mm³。基于在一周內進行的兩次測定的平均值，患者的血小板計數是穩定的和/或下降的，并且不能呈現上升趨勢。

篩選的患者的全血細胞計數在參考范圍內(包括不指示ITP以外的病癥的白細胞計數[WBC]差異)，但有以下例外：

·血紅蛋白水平在正常下限(LLN)到9g/dL(女性)或10g/dL(男性)的受試者，如果貧血明顯可歸因于ITP(過度失血)，有資格入選。

·絕對中性粒細胞計數(ANC)大于或等于1500/μL(由于皮質類固醇治療所致的升高的WBC/ANC是可接受的)；

凝血酶原時間/國際標準化比率(PT/INR)和活化部分凝血活酶時間(aPTT)在正常范圍的80％至120％內，沒有已知的高凝狀態。監測患者的以下臨床化學，使其不超過正常參考范圍的2倍：ALT、AST、堿性磷酸酶、以及膽紅素>正常上限(ULN)的1.5倍(如果膽紅素是分級的且直接膽紅素<35％，則分離的膽紅素>1.5×ULN是可接受的)。患者的白蛋白偏差在正常范圍的80％至120％之外。

育齡女性患者在開始研究藥物給藥前24小時內血清或尿妊娠試驗(最小靈敏度25IU/L或等效單位的HCG)必須為陰性。女性患者不能在哺乳期。育齡女性患者在研究藥物(84天)治療全過程中，加上研究藥物的5個半衰期(20天)加30天(排卵周期的持續時間)共計134天的治療完成后期間內必須使用避孕。與育齡女性患者性活躍的男性必須在研究藥物(84天)治療期間、加上研究藥物的5個半衰期(20天)加上90天(精子周轉的持續時間)共計194天的治療完成后期間內使用避孕。無精子癥男性和持續沒有異性性行為的WOCBP可免于避孕要求。然而，她們仍然必須接受妊娠測試。

入選的患者不具有繼發性免疫性血小板減少癥，例如由于SLE，CLL，CVID，APS或藥物誘導的血小板減少癥。入選的患者也沒有MDS(骨髓增生異常綜合征)的病史。入選的患者不顯示其血小板減少癥的可識別的另類原因，例如脾腫大、家族血小板減少癥、菌血癥、敗血癥或需要或不需要治療的活動感染。此外，入選的患者沒有：

·除慢性ITP以外的任何嚴重的醫學狀況(心臟，肝臟或腎臟疾病)。(注：作為規則，“嚴重”定義為3級及以上，根據由《不良事件的常用術語標準》4.03版描述的準則)；

·過去24個月內血栓栓塞性疾病的病史(如短暫性腦缺血發作[TIA]，卒中[CVA]，肺栓塞[PE])，深靜脈血栓形成史(DVT)或血栓并發癥)

·有顯著心血管疾病史(例如，充血性心力衰竭[CHF]紐約心臟協會III/IV級，已知可增加血栓栓塞事件風險的心律失常[例如心房顫動]，校正心率的QT間期>450毫秒的受試者，心絞痛，冠狀動脈支架置入，血管成形術，冠狀動脈旁路移植術)；

·無法進行靜脈穿刺和/或耐受靜脈通路；或者

患者也可以因下列物理和實驗室測試結果而排除：

·凝血生物標志的臨床顯著異常；

·在30天內未接受過IVIg的患者中的直接Coombs試驗異常(陽性)；

·丙型肝炎抗體血篩陽性；

·HIV-1、-2抗體或p24抗原篩查陽性(如果研究者認為有必要，可進行HIV病毒RNA檢測)；

·活動乙型肝炎感染的試驗陽性，如使用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)和乙型肝炎核心抗體(抗HBc)篩查(見附錄3)所提示的。

·QuantiFERON TB試驗陽性；

·器官功能障礙，或身體檢查、生命體征、ECG或臨床實驗室檢查中任何臨床上顯著偏離正常，超出與目標人群相符的范圍的證據。

具有對IV施用的生物治療的嚴重不良反應或超敏反應史，或任何顯著藥物變應性(例如過敏反應或肝毒性)的患者也被排除在研究之外。收到非自愿監禁或強制拘留以治療精神或身體(例如傳染病)疾病的囚犯不納入研究中。最后，不納入先前有BMS-986004暴露的患者。

入選的患者還已表示他們在下述的時間內沒有使用以下藥物或接受以下治療：

·在首次給藥前180天內：

○靜脈內(IV)環磷酰胺；

○為伴隨狀況施用的3次或更多次全身性皮質類固醇；

○利妥昔單抗；

·在首次給藥前90天內：

○高劑量地塞米松(40mg/天IV)用于治療ITP；

·在首次給藥前60天內：

○非生物制劑(non-biologic)研究藥；

○任何其他免疫抑制劑/免疫調節劑(包括霉酚酸酯，環磷酰胺，西羅莫司)，但是達那唑、硫唑嘌呤和皮質類固醇除外；

·在首次給藥前30天內：

○脾切除術；

○輸血；

○靜脈注射免疫球蛋白；

○大于10mg/天的皮質類固醇(潑尼松或潑尼松等效物)。

實施例5

1b/2期研究設計

該研究分為三個階段：響應階段(6周)，緩解階段(6周)和隨訪階段(4周)。篩選后，總共40名可評價的受試者入選研究。如果受試者接受前4個劑量的研究藥物并在第50天完成所需的安全性和功效評價，則將受試者視為可評價的。替換不可評價的受試者以在每個劑量組中維持10名受試者的計數。

在每組10名受試者的劑量組中處理受試者。以升序方式(約75mg至約1500mg)依次選入四(4)個劑量小組，選擇劑量強度以在穩定狀態下提供增加的免疫抑制水平。

BMS-986004以IV輸注形式每2周施用一次，共7個劑量。在響應階段內在6周治療期內施用四(4)個劑量。剩余的3個劑量在研究的緩解期期間在6周治療期內施用。受試者在第1天/第0周，第2周，第4周，第6周，第8周，第10周和第12周接受研究產品，共7個劑量。

每個劑量群組將包括10名新受試者，并且將在第1天/第0周接受相應的劑量水平，而不管由于受試者內劑量遞增而加入劑量群組的受試者的數量。在響應階段結束時(第6周)，如果在75mg組中治療的至少6名受試者達到血小板響應(血小板計數≥3,000/mm³且比基線計數增加至少2倍，且沒有出血)，則開辟一個新的群組，用低于75mg的劑量治療受試者。該新群組遵循與其他群組相同的時間表，包括受試者內劑量遞增。

實施例6

BMS-986004的制備和靜脈內給藥

BMS-986004是透明至輕微不透明，無色至淺黃色的溶液，在目視檢查時可能含有顆粒物質。藥品是不含防腐劑的即用型溶液，其包含在具有20mm開口、I型火石玻璃、1塊標簽牌、開放標簽的10cc小瓶中。每小瓶藥品含有在10mM磷酸鈉pH6.5，25mM精氨酸HCl，250mM蔗糖中的標記量的BMS-986004，190mg/瓶(50mg/mL)。每個小瓶中包括13％的過量填充，以備小瓶、針頭注射器(VNS)滯留。該藥物制劑僅用于靜脈內給藥。

使用無菌一次性注射器稀釋BMS-986004注射液供IV使用。在IV給藥之前，用0.9％氯化鈉注射液(NS)稀釋BMS-986004注射液，以制備BMS-986004濃度范圍為1.5至30mg/mL的給藥溶液。下表1表示每次處理的每劑量的總劑量和小瓶數量。

表1

劑量概要

使用輸注泵以輸注形式施用研究藥物。對于每名患者，歷時最多2小時輸注藥品，使用體積泵按照方案特定的劑量和速率通過IV輸注。

在輸注之前(在給藥當日輸注之前的任何時間)、在輸注期間大約每15分鐘、在輸注結束時(在輸注停止10分鐘內)、以及在輸注完成后大約每30分鐘直到穩定為止，如研究者所判斷的，監測生命體征(血壓，心率，呼吸速率和體溫)。當發生類似過敏樣的輸注反應或過敏反應時，更頻繁地檢測生命體征，視反應的嚴重性需要。對于給予研究藥物的訪視，在出院之前也采取血壓和心率。

在整個給藥間隔期內的選定時間進行物理檢查、生命體征測量、12導聯心電圖(ECG)和臨床實驗室評價。在整個研究中密切監測受試者的不良事件。收集血樣直至研究藥物施用后336小時用于藥代動力學(PK)分析。在整個研究期間從每個受試者抽取約553mL的血液。研究的大致持續時間為20周(約140天)。這包括21天的篩選期，12周的治療期和1個月的隨訪期。研究的結束定義為最后一次進行研究的受試者的最后一次訪視之日。

實施例7

生物標志評估

抽取血液用于測量以下抗體靶點作用、PD及疾病相關生物標志。

治療可產生至少一種可用選自下組的生物標志來度量的治療作用：血小板響應/完全響應(R/CR)、血小板計數、CD40L受體占據、血小板相關抗血小板抗體、血小板Ag特異性B細胞、血小板抗原特異性B細胞、血漿可溶性游離CD40L水平、血漿可溶性總CD40L水平、外周血中漿細胞相關全血基因表達、B細胞庫組分分析、和免疫細胞計數(T，B和NK)。治療可能不產生可由選自下組的生物標志度量的不良作用：血小板-白細胞聚集、血漿d-二聚體、血漿凝血酶抗凝血酶(TAT)、血清肌鈣蛋白1、活化部分凝血活酶時間(aPTT)、和心電圖(ECG)、C相關蛋白(CRP)、免疫球蛋白(IgM，IgG，IgA)、免疫細胞計數(T，B和NK)和表型。

主要安全(TE)生物標志評估

早先處于臨床開發中的靶向CD40L的分子已經顯示了誘導血栓栓塞(TE)的潛在可能。所有來自BMS-986004的非臨床、非人靈長類動物和單次上升劑量臨床研究的數據均符合BMS-986004不具有血小板活化活性或其它與誘導TE相關的活性的結論。為了進一步減小給予BMS-986004的受試者中TE的風險，以頻繁的間隔監測一組主要的、公認的血小板活化和TE電位標記，并實時分析。收集血漿和血清以監測潛在TE事件的風險并最小化其影響。在篩選時評估凝血酶原時間(PT)和活化的部分凝血活酶時間(aPTT)以排除具有高凝狀態證據的患者。定量血漿中的D-二聚體和凝血酶抗凝血酶(TAT)作為TE風險的度量。監測血清肌鈣蛋白I作為潛在的TE相關亞臨床心肌梗死的指標。收集這些主要安全生物標志物的測量數據，在全面審查所有可用臨床數據的背景下對其進行仔細評估，將其用于在劑量遞增之前作出進行/不進行的決定。

靶點作用生物標志評估

在給藥后以頻繁的時間間隔使用CD40L受體占據(RO)測定法評價體內靶點作用(TE)。基于流式細胞術測定來自競爭性熒光標記的CD40L特異性抗體的信號相對于給藥前信號的降低，由此測定BMS-986004對全血中CD4+T細胞上的CD40L的結合。

探索性生物標志評估

除了確認RO的靶點作用之外，還測量探索性PD生物標志，以提供疾病相關(disease-relevant)和途徑特異性(pathway-specific)的體內生物活性的證據。通過免疫測定法測量血小板相關的抗血小板抗體效價，并通過ELISPOT計數血小板Ag特異性B細胞，以評估BMS-986004對抗血小板自身免疫活性的影響。通過對B細胞受體基因的高通量測序來探查B細胞庫。分別通過免疫測定和LC/MS測量游離和總可溶性CD40L，作為靶點作用和靶點負載的量度。通過微陣列和/或基于RT-PCR的技術測量下述基因的外周血表達：先前在臨床前和單升劑量臨床研究中顯示被BMS-986004的存在所調節的基因，以及與感興趣的細胞類型(例如漿細胞)相關的基因。

探索性安全生物標志評估

評估基于血清和細胞的生物標志以評價BMS-986004對保護性免疫的影響。測量血清免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA)水平以監測體液免疫。通過測量病毒血清學(抗EBV，抗CMV，抗HBV)評估針對病毒再激活的保護性免疫的存在。通過定期測量血清CRP來支持對急性炎癥的監測。最后，通過常規細胞計數(T，B和NK細胞計數)和通過全血流細胞計數的細胞表型評價BMS-986004重復給藥對免疫細胞亞群的任何影響。

實施例8

受試者內劑量遞增(intra-subject dose escalation)

受試者內劑量遞增，如果有的話，發生在受試者完成研究的響應階段之后。受試者內劑量遞增的決定在審查治療4周后的安全性信息和血小板計數的基礎上作出。在第50天，即給予第四次給藥BMS-986004后第7天，在評估血小板計數后，決定升高受試者的劑量。如果基于在第43天和第50天進行的最后兩次連續計數的血小板計數的測量尚未實現臨床上顯著的響應，且觀察到有利的安全性特征，則受試者接受高一級劑量的BMS-986004。臨床上顯著的響應定義為達到血小板計數≥50,000/mm³，與治療前受試者的基線血小板計數相比增加至少20,000/mm³，且沒有出血。然后在研究的剩余時間內(緩解期)以所述更高劑量水平對受試者給藥，受試者在第8周、第10周和第12周接受該劑量的研究產品。任何個體受試者使用BMS-986004的主動治療期，無論劑量為何，不得超過12周。

如果受試者的血小板計數超過450,000/mm³，如通過連續兩次血小板計數測量所指示的，則停止BMS-986004給藥。否則，受試者繼續參與研究，并且按照正常研究訪視計劃評估血小板計數。BMS-986004給藥只有在研究主任(study director)和研究員討論是否臨床上適當后才能重新開始，并由醫學判斷和受試者的安全決定。

關于劑量遞增的決定是基于對所有累積安全性信息的評價作出的，所述累積性安全性信息包括來自先前的較低劑量群組的前5個受試者的研究到第15天為止的安全性數據。升高到下一個更高劑量，如果有的話，在一個群組中的5個受試者已經被隨訪至少2周，且停止規則無一被滿足時發生。如果在劑量組中不存在停止規則，則劑量遞增在下一更高劑量水平內繼續進行。

某一群組的選定劑量不超過該群組的原始計劃劑量，即群組C的選定劑量不應大于675mg，且對于群組D應為至多1500mg。

下面列出的停止規則用于確定將入選的患者升級到下一個更高的群組是否安全。如果以下標準中的任一個被滿足，則不繼續進行到下一計劃劑量的劑量遞增(由不良事件的常用術語標準[CTCAE，版本4.0]定義的不良事件分級)：

·一個群組中的四名以上的受試者的血小板計數>450,000/mm3，

·兩名以上的受試者有被確定與研究藥物相關的同一器官系統(3級及以上)中的嚴重不良事件，

·確定已達到安全性和/或耐受性的界限(由研究組和研究員確定)。

其他停止劑量遞增的原因包括，但不限于，在個體受試者中觀察單個嚴重不良事件，觀察到給定劑量組和全部劑量組中的趨勢，和確定已經達到安全性和/或耐受性的界限(由研究組和研究者確定)。

如果在某一劑量水平內任何上述標準被滿足，則暫停推進到更高劑量水平，并且評價研究中所有可用的安全性數據以估計推進到更高劑量水平的風險。該審查將包括所有經歷上述SAE的受試者。此外，數據集可以包括來自某個劑量組、全部劑量組、或者如果合適的話，所有迄今為止治療過的所有隨機化受試者的受試者。如果由于這些發現中的任何一個而停止劑量遞增，則另外的群組可以接受相同或更低劑量的研究化合物。在劑量遞增時，視累積的安全性數據的要求，將新群組的劑量水平調整為較低劑量。研究設計示意圖如圖2和圖3所示。

已經參照上面的示例詳細描述了上述實施方案，但是應當理解，可以進行各種修改而不脫離這些實施方案的精神，這是本領域技術人員容易知道的。

序列表

<110> 百時美施貴寶公司

<120> 使用針對CD40L的域抗體治療自身免疫性疾病的方法

<130> 12376-WO-PCT

<150> 62/048459

<151> 2014-09-10

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo Sapien

<400> 1

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CDR1區

<400> 2

Trp Glu Leu Met Gly

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CDR2區

<400> 3

Gly Ile Glu Gly Pro Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CDR3區

<400> 4

Lys Asp Ala Lys Ser Asp Tyr

1 5

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 可變區

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Trp Glu

20 25 30

Leu Met Gly Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Glu Gly Pro Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Val Gly Lys Asp Ala Lys Ser Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Trp Glu

20 25 30

Leu Met Gly Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Glu Gly Pro Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Val Gly Lys Asp Ala Lys Ser Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

115 120 125

Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser

130 135 140

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

145 150 155 160

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

165 170 175

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

180 185 190

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

195 200 205

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

210 215 220

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

225 230 235 240

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

245 250 255

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

260 265 270

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

275 280 285

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

290 295 300

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

305 310 315 320

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

325 330 335

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

340 345 350

Lys