發明背景生物骨替代品必需符合以下要求：具有高度多孔性，并提供用于細胞再生的微環境，例如支持細胞附著、增殖、分化，并以此啟動和維持新組織產生。為制造用于組織工程的三維(3D)支架，已開發利用了各種金屬。盡管金屬具有有利的機械性能，但其缺點是不可生物降解。同步的是，無機/陶瓷材料，例如羥基磷灰石(HA)或磷酸鈣已被開發展現出所需的骨傳導性，但難以產生高度多孔的結構且是易碎的。最后，模擬生命系統結構的仿生人工設計支架，提供了生理性胞外基質的特性以在植入的生物材料中募集細胞。關于這點，源于殼質的殼聚糖尤其令人感興趣。殼聚糖殼聚糖是衍生自通過β-(1-4)-連接的D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-葡萄糖胺單元隨機構建的殼質的多糖。殼聚糖顯示出用于組織工程目的的合適特性。該聚合物是生物相容的和生物可降解的，并且既可作為凝膠和組織樣單元用于3D-支架，也可作為膜和纖維用于2D-支架(CroisierF,C.Chitosan-basedbiomaterialsfortissueengineering.EuropPolymerJ2013；49:780-792)。殼聚糖已用作空間填充的植入物。然而，該天然聚合物必需與具有形態發生活性的組分(如硅石)一起加工，以成為用于骨再生的合適基質(ShirosakiY,TsuruK,HayakawaS,OsakaA,LopesMA,SantosJD,CostaMA,FernandesMH.Physical,chemicalandinvitrobiologicalprofileofchitosanhybridmembraneasafunctionoforganosiloxaneconcentration.ActaBiomater2009；5:346-355)。骨修復期間的必要階段骨修復是可劃分為能受“智能的”階段特異性支架材料影響的多個階段的過程。階段1-血液凝固和polyP的作用：骨修復通過骨缺損位點的血液凝固來引發。密集的人血小板顆粒含有大量polyP，其鏈長為70-75個(RuizFA,LeaCR,OldfieldE,DocampoR.Humanplateletdensegranulescontainpolyphosphateandaresimilartoacidocalcisomesofbacteriaandunicellulareukaryotes.JBiolChem2004；279:44250-44257)，或60-100個磷酸鹽單元(MüllerF,MutchNJ,SchenkWA,SmithSA,EsterlL,SpronkHM,SchmidbauerS,GahlWA,MorrisseyJH,RennéT.Plateletpolyphosphatesareproinflammatoryandprocoagulantmediatorsinvivo.Cell2009；139:1143-1156)，其在血小板激活后被釋放(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。血小板分泌的PolyP充當止血調節物；其為通過促進因子V活化和接觸途徑活化來加速血液凝固的促凝血劑(SmithSA,MorrisseyJH.Polyphosphateasageneralprocoagulantagent.JThrombHaemost2008；6:1750-1756)。另一方面，polyP通過增強凝血酶激活的纖維蛋白溶解抑制劑來延遲血塊溶解(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。血塊中發現了一系列的生長因子，包括成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子β(TGF-b)和血管內皮生長因子(VEGF)。這些因子可增強骨生成的不同階段。例如，成骨細胞祖細胞的增殖是由PDGF、EGF和FGF-2刺激的。階段2–碳酸鈣生物種子形成：可以證實生物方解石(biocalcite)(CaCO3)在引發骨HA形成期間發揮了關鍵作用。已證明CaCO3沉積物起磷酸鈣沉淀至骨形成細胞上的生物種子的作用(MüllerWEG,HC,SchlossmacherU,GrebenjukVA,UshijimaH,WangXH.InductionofcarbonicanhydraseinSaOS-2cells,exposedtobicarbonateandconsequencesforcalciumphosphatecrystalformation.Biomaterials2013；34:8671-8680)。尤其是，通過磷酸鈣沉積物的最初形成，碳酸酐酶不僅促進碳酸氫鈣/碳酸鈣生物礦物形成，而且還與polyP/焦磷酸鹽-降解骨堿性磷酸酶(組織-非特異性ALP)一起發揮作用。階段3–羥基磷灰石沉積：最初形成的磷酸鈣沉積物隨后通過所述ALP轉化為磷酸鈣/HA礦物，開啟了骨疾病治療干預新策略的進展，如具有形態發生活性的植入物材料的進展(WangXH,HC,MüllerWEG.Enzyme-basedbiosilicaandbiocalcite:biomaterialsforthefutureinregenerativemedicine.TrendsBiotechnol2014,inpress；doi:10.1016/j.tibtech.2014.05.004)。聚磷酸鹽(polyP)此前本發明人公開了HA沉積于骨細胞的過程中的polyP的作用。PolyP是天然存在的含有兩個至上百個磷酸鹽殘基的線性聚合物(HC,MüllerWEG,eds.InorganicPolyphosphates-Biochemistry,Biology,Biotechnology.ProgMolSubcellBiol1999；23:45-81)。可化學合成和酶促合成PolyP(KulaevIS,VagabovV,KulakovskayaT.TheBiochemistryofInorganicPolyphosphates.NewYork:JohnWiley&SonsInc；2004)。通過聚磷酸鹽激酶來酶促合成PolyP，并且通過外切聚磷酸酶和內切聚磷酸酶來酶促降解PolyP(綜述于:HC,LorenzB,KurzL,MüllerWEG.InorganicpolyPineukaryotes:enzymes,metabolismandfunction.InHC,MüllerWEG,eds,InorganicPolyphosphates-Biochemistry,Biology,Biotechnology.ProgMolSubcellBiol1999；23:45-81)。已知有多種降解polyP的酶(例如,LorenzB,MüllerWEG,KulaevIS,HC.PurificationandcharacterizationofanexopolyphosphataseactivityfromSaccharomycescerevisiae.JBiolChem1994；269:22198-22204)，其中有骨ALP(LorenzB,HC.Mammalianintestinalalkalinephosphataseactsashighlyactiveexopolyphosphatase.BiochimBiophysActa2001；1547:254-261)。骨ALP(組織非特異性ALP)是通過針對單體磷酸鹽的過程型機制來降解polyP的外切聚磷酸酶(LorenzB,HC.Mammalianintestinalalkalinephosphataseactsashighlyactiveexopolyphosphatase.BiochimBiophysActa2001；1547:254-261)。PolyP存在于骨組織中(LeyhausenG,LorenzB,ZhuH,GeurtsenW,BohnensackR,MüllerWEG,HC.Inorganicpolyphosphateinhumanosteoblast-likecells.JBoneMineralRes1998；13:803-812；HC,KurzL,MüllerWEG,LorenzB.Polyphosphateinbone.Biochemistry(Moscow)2000；65:296-303)，并存在于血小板中(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。PolyP在與Ca2+離子形成復合體后(polyP·Ca2+-復合體或polyP·Ca2+-鹽)為具有形態發生活性的；所述polyP·Ca2+-復合體-誘導骨ALP(組織非特異性ALP)的表達并增強其活性(MüllerWEG,WangXH,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,LieberwirthI,GlasserG,WiensM,HC.Inorganicpolymericphosphate/polyphosphateisaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularCa2+levelinosteoblasts(SaOS-2cells)invitro.ActaBiomater2011；7:2661-2671)；-增加成骨細胞中的細胞內Ca2+水平(MüllerWEG,WangXH,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,LieberwirthI,GlasserG,WiensM,HC.Inorganicpolymericphosphate/polyphosphateisaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularCa2+levelinosteoblasts(SaOS-2cells)invitro.ActaBiomater2011；7:2661-2671)；-增強骨(HA)形成細胞中編碼BMP-2的基因的表達(WangXH,HC,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,WiensM,MüllerWEG.Dualeffectofinorganicpolymericphosphate/polyphosphateonosteoblastsandosteoclastsinvitro.JTissueEngRegenMed2013；7:767-776)；-誘導HA形成(WangXH,HC,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,WiensM,MüllerWEG.Dualeffectofinorganicpolymericphosphate/polyphosphateonosteoblastsandosteoclastsinvitro.JTissueEngRegenMed2013；7:767-776)；以及-抑制破骨細胞的分化(WangXH,HC,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,WiensM,MüllerWEG.Dualeffectofinorganicpolymericphosphate/polyphosphateonosteoblastsandosteoclastsinvitro.JTissueEngRegenMed2013；7:767-776)。下列涉及polyP或polyP·Ca2+-復合體的專利申請為相關的：GB1406840.7.用于生物打印生物人工組織的具有形態發生活性的水凝膠(Morphogeneticallyactivehydrogelforbioprintingofbioartificialtissue)。發明人：MüllerWEG,HC,WangXH。GB1403899.6.包含槲皮素和聚磷酸鹽的用于治療骨疾病的協同組合物(Synergisticcompositioncomprisingquercetinandpolyphosphatefortreatmentofbonedisorders)。發明人：MüllerWEG,HC,WangXH。GB1319416.2.基于聚磷酸鹽/碳酸鹽和碳酸酐酶激活劑的組合的骨礦化調節劑(Modulatorofbonemineralizationbasedonacombinationofpolyphosphate/carbonateandcarbonicanhydraseactivators)。發明人：MüllerWEG,HC,WangXH。在本發明中描述了polyP與殼聚糖的復合體，其可用作用于骨組織工程和修復的仿生材料，所述仿生材料特性為具有可控的形態并展示出形態發生活性。在生理條件下，殼聚糖不能與polyP形成復合體。因此，本發明人采用最新技術程序使殼聚糖衍生為N,O-羧甲基殼聚糖(N,O-CMC)(ChenSC,WuYC,MiFL,LinYH,YuLC,SungHW.AnovelpH-sensitivehydrogelcomposedofN,O-carboxymethylchitosanandalginatecross-linkedbygenipinforproteindrugdelivery.JControlRelease2004；96:285-300；AnithaA,DivyaRaniVV,KrishnaR,SreejaV,SelvamuruganN,NairSV,TamuraH,JayakumarR.Synthesis,characterization,cytotoxicityandantibacterialstudiesofchitosan,O-carboxymethylandN,O-carboxymethylchitosannanoparticles.CarbohydratePolymers2009；78:672-677)。N,O-CMC的兩性特性為該聚合物提供了豐富的應用(MouryaV.K,InamdarNNandTiwariA.carboxymethylchitosananditsapplications.AdvMatLett2010；1:11-33)。生物礦化硅生物礦化硅是通過酶硅蛋白由正硅酸鹽酶促形成的天然存在的聚合物(MüllerWEG,HC,BurghardZ,PisignanoD,WangXH.Silicateins:aparadigmshiftinbioinorganicchemistry.Enzymaticsynthesisofinorganicpolymericsilica.ChemEurJ2013；19:5790-5804)。生物礦化硅對骨形成細胞具有誘導性合成作用；其增加BMP-2的表達，并引起骨保護素:RANKL比例的變化，導致抑制破骨細胞前體分化為成熟的破骨細胞(綜述于：WangXH,HC,WiensM,UshijimaH,MüllerWEG.Bio-silicaandbio-polyphosphate:applicationsinbiomedicine(boneformation).CurrOpinBiotechnol2012；23:570-578)。下列涉及生物礦化硅的專利或專利申請是相關的：EP1320624；US7169589B2；DE10037270；CN01813484.X；NZ523474；AU2001289713.硅蛋白介導的非晶形硅酸鹽和硅氧烷的合成及其應用(Silicatein-mediatedsynthesisofamorphoussilicatesandsiloxanesandtheiruses)。發明人：MüllerWEG,LorenzA,KraskoA,HC。US6670438B1.體外合成二氧化硅、聚硅倍半氧烷、聚硅氧烷和聚金屬氧烷的方法、組合物以及仿生催化劑(Methods,compositions,andbiomimeticcatalystsforinvitrosynthesisofsilica,polysilsequioxane,polysiloxane,andpolymetallo-oxanes)。發明人：MorseDE,StuckyGD,Deming,TD,ChaJ,ShimizuK,ZhouY。DE10246186.采用新的silicase酶，用于例如治療矽肺或制備假體材料的二氧化硅和硅酮的體外和體內降解或合成(Invitroandinvivodegradationorsynthesisofsilicondioxideandsilicones,usefule.g.fortreatingsilicosisortoprepareprostheticmaterials,usinganewsilicaseenzyme)。發明人：MüllerWEG,KraskoA,HC。EP1546319.Silicase對硅酸鹽和硅酮的分解和修飾以及這種可逆酶的用途(AbbauundModifizierungvonSilicatenundSiliconendurchSilicaseundVerwendungdesreversiblenEnzyms)。發明人：MüllerWEG,KraskoA,HC。EP1740707；US11579019；DE10352433.9；CA2565118；JP2007509991.由非有機硅化合物以及氨基硅烷和硅氮烷通過酶和模板控制的合成得到的二氧化硅及其用途(Enzym-undTemplate-gesteuerteSynthesevonSilicaausnicht-organischenSiliciumverbindungensowieAminosilanenundSilazanenundVerwendung)。發明人：SchwertnerH,MüllerWEG,HC。EP09005849.6.用于結構導向制造(納米)復合材料的silintaphin在醫學和(納米)技術中的用途(Useofsilintaphinforthestructure-directedfabricationof(nano)compositematerialsinmedicineand(nano)technology)。發明人：WiensM,MüllerWEG,HC,WangX。DE102004021229.5；EP2005004738；US11579020；JP2007509992；CA2565121.用于制備具有生物活性的刺激成骨細胞表面的酶促方法及其用途(Enzymaticmethodforproducingbioactive,osteoblast-stimulatingsurfacesandusethereof)。發明人：MüllerWEG,SchwertnerH,HC。US60839601；EP2007007363.生物礦化硅-粘附蛋白納米復合材料：合成和在牙醫學中的應用(Biosilica-adhesiveproteinnano-compositematerials:synthesisandapplicationindentistry)。發明人：MüllerWEG,HC,GeurtsenWK。PCT/US2009/005302.組合物、口腔護理產品以及制備和使用它們的方法(Compositions,oralcareproductsandmethodsofmakingandusingthesame)。發明人：MillerJ,H,GeurtsenW,LückerP,WiensM,HC,MüllerWEG。GB1405994.3.用于治療骨缺損的成骨材料(Osteogenicmaterialtobeusedfortreatmentofbonedefects)。發明人：MüllerWEG,HC,WangXH。生物玻璃生物玻璃(生物活性玻璃)是可打印的硬質模擬骨的支架材料。當前的最新技術綜述于(HenchLL.Bioactivematerialsforgenecontrol.InHenchLL,JonesJR,FennMB,eds,NewMaterialsandTechnologiesforHealthcare.Singapore:WorldScientific,pp25-48,2011；JonesJR.Reviewofbioactiveglass:fromHenchtohybrids.ActaBiomater2013；9:4457-4486)。以下涉及生物玻璃的專利申請是相關的：GB1408402.4.通過與含有細胞的具有形態發生活性的藻酸鹽/明膠水凝膠組合來3D細胞打印含生物玻璃的支架(3Dcellprintingofbioglass-containingscaffoldsbycombinationwithcell-containingmorphogenicallyactivealginate/gelatinhydrogels)。發明人：MüllerWEG,HC,WangXH。由于仿生材料可代表用于移植的收獲組織的再生性替代物，其在組織工程方面的重要性逐漸增加。在三維模板中，廣泛采用模擬生理性胞外基質、殼聚糖和N,O-羧甲基殼聚糖(N,O-CMC)。為了提供這些具有生物學功能的聚合物，必需添加其他組分。本發明人研發了制備由藻酸鹽、N,O-CMC和Na-polyP組成的可生物打印的材料的配方。在將該材料打印為定制設計的/制造的層和植入物后，將這些結構暴露于Ca2+以使其硬化。在Ca2+暴露期間，polyP中的Na+陽離子被Ca2+交換，使得polyP與N,O-CMC橋接，并且使得該復合材料尤其穩定，而不喪失polyP的生物學活性。本發明人描述了基于N,O-CMC的polyP雜化材料的配制和制備。這兩種聚合物通過Ca2+橋以穩定的方式連接在一起并提供多孔結構。該材料可打印為填充μCT分析的損傷的植入物。由于該材料保持其形態發生功能、引發SaOS-2骨樣細胞上的生物礦化并加速血液凝固，所以N,O-CMC-polyP代表一種可用于骨缺損的組織工程中的富有前景的新材料。發明詳述本發明涉及用于合成由N,O-CMC和天然聚合物聚磷酸鹽(polyP)組成的新雜化材料的配方。通過Ca2+橋將這兩種聚合物連接在一起。那些N,O-CMC-polyP材料在培養基中保持其形態，并且尤其可用于生物打印。N,O-CMC-polyP打印的層和組織單元也保持其生物功能，以誘導骨細胞進行生物礦化，并加速人血液的凝血過程，繼而代表一種可用于組織工程學目的頗具前景的新材料。本發明的支架由羧甲基殼聚糖、聚磷酸鹽(鈉鹽)和藻酸鹽(鈉鹽)組成，通過所得水凝膠的3D打印(生物打印)來制造，并通過暴露于鈣離子來進行隨后的硬化。所述羧甲基殼聚糖可通過殼聚糖(N-羧甲基殼聚糖)的氨基、或殼聚糖(O-羧甲基殼聚糖)的羥基、或二者(N,O-羧甲基殼聚糖)的羧甲基化形成的。所述羧甲基殼聚糖的非羧甲基化的氨基和/或非羧甲基化的羥基可被乙酰化或部分乙酰化。本發明新的仿生3-階段支架具有以下特性；其為：-生物相容的，-生物可降解的，以及-可打印的。該支架模擬骨修復中的三個必要階段；其影響在骨修復的3個階段期間具有活性的以下3個目標位點：階段1:與從血小板釋放生長因子/細胞因子有關的血塊形成(初始階段)階段2:通過在羧甲基殼聚糖骨架提供成核中心形成碳酸鈣生物種子(種子階段)階段3:骨堿性磷酸酶的表達/激活(羥基磷灰石–生物礦物形成階段)以下發現為出人意料的：本發明的包含通過Ca2+連接至N,O-CMC聚合物的polyP的材料具有比已公開的殼聚糖+polyP-PEC復合體(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107；OngSY,WuJ,MoochhalaSM,TanMH,LuJ.Developmentofachitosan-basedwounddressingwithimprovedhemostaticandantimicrobialproperties.Biomaterials2008；29:4323-4332)顯著更強的效果，理由如下：(i)從公開的結果來看，可能的是polyP對于血塊形成的效果不需要polyP與鈣離子形成復合體或鹽；相反，polyP對于凝固的效果甚至已經在對血漿進行預孵育后且在加入鈣離子前觀察到(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。(ii)而且，令人驚奇的是，鈣鹽形式的polyP甚至在與N,O-CMC聚合物形成復合體后仍具有生物學活性。此外，令人驚奇的是本發明的配方：(i)是可打印的，以及(ii)3D打印后該打印的網狀組織顯示出足夠的穩定性–相比基于單獨的特定材料的特性的預測。所述藻酸鹽可補充有明膠或另外的膠原蛋白衍生的產物。此外，本發明人顯示本發明的藻酸鹽-CMC-polyP水凝膠可補充有刺激骨形成細胞礦物化并且表達具有形態發生活性的細胞因子，例如BMP-2的硅石或生物礦化硅。可通過硅蛋白來酶促形成所述聚合的硅石或生物礦化硅。本發明的技術可應用于制造含細胞的支架/植入物，尤其是含骨形成細胞、或骨溶解細胞、或這些細胞的混合物的支架，以此將所述細胞懸浮于藻酸鹽水凝膠中，使所得的含細胞的藻酸鹽-CMC-polyP水凝膠經歷3D打印(生物打印)，并通過暴露于鈣離子來進行后續的硬化。采用3D打印技術，所述水凝膠可與生物玻璃(生物活性玻璃)(納米)顆粒的懸浮液同時打印，所述生物玻璃(生物活性玻璃)(納米)顆粒可由不同摩爾比的SiO2:CaO:P2O5或SiO2:Na2O:CaO:P2O5，例如摩爾比(mol.％)為55:40:5的SiO2:CaO:P2O5，或摩爾比(mol.％)為46.1:24.4:26.9:2.6的SiO2:Na2O:CaO:P2O5組成(45S5)。所述polyP分子的平均鏈長范圍可為10個至高達100個磷酸鹽單元。用平均鏈長為約40個磷酸鹽單元的polyP分子獲得最佳結果。。可作為額外組分添加的聚合硅酸可通過生物礦化硅(非晶形水合氧化硅)代謝中涉及的酶或蛋白，如硅蛋白、或硅蛋白融合蛋白來形成。所述硅蛋白多肽或硅蛋白融合蛋白可采用原核或真核表達系統產生，或者可通過合成產生。所述硅蛋白或硅蛋白融合蛋白可與合適的基底(硅石前體)一起存在，所述基底如水玻璃、原硅酸、原硅酸鹽、單烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基硅烷醇(trialkoxysilanols)、四烷氧基硅烷、烷基-硅烷三醇、烷基-硅烷二醇、烷基-單烷氧基硅烷二醇、烷基-單烷氧基硅烷醇、烷基-二烷氧基硅烷醇或烷基-三烷氧基硅烷。本發明的另一方面涉及通過上述方法之一獲得的被用作骨植入物或形成該植入物的部分的材料的3D-生物打印的支架。可以通過3D打印、3D細胞打印(生物打印)、或另外的快速成型程序制備用于治療骨缺損的呈定制的植入物形式的骨植入材料。現在將在以下的優選實施例中進一步描述本發明，然而，本發明不限于此。為本發明的目的，將本文引用的所有文獻通過引用整體并入本文中。在圖中，圖1顯示了N,O-CMC-polyP膜和組織單元的形成。(A)將由D-葡萄糖胺(脫乙酰化)和N-乙酰基-D-葡萄糖胺(乙酰化)單元表征的殼聚糖，通過該聚合物的部分羧甲基化轉化為N,O-CMC。(B至E)生物打印兩層(B和C)至六層(D)的墊。(E)N,O-CMC-polyP組織樣單元—根據豬下頜(uj)中的損傷形成的植入物(im)的打印。圖2顯示了由N,O-CMC形成的膜的EDX分析。在無polyP存在下(A和C)或在polyP存在下(B和D)制備膜。僅在N,O-CMC-polyP膜的EDX光譜中顯示了磷和鈣的信號。圖3顯示了N,O-CMC-polyP網狀組織的完整性和穩定性。相比融合的由不含有polyP的N,O-CMC構建的支架網(A)，N,O-CMC-polyP網甚至浸沒在培養基中還保持為完整的。(B和C)新制備的N,O-CMC-polyP網狀組織。可以看出，打印的圓筒的融合僅在交叉點看到；形成了連續的交叉點。(D)甚至將N,O-CMC-polyP網于培養基中經歷5d的孵育期后，所述圓筒還保持為分開的，從而允許細胞(c)在開放的空間增殖。圖4顯示了SaOS-2細胞在殼聚糖基質上礦化的效能。SaOS-2細胞在無OC(對照；-OC)或OC存在下生長。在后者的分析中，將細胞培養于此前公開的N,O-CMC水凝膠(N,O-CMChg)或在無polyP(N,O-CMC-polyP)或polyP存在(N,O-CMC+polyP)下的N,O-CMC層中。生物礦化的程度(茜素紅S[AR])與該分析中的DNA含量有關。數值表示來自10個單獨實驗中各實驗的平均值(±SD)。N,O-CMC-polyP基質顯著增加了礦化作用；*P<0.01。圖5顯示了殼聚糖polyP復合體(“殼聚糖+polyP”)、N,O-CMC水凝膠(“N,O-CMChg”)和N,O-CMC層減去polyP(“N,O-CMC層-polyP”)和加上polyP(“N,O-CMC層+polyP”)對于血液凝固速率的影響。在對照中添加了未處理的殼聚糖。測定了來自細胞溶解的未凝固紅細胞的血紅蛋白的吸光度。與殼聚糖對照進行顯著性比較；*p<0.05。實施例在以下實施例中，僅描述了采用N,O-CMC-polyP膜、層和組織樣塊的本發明的方法。然而，本發明方法也可采用O-羧甲基殼聚糖(O-CMC)和N-羧甲基殼聚糖(N-CMC)以及除40個磷酸鹽單元鏈長以外的polyP分子進行應用，本領域技術人員應該能夠根據相應的描述調整該方法。N,O-CMC-聚磷酸鹽膜、層和組織樣塊的制備如在“方法”部分中所述制備N,O-CMC-polyP。將N,O-CMC與Na-polyP混合；然后將這兩種聚合物通過Ca2+離子橋連接在一起。通過EDX光譜學針對磷的存在對所述膜、層或組織樣塊進行分析。作為示例，給出了無Na-polyP和有Na-polyP所制備的膜的EDX光譜(圖2AandB)。分析該膜的表面。所述光譜顯示，在Na-polyP存在下形成，然后通過Ca2+連接至N,O-CMC聚合物的膜顯示了磷和鈣的信號(圖2D)，而在無polyP存在下形成的膜中沒有那些信號(圖2C)。N,O-CMC-聚磷酸鹽層和組織樣塊的打印采用以上描述的設置，打印兩層或六層并用于體外分析。在圖1B和C中顯示了用于體外研究的兩層襯墊。該圓筒的網眼大小為≈0.5x0.5mm。可通過增加層數來增加這些層的厚度。圖2D顯示了六層的墊。進一步增加分層，形成了組織樣塊(圖1E)。此處，通過μCT分析了該損傷后，本發明人打印了豬下頜中的顱骨缺損。在細胞培養中分析的N,O-CMC-polyP層打印的兩層支架用于細胞培養實驗。如果打印了來自無任何polyP的N,O-CMC層的樣品，則該圓筒在培養基中融合(圖3A)。相反，如果該待打印的材料補充有polyP，即N,O-CMC-polyP，則該圓筒保持為分離的(圖1B和D)。甚至，在兩層之間形成了連續的接觸網眼下，該交叉的圓筒僅在貼近的最初交叉點融合(圖3B和C)。該打印的圓筒之間明顯的交叉點為細胞的滲透留出了空間(圖3D)。甚至在該網狀組織經歷5天的孵育期后還保持完整(圖3D)。N,O-CMC-polyP材料的機械性能利用硬度計壓頭裝置并在玻璃箍頂部采用懸臂測量了N,O-CMC-polyP支架的硬度。測量了厚度為2mm的6層支架樣品。將打印后立即獲得的樣品浸沒于生理鹽水中，并采用降低的楊氏模量[RedYM]作為參數測試其硬度。如果對那些樣品即N,O-CMC-polyP進行分析，則測定出機械RedYM剛度為935±128kPa(n＝10)；相比之下，測定的不含polyP的支架樣品的剛度僅為27±3kPa。相比之下，采用相同的設置，發現來自兔組織的松質骨的模量為2,300kPa。將該N,O-CMC-polyP支架樣品浸沒于模擬體液(KokuboT.Bioactiveglassceramics:propertiesandapplications.Biomaterials1991；12:155-163)中，在3周期間其RedYM剛度沒有發生顯著變化；數值為約900±115kPa；僅在6周后測得其顯著降低為686±102kPa。SaOS-2細胞在N,O-CMC基質上的礦化測試本文制備的無polyP和含有polyP的N,O-CMC基質，以及(相比較的)此前已公開的被稱為N,O-CMC水凝膠的殼聚糖制劑(ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；LuoY,TengZ,WangX,WangQ.Developmentofcarboxymethylchitosanhydrogelbeadsinalcohol-aqueousbinarysolventfornutrientdeliveryapplications.FoodHydrocolloids2013a；31:332-339)誘導SaOS-2細胞生物礦化的效能。在補充有OC的培養基/FCS中經歷3天的初始孵育期后，轉移所述細胞。如圖4所示，相比不含polyP的N,O-CMC基質，含有結合N,O-CMC的聚合的polyP的N,O-CMC-polyP導致了顯著更高的細胞礦化的誘導(第8天，0.93±0.09nmoles結合細胞的茜素紅S[基于μgDNA])。這同樣適用于已公開的N,O-CMC水凝膠基質(0.38±0.04nmoles/μg)，以及本文制備的基質(0.46±0.06nmoles/μg)。在沒有任何殼聚糖基質下，礦化程度為0.38±0.07nmoles/μg(圖4中未示出)。在沒有OC下礦化水平低至約0.20±0.03nmoles/μg。N,O-CMC-polyP對血液凝固動力學的影響已知PolyP促進血塊形成(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)，并也可逆轉血友病患者中的抗凝作用和流血事件(SmithSA,MorrisseyJH.Polyphosphateasageneralprocoagulantagent.JThrombHaemost2008；6:1750-1756)。此處本發明人依次測量了不同基質對體外人血液凝固時間的影響。用全血與類似量的基質接觸來進行測定，在接觸10min的時段后，基于血紅蛋白含量來測量懸浮液中剩余的紅細胞(圖5)。很明顯，不含polyP的那些樣品(“殼聚糖對照”、“N,O-CMC水凝膠”[ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；LuoY,TengZ,WangX,WangQ.Developmentofcarboxymethylchitosanhydrogelbeadsinalcohol-aqueousbinarysolventfornutrientdeliveryapplications.FoodHydrocolloids2013a；31:332-339]，以及本文制備的減去polyP的N,O-CMC層，即“N,O-CMC層-polyP”)沒有顯著改變作為游離紅細胞數目的量度的血紅蛋白濃度。然而，本發明制備的N,O-CMC層加上polyP“N,O-CMC層+polyP”，以及含有polyP的殼聚糖聚電解質復合物(PEC)“殼聚糖+polyP”顯著降低了游離紅細胞的數目，相反增加了結合基質的紅細胞數目。比較這兩種樣品，相比殼聚糖+polyP-PEC樣品，polyP通過Ca2+連接至N,O-CMC聚合物顯著降低了游離紅細胞的數目(0.43±0.07相對于0.85±0.12)(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107；OngSY,WuJ,MoochhalaSM,TanMH,LuJ.Developmentofachitosan-basedwounddressingwithimprovedhemostaticandantimicrobialproperties.Biomaterials2008；29:4323-4332)。本發明人的發現：相比公開的殼聚糖+polyP-PEC復合體，polyP通過Ca2+連接至N,O-CMC聚合物導致明顯更大地降低了紅細胞數目(增加了凝固時間)(圖5)是出人意料的，尤其是因為此前沒有描述過polyP對于血液凝固的作用需要polyP與鈣離子形成復合體或鹽。polyP對于凝固時間的影響看來是由非鈣依賴性機制介導的(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH(2006)Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA103:903-908)。此外，令人驚奇的是，作為鈣復合體/鹽的polyP甚至在結合N,O-CMC聚合物后還具有生物學活性。以下實施例顯示如果使用polyP通過Ca2+連接至N-羧甲基化的殼聚糖(N-CMC-polyP)或者polyP通過Ca2+連接至O-羧甲基化的殼聚糖(O-CMC-polyP)代替N,O-CMC-polyP，則也可以應用本發明所述的方法。N-CMC-polyP和O-CMC-polyP對SaOS-2細胞礦化的影響概述于表1。相比公開的殼聚糖polyP復合體，這兩種制劑均顯示出對礦化作用顯著更高的影響(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107)。然而，它們均不如N,O-CMC-polyP有效。這些數據出人意料地顯示，相比其他連接，通過Ca2+-連接將polyP連接至N,O-CMC、N-CMC、或O-CMC具有顯著更高的生物礦化效能。表1.殼聚糖polyP復合體(“殼聚糖+polyP”)，和N,O-CMC層減去polyP(“N,O-CMC層-polyP”)、N-CMC層減去polyP(“N-CMC層-polyP”)、O-CMC層減去polyP(“O-CMC層-polyP”)，以及N,O-CMC層加上polyP(“N,O-CMC層+polyP”)、N-CMC層加上polyP(“N-CMC層+polyP”),O-CMC層加上polyP(“O-CMC層+polyP”)對SaOS-2細胞礦化的影響。所述細胞在沒有OC(對照)或含有OC(其他分析)下生長。生物礦化的程度(茜素紅S[AR])與DNA含量有關。孵育期為8天。樣品AR(nmoles/μgDNA)對照0.21±0.03殼聚糖+polyP0.38±0.04N,O-CMC層-polyP0.46±0.06N-CMC層-polyP0.42±0.10O-CMC層-polyP0.40±0.09N,O-CMC層+polyP0.93±0.09N-CMC層+polyP0.80±0.11O-CMC層+polyP0.77±0.10N-CMC-polyP和O-CMC-polyP對血液凝固動力學的影響概述于表2。相比公開的殼聚糖polyP復合體，這兩種制劑，如N,O-CMC-polyP，均導致對血液凝固速率有顯著更高的影響(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107)，但都不如N,O-CMC-polyP有效。表2.殼聚糖polyP復合體(“殼聚糖+polyP”)，N,O-CMC水凝膠(“N,O-CMChg”)、N-CMC水凝膠(“N-CMChg”)、O-CMC水凝膠(“O-CMChg”)，和N,O-CMC層減去polyP(“N,O-CMC層-polyP”)、N-CMC層減去polyP(“N-CMC層-polyP”)、O-CMC層減去polyP(“O-CMC層-polyP”)，以及N,O-CMC層加上polyP(“N,O-CMC層+polyP”)、N-CMC層加上polyP(“N-CMC層+polyP”)、O-CMC層加上polyP(“O-CMC層+polyP”)對血液凝固速率的影響。對照中添加有未處理的殼聚糖。測定了來自細胞溶解的非凝集紅細胞的血紅蛋白吸光度。樣品血紅蛋白吸光度(OD540)對照1.42±0.13殼聚糖+polyP0.85±0.12N,O-CMChg1.29±0.15N-CMChg1.40±0.21O-CMChg1.33±0.17N,O-CMC層-polyP1.47±0.17N-CMC層-polyP1.51±0.20O-CMC層-polyP1.41±0.20N,O-CMC層+polyP0.43±0.07N-CMC層+polyP0.61±0.11O-CMC層+polyP0.58±0.08方法聚磷酸鹽用于實施例中的聚磷酸鈉(Na-polyP的平均鏈長為40個磷酸鹽單元)獲自ChemischeFabrikBudenheim(Budenheim；Germany)。N,O-羧甲基殼聚糖的制備可根據最新技術的程序，由殼聚糖制備N,O-羧甲基殼聚糖(N,O-CMC)(ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；ChenSC,WuYC,MiFL,LinYH,YuLC,SungHW.AnovelpH-sensitivehydrogelcomposedofN,O-carboxymethylchitosanandalginatecross-linkedbygenipinforproteindrugdelivery.JControlRelease2004；96:285-300；SakairiN,SuzukiS,UenoK,HanSM,NishiN,TokuraS.Biosynthesisofhetero-polysaccharidesbyAcetobacterxylinum-synthesisandcharacterizationofmetal-ionadsorptivepropertiesofpartiallycarboxmethylatedcellulose.CarbohydratePolymers1998；37:409-414)。簡而言之，將10g殼聚糖(例如，來自蝦殼，≥75％(脫乙酰化)[脫乙酰化甲殼質])添加至含有14.1gNaOH的水:異丙醇混合物(20ml:40ml)中，并在溫和攪拌下于室溫保持1小時。然后，將溶解于20ml異丙醇的15g一氯醋酸滴加至該混合物中。將該反應混合物加熱至50℃，并持續攪拌4h。然后將該材料過濾，并用80％乙醇洗滌3次。于60℃烘箱中過夜干燥所得的固體以獲得N,O-CMC的Na鹽。為轉變為N,O-CMC的H-形式，將所得的粉末懸浮于100ml的80％乙醇水溶液中。然后，加入10ml鹽酸(37％)并攪拌30min。最后，過濾該懸浮液，并用乙醇洗滌直至獲得中性pH；于60℃過夜干燥該材料(SakairiN,SuzukiS,UenoK,HanSM,NishiN,TokuraS.Biosynthesisofhetero-polysaccharidesbyAcetobacterxylinum-synthesisandcharacterizationofmetal-ionadsorptivepropertiesofpartiallycarboxmethylatedcellulose.CarbohydratePolymers1998；37:409-414)。圖1A給出了該反應的示意圖。在衰減全反射(ATR)模式中采用傅里葉變換紅外(FTIR)光譜，以確保在殼聚糖的氨基以及伯羥基位點的羧甲基的置換(FTIR-ATR；配備有GoldenGateATR附件的Varian660-IR光譜儀)(ChenSC,WuYC,MiFL,LinYH,YuLC,SungHW.AnovelpH-sensitivehydrogelcomposedofN,O-carboxymethylchitosanandalginatecross-linkedbygenipinforproteindrugdelivery.JControlRelease2004；96:285-300)。將干燥的樣品粉末直接放置于ATR晶體上。于4000-750cm-1波數以4cm-1分辨率獲得該光譜。O-羧甲基殼聚糖的制備采用最新技術程序，可以在異丙醇/NaOH溶液中使一氯醋酸與殼聚糖反應來制備O-羧甲基殼聚糖(O-CMC)(例如UpadhyayaL,SinghJ,AgarwalV,TewariRP.Biomedicalapplicationsofcarboxymethylchitosans.CarbohydrPolym2013；91:452-466)。N-羧甲基殼聚糖的制備通過使殼聚糖的游離氨基與水合乙醛酸反應，隨后用硼氫化鈉還原所得的醛亞胺，可獲得N-羧甲基殼聚糖(N-CMC)，如(例如，UpadhyayaL,SinghJ,AgarwalV,TewariRP.Biomedicalapplicationsofcarboxymethylchitosans.CarbohydrPolym2013；91:452-466)所描述的。N,O-CMC-聚磷酸鹽層和組織樣塊的打印例如，通過紫外線照射(254nm)過夜來對N,O-CMC滅菌。然后在生理鹽水中制備60mg/ml的N,O-CMC溶液。在攪拌至均勻后，向該凝膠中補充固體Na-polyP直至濃度達到20mg/ml。用60mg/ml海藻酸鈉(例如，來自Sigma-Aldrich的W201502)完成該水凝膠制劑的形成，并于50℃攪拌至均勻。然后將該水凝膠灌注至無菌的打印盒中(例如，來自NordsonEFD的30ml打印盒)，以1500rpm離心3min從而去除剩余氣泡。連接上0.25mm錐形聚乙烯打印頭(NordsonEFD)后，將打印盒放入預熱的(25℃)3D-bioplotter打印頭中；例如，可使用來自Envisiontec的第4代支架(blotter)3D-Bioplotter。按所述程序進行生物打印(NeufurthM,WangXH,HC,FengQL,Diehl-SeifertB,ZiebartT,SteffenR,WangSFandMüllerWEG.Engineeringamorphogeneticallyactivehydrogelforbioprintingofbioartificialtissuederivedfromhumanosteoblast-likeSaOS-2cells.Biomaterials2014；DOI:10.1016/j.biomaterials.2014.07.002；inpress)。由60mg/mlN,O-CMC、60mg/ml藻酸鹽和20mg/mlNa-polyP組成的打印溶液是在25℃采用1.4bar壓力和18mm/s打印速度制備的。將預流量設置為0.15s，而后流量設置為-0.05s。如所描述，設計了測量為50x0.4mm的圓柱形支架，將其切成薄片并轉移至打印機軟件(NeufurthM,WangXH,HC,FengQL,Diehl-SeifertB,ZiebartT,SteffenR,WangSFandMüllerWEG.Engineeringamorphogeneticallyactivehydrogelforbioprintingofbioartificialtissuederivedfromhumanosteoblast-likeSaOS-2cells.Biomaterials2014；DOI:10.1016/j.biomaterials.2014.07.002；inpress)。打印的圓筒之間鑄流間距(stranddistance)設置為1mm，產生了約0.5x0.5mm的打印的層/塊的孔徑。那些支架，層/塊被直接打印到無菌的94mm皮氏培養皿中，其補充有1％[w/v]CaCl2作為交聯溶液(SchloβmacherU,HC,WangXH,FengQ,Diehl-SeifertB,NeumannS,TrautweinA,MüllerWEG.Alginate/silicacompositehydrogelasapotentialmorphogeneticallyactivescaffoldforthree-dimensionaltissueengineering.RSCAdvances2013；3:11185-11194)。約2min孵育期后，瀝干CaCl2-溶液，將產生的交聯支架用蒸餾水洗滌兩次，并用70％的乙醇洗滌一次。打印直徑5cm的兩層支架耗時約6min。用于細胞培養實驗的支架樣品的大小為20mm[直徑]x0.4mm[厚度]。在實例中，通過微斷層攝影[μCT]，分析顱骨缺損(在選擇豬下頜的情況下)后打印了組織樣塊。采用BioplotterRP2.9CAD軟件(Envisiontec)計算機程序預先確定待打印的植入物大小。采用相同的軟件，將該圓筒隨后切片為與打印針的直徑相對應的單個層，隨后轉移至VisualMachines3.0.193打印機軟件(Envisiontec)。N,O-CMC水凝膠層和N,O-CMC-polyP-PEC的制備如(ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；LuoY,TengZ,WangX,WangQ.Developmentofcarboxymethylchitosanhydrogelbeadsinalcohol-aqueousbinarysolventfornutrientdeliveryapplications.FoodHydrocolloids2013a；31:332-339；LuoY,WuC,LodeA,GelinskyM.Hierarchicalmesoporousbioactiveglass/alginatecompositescaffoldsfabricatedbythree-dimensionalplottingforbonetissueengineering.Biofabrication2013b；5:015005；doi:10.1088/1758-5082/5/1/015005)所描述的，制備N,O-CMC水凝膠。將制備的固體材料分層放置于皮氏培養皿(被稱為“N,O-CMC水凝膠”)。如(OngSY,WuJ,MoochhalaSM,TanMH,LuJ.Developmentofachitosan-basedwounddressingwithimprovedhemostaticandantimicrobialproperties.Biomaterials2008；29:4323-4332)所描述的，由殼聚糖粉末(60mg/ml)和Na-polyP(20mg/ml)制備聚電解質復合物(PEC)(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-107)。該樣品被稱為“殼聚糖-polyP”。掃描電子顯微鏡檢查法和能量色散X-射線光譜學將掃描電子顯微鏡(SEM；HITACHISU8000)與XFlash5010檢測器連接，所述XFlash5010檢測器為允許同時進行基于能量色散的X-射線(EDX)元素分析的X-射線檢測器。以4kV電壓連接至用于元素分析的XFlash5010檢測器。如所描述，收集HyperMap數據庫(SalgeT,TerborgR.EDSmicroanalysiswiththesilicondriftdetector(CDD):innovativeanalysisoptionsformineralogicalandmaterialscienceapplication.AnadoluUnivJSciTechnol2009；10:45-55)。測定N,O-CMC-polyP支架的硬度如(ChavanD,AndresD,IannuzziD.Note:ferrule-topatomicforcemicroscope.II.Imagingintappingmodeandatlowtemperature.RevSciInstrum.Apr2011；82(4):046107；doi:10.1063/1.3579496；ChavanD,vandeWateringTC,GrucaG,RectorJH,HeeckK,SlamanM,IannuzziD.Ferrule-topnanoindenter:anoptomechanicalfibersensorfornanoindentation.RevSciInstrum2012；83:115110；doi:10.1063/1.4766959)所描述的，例如，通過基于箍狀光纖的納米壓痕儀可測定支架硬度。缺口為深度可控的(10μm)，并將加載和卸載周期設置為2s。基于荷載位移曲線計算降低的楊氏模量[RedYM]。光學顯微鏡分析例如，可采用配備有VH-Z25變焦鏡頭的VHX-600數字顯微鏡(Keyence)，進行數字光學顯微研究。體外細胞在殼聚糖基質上的礦化例如，可使用人成骨肉瘤細胞，即SaOS-2細胞。在潮濕培養箱中于37℃和5％CO2下將所述細胞培養于McCoy的培養基中(WiensM,WangXH,HC,KolbU,SchloβmacherU,UshijimaH,MüllerWEG.Theroleofbiosilicaintheosteoprotegerin/RANKLratioinhumanosteoblast-likecells.Biomaterials2010a；31:7716-7725)。每3d更換培養基/胎牛血清[FCS]。在提及的情況下，將所述細胞暴露于含10nM地塞米松、5mMβ-甘油磷酸鹽/酯和50mM抗壞血酸的成骨混合物[OC]中。將支架樣品20mm[直徑]x0.4mm[厚度]放置于24–孔板底部。例如，可通過茜素紅S分析和分光光度法測量礦化的程度(WiensM,WangXH,SchloβmacherU,LieberwirthI,GlasserG,UshijimaH,etal.Osteogenicpotentialofbio-silicaonhumanosteoblast-like(SaOS-2)cells.CalcifTissueIntern2010b；87:513-524)。測量之前，從40-孔板移除殼聚糖基質。結合的茜素紅S的量以nmoles表示，并與所述樣品中的總DNA有關。血液凝固時間的影響含有polyP和不含polyP的N,O-CMC基質對血液凝固時間的影響，例如，可通過如(ShihMF,ShauMD,ChangMY,ChiouSK,ChangJK,CherngJY.Plateletadsorptionandhemolyticpropertiesofliquidcrystal/compositepolymers.IntJPharm2006；327:117-125)所描述的分析來測定。將樣品(100至150mg)浸沒到置于37℃的恒溫水浴中的瓶子中持續10min。然后，將300μl人血樣品(含有20μl/ml100mMCaCl2的檸檬酸葡萄糖)滴加至所述基質的表面，直至將其完全覆蓋。然后，該分析繼續孵育(37℃)持續10min。接著，加入15ml蒸餾水但不干擾凝固的血液。隨后，取出10ml小份，離心(100×g；30s)，收集上清液，并于542nm用分光光度法進行凝血測試。統計學分析結果可采用配對學生t-檢測進行統計學評估。當前第1頁1 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