小尺寸干細胞的毛發生長促進功能及其用途的制作方法

本發明涉及用于預防脫發和刺激毛發生長的組合物、其制造方法及其用途，所述組合物含有小尺寸干細胞(特別是直徑為8μm以下的小尺寸干細胞)或其條件培養基作為活性成分。本發明涉及該組合物的用途，所述組合物利用直徑為8μm以下的小尺寸干細胞的毛發生長刺激功能來顯著增加處于休止期的毛囊干細胞的活性。

背景技術：

隨著工業發展、環境污染、壓力、老齡化的進行，禿頭癥(Alopecia)或頭發稀疏已逐漸顯現，并且在福利時代，對生活質量和外觀的關注日益增加。

禿頭癥(頭發從頭皮脫落)由于各種原因而發生，例如內在誘因(如遺傳組成和雄性激素的作用)；日常生活中的精神壓力；以及外部誘因(如頭皮中的脂質過氧化物的積累)。已知脫發癥狀由非常復雜的過程引起。

光禿并不意味著通過掉落而缺少毛發，而是毛發逐漸稀疏，而且變成更細和更軟的毛發，并且隨著光禿的發展，毛發根部中的真皮乳頭更小。隨著真皮乳頭更小，毛發更加稀疏，毛發周期更短，而且新生長的毛發進一步變得更稀疏。當光禿不斷發展時，毛發更軟，毛發周期進一步更短，且毛發生長一點而隨后掉落。另外，還關注了已知由自身免疫性疾病所引起的斑禿，以及在軀體或精神的壓力(例如內分泌疾病)、營養缺乏、藥物或分娩后而發生的暫時性脫發。

最近，脫發(包括男性型脫發和女性的肥胖性脫發)正在年輕一代中逐漸增多。根據由韓國國民健康保險公司的健康福利政策研究所在2009年發布的消息，2008年的國內脫發患者的數量與2001年相比增加了60％以上，并且兒童和青少年脫發患者的數量從2006年的21,643例增加至2011年的23,025例，5年增加了約6.4％。

為了改善這種脫發，多種類型的毛發生長液是在商業上可得的。目前，根據Economy 21的研究，韓國的毛發護理服務市場規模的80％為化妝品和衛生用品，20％為藥物，其中，去醫院的脫發患者的數量僅為5％。目前，護發產品的使用者中的不滿意者為72.7％。然而，僅有通過美國食品與藥品監督管理局(FDA)批準的兩種藥物，例如在1998年(約15年前)公布的米諾地爾(minoxidil)和非那司提(finasteride)，因此，僅用這兩種藥物不能完全治愈各種原因的禿頭癥。特別地，由制成的是防脫發制劑，而不是毛發生長液。阻斷5-α還原酶以抑制DHT的產生，并盡可能長地延緩男性型脫發。

由于市場上的毛發生長液(例如和)具有由激素藥物的應用所引起的副作用，并僅對其中發根被激活的部分有效，它們在預防脫發中有效，但對處于長期休止期的毛發的生長沒有顯著效果，而且必須連續給予或施用。因此，有必要開發用于禿頭癥或頭發稀疏的經濟且穩定的技術。在韓國，相比發達國家，用于禿頭癥的藥物的研發在技術上不足，涉及預防脫發、刺激毛發生長和毛發再生的研發是非常迫切的問題。然而，關于涉及脫發的研究，自1950年以來已經報道了涉及發根和毛發再生的文獻，但由于缺乏再現性，在過去的50年中毛發再生被認為是不可能的。

然而，賓夕法尼亞大學醫學院的Costarelis教授在1990年首次發現了毛囊干細胞(Cell，1990)，首次分離了人來源的毛囊干細胞(J.Clin.Invest，2006)，并報道了再生毛囊(其過去是不可能實現的)的可能性的結果(Nature，2007)，因此開辟了研究禿發的根本性治愈的可能性。

最近，正在開發使用基因治療禿頭癥的方法以及使用干細胞治療禿頭癥的方法。作為本發明的背景技術，在韓國專利號10-0771171(2007年10月29日)中公開了分離和增殖毛囊干細胞并將干細胞分化成毛囊細胞的方法以及用于治療脫發的組合物，在韓國專利公開號10-2008-0097593(2008年11月06日)中公開了通過將脂肪來源的干細胞和毛囊細胞適當地混合而制造的細胞治療產物。另外，在韓國專利號10-1218101(2013年1月3日)中公開了用于刺激毛發生長或預防脫發的組合物，該組合物含有羊水中的胎兒間充質干細胞的條件培養基作為活性成分。

然而，鑒于小尺寸干細胞的特定功效，尚未報道展示出色作用的用于刺激毛發生長或預防脫發的組合物。

因此，在培養間充質干細胞時，本發明人確認通常收集的各種尺寸的細胞，并基于取決于細胞尺寸的作用的可能性，根據來源于各種組織的間充質干細胞的尺寸，通過比較由毛囊干細胞的激活所引起的刺激毛發生長的能力，發現了具有特定尺寸的直徑或更小直徑的干細胞展示出非常出色的刺激毛發生長的作用，從而完成了本發明。

現有技術文獻

專利文獻

1.韓國專利號10-0771171(2007年10月29日)

2.韓國專利號10-1422559(2014年7月17日)

3.韓國專利申請公開號10-2013-0009117(2013年1月23日)

4.韓國專利申請公開號10-2014-0125735(2014年10月29日)

5.韓國專利申請公開號10-2008-0097593(2008年11月6日)

6.韓國專利號10-1218101(2013年1月3日)

非專利文獻

1.BY Yoo，YK Seo，JK Park等，Effect of Mesenchymal Cells on Human Hair Growth and Death，Korean J.Chem.Eng.，25(2)，295(2008)。

2.VA Botchkarev，J Kishimoto，Molecular control of epithelialmesenchymal interactions during hair follicle cycling，J.Invest Dermatol.Symp.Proc.，8(1)，46(2003)。

3.D Fiszer，M Kurpisz，T Siminiak，Stem cell therapy as the reinforcement of organ regeneration，Artif.Organs.，29(5)，366(2005)。

4.H Oshima，A Rochat，C Kedzia，Y Barrandon等，Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells，Cell，104(2)，233(2001)。

5.KS Stenn，G Cotsarelis，Bioengineering the hair follicle：fringe benefits of stem cell technology，Curr Opin.Biotechnol.，16(5)，493(2005)。

6.S Tiede，JE Kloepper，E Bodo等，Hair follicle stem cells：Walking the maze，Eur.J.Cell Biol.，86(7)，355(2007)。

7.K Kataoka，RJ Medina，T Kageyama等，Participation of adult mouse bone marrow cells in reconstitution of skin，Am.J.Pathol.，163(4)，1227(2003)。

8.C Blanpain，WE Lowry，A Geoghegan等，Self-renewal,multipotency and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche，Cell，118(5)，635(2004)。

9.MJ Hoogduijn，E Gorjup，PG Genever，Comparative characterization of hair follicle dermal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells，Stem Cells Dev.，15(1)，49(2006)。

在整個申請文件中，參考了許多論文和專利，并且陳述了其引用。將所引用的論文和專利文獻中公開的內容以其整體通過引用的方式并入本文，從而對本發明所屬的技術領域的水平和本發明的內容進行更清楚地解釋。

技術實現要素：

技術問題

本發明使用具有非常出色的毛發生長刺激功能的一定尺寸的干細胞(刺激毛囊干細胞的活性)，并旨在提供用于預防脫發和刺激毛發生長的組合物，所述組合物含有直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分。

本發明還旨在提供使用所述組合物來預防脫發和刺激毛發生長的方法。

技術方案

為了解決上述問題，本發明提供了具有刺激毛發生長功能的小尺寸直徑的干細胞及其各種用途。

作為本發明的示例性實施方式，提供了用于預防脫發和刺激毛發生長的組合物，所述組合物含有直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分。

由于直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基具有激活毛囊干細胞的功能，因此獲得了預防脫發和刺激毛發生長的作用，更特別地，具有以下作用：(i)減少用于將毛發周期中的休止期轉變至生長期的時間；(ii)使毛發周期調節正常化；以及(iii)增加真皮乳頭細胞的產生。

在本文中，直徑為8μm以下的小尺寸干細胞可以是選自于由以下所組成的組中的至少一種類型的干細胞：骨髓來源的人成體干細胞、臍帶血來源的人成體干細胞、脂肪來源的人成體干細胞、血液來源的人成體干細胞、肝臟和腸來源的人成體干細胞、皮膚來源的人成體干細胞、胃腸道來源的人成體干細胞、胎盤來源的人成體干細胞、神經來源的人成體干細胞、腎上腺來源的人成體干細胞、上皮來源的人成體干細胞和子宮來源的人成體干細胞以及胚胎干細胞；優選骨髓來源的成體干細胞、臍帶血來源的成體干細胞或脂肪來源的成體干細胞；更優選臍帶血來源的成體干細胞；最優選臍帶血來源的間充質干細胞。此外，最優選使用人來源的臍帶血。

另外，條件培養基可以是作為基礎培養基適用于動物細胞生長的任何培養基，作為非限制性實例可以使用MEM(最低必需培養基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培養基)或K-SFM(角質形成細胞-無血清培養基)。優選地，使用α-MEM培養基。

可通過以藥物組合物或化妝品組合物的形式制備來提供所述組合物。

同時，在本發明的另一示例性實施方式中，提供了使用用于預防脫發和刺激毛發生長的組合物的方法，所述組合物含有直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分。

在本發明的另一示例性實施方式中，還提供了使用直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分來治療脫發的方法。

在上述方法中，最優選使用注射通過經皮給予來給予干細胞或其組合物。在本文中，通過將注射器針眼朝上放置將組合物給予到靶標的真皮中的方式，有效地進行注射。

因此，本發明是基于以下發現完成的：與其中混合了各種尺寸的干細胞的常規的異種細胞(heterogeneous cell)相比，直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基對于預防脫發和刺激毛發生長的作用而言具有最出色的能力；并且本發明提供了直徑為8μm以下的小尺寸干細胞根據毛囊干細胞的激活來預防脫發并刺激毛發生長的出色作用及其各種用途。

將本文所使用的術語進行如下定義。

“刺激毛發生長”或“預防脫發”具有相似的含義，并且包括本領域中使用的另外的術語，例如刺激生發或毛發生長以及預防毛發劣化或脫發。

“干細胞”意為可以發育成任何組織的細胞。存在兩個基礎特征：通過重復分裂產生自我的自我更新；以及根據環境而分化成具有特定功能的細胞的多潛能性。

“間充質干細胞”是分離自人或哺乳動物組織且可來源于各種組織的一類未分化的成體干細胞。在成體干細胞中，造血干細胞通常是非粘附的，但是間充質干細胞通常是粘附的。特別地，間充質干細胞可以是臍帶來源的間充質干細胞、臍帶血來源的間充質干細胞、骨髓來源的間充質干細胞、脂肪來源的間充質干細胞、肌肉來源的間充質干細胞、神經來源的間充質干細胞、皮膚來源的間充質干細胞、羊膜來源的間充質干細胞或胎盤來源的間充質干細胞，并且優選臍帶血來源的間充質干細胞。從各組織中分離干細胞的技術是本領域已知的。

“干細胞的條件培養基”是包含通過培養干細胞獲得的培養基中含有的成分的物質，并且可不受限制地將任何類型的干細胞用于制備條件培養基。例如，用于制備條件培養基的干細胞可以是胚胎干細胞或成體干細胞。此外，成體干細胞可以來源于每種組織。在本發明的示例性實施方式中，使用臍帶血來源的成體干細胞來制備條件培養基。

“分化”意為細胞的結構或功能在分裂、增殖和生長時特化的現象，即為了執行本職工作，生物體的組織或細胞的形態或功能方面的變化。通常，其是將相對簡單的系統分化為至少兩個的不同性質的部分系統的現象。

術語細胞的“增殖”或“生長”是指同種細胞通過分裂進行的擴增，即通常在多細胞生物體中的細胞數量的增加。當細胞的數量通過增殖(擴增)達到一定水平時，特征通常變化(分化)并同時受到控制。

“培養基”意為用于使細胞在生物體外生長和增殖的混合物，包含細胞的生長和增殖中所使用的必要因素，例如糖、氨基酸、各種類型的營養物、血清、生長因子和礦物質。特別地，本發明的培養基是用于干細胞的生長和增殖的培養基。

“基礎培養基”是含有細胞存活所需的必要的糖、氨基酸、水等的混合物，而且所述混合物不包含營養物質和各種類型生長因子。本發明的基礎培養基可以使用人工合成的培養基或商業上制備的培養基。商業上制備的培養基可以是但不限于例如DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基)、EDM(內皮細胞分化培養基)、MEM(最低必需培養基)、BME(基礎培養基Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-最低必需培養基)、G-MEM(Glasgow最低必需培養基)或Iscove改良的Dulbecco培養基。

“治療”意為獲得有益或示例性的臨床結果的方法。對于本發明的目的，有益或示例性的結果非限制性地包括可檢測或不可檢測的癥狀的緩解、疾病范圍的縮小、疾病狀態的穩定(即不惡化)、疾病進展的延緩或疾病進展速度的降低、疾病狀態(部分或全部地)的改善或暫時緩解和減弱。“治療”表示所有的治療性處理和預防性或防治性方法。治療包括可預防傷殘和已經發生的傷殘所需的治療。疾病的“緩解(palliation/palliating)”意為非示例性臨床癥狀和/或疾病狀態范圍減低和/或疾病的進展時程延緩或延長。

“有效量”是影響有益或示例性的臨床結果或生化結果的合適的量。有效量可以一次給予或多次給予。有效量是暫時緩解、改善、穩定、恢復或延緩疾病進展的合適的量。在本發明中，有效量是適于減慢或延緩脫發進展或者刺激毛發生長的量。如果給定的動物耐受組合物的給予，或者該組合物適合給予動物，則意味著該組合物是“藥學上或生理學上可用的”。當待給予的組合物的量在生理學上重要時，可以說制劑以“治療學上有效量”給予。當制劑的存在在給定的患者中引起生理學上可檢測的變化時，該制劑是生理上有意義的。

術語“約”表示參比的量、水平、值、數量、頻次、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

在整個申請文件中，除非上下文另有需要，應當理解的是，“包括/包含/含有(include和/或including以及comprise和/或comprising)”明確說明步驟或元素或者步驟或元素的組的存在，但不排除一個或多個其它步驟或元素或者其它步驟或元素的組的存在或添加。

在下文中，將對本發明進行詳細描述。

干細胞

本發明涉及具有小尺寸直徑的干細胞預防脫發和刺激毛發生長的用途。

干細胞是具有自我更新能力以及分化成至少兩種細胞的能力的細胞。根據來源，可以使用胚胎干細胞或成體干細胞，且在本發明中，優選可以使用來源于各種組織(來自各種來源)的成體干細胞，例如來源于諸如脂肪、子宮、骨髓、肌肉、胎盤、臍帶血或表皮的組織的干細胞。更特別地，干細胞是間充質干細胞(MSC)。間充質干細胞通常是有助于造血作用的基質，并且具有分化成各種中胚層細胞(包括骨骼細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞)的能力，并且容易增殖且同時保持未分化的狀態。在本發明的一個示例性實施方式中，使用脂肪來源的間充質干細胞、骨髓來源的間充質干細胞和臍帶血來源的間充質干細胞(MSC)。

最優選地，使用臍帶血來源的間充質干細胞。

臍帶血是出生后產生自臍帶的血液，含有大量的形成白細胞、紅細胞和血小板的造血干細胞以及內皮祖細胞，而且還含有形成軟骨、骨骼、肌肉、神經的間充質干細胞，因此，其在醫學領域具有極高的價值。相比于骨髓或外周血液中的造血干細胞，臍帶血具有更高濃度的造血干細胞而且成熟度更低。因此，相比于骨髓中發現的造血干細胞，臍帶血中的造血干細胞展現出更出色的增殖能力、自我更新能力和分化能力。另外，臍帶血可以通過簡單的醫療程序從丟棄的臍帶中獲得，并且由于臍帶含有比起給定的量更多的造血干細胞和干細胞，因此在本發明的一個方面，使用分離自人臍帶血的間充質干細胞(hUCB-MSC)。

特別地，臍帶血來源的間充質干細胞：(i)當用于細胞治療產品時，與其它組織來源的干細胞不同，其可大部分避免免疫排斥；(ii)其可獲取自通常丟棄的胎盤和臍帶，并因而當產生干細胞時，供體不會有任何病痛；以及(iii)當施用時，可以直接給予至病變。在本文中，當將該干細胞實際移植至相應病變時，旁分泌效應被激活，并分泌能夠治療、復原或恢復病變的分泌因子(蛋白質、細胞因子)，從而治愈病變。

同時，可以通過本領域已知的方法來增殖和培養本發明所述的干細胞。

合適的培養基可以是開發用于培養動物細胞(特別是哺乳動物細胞)的任何培養基，或者是可在體外制備的具有動物細胞生長所需的合適組分(例如可吸收的碳、氮和/或痕量營養物)的任何培養基。

培養基可以是適合于動物細胞生長的任何基礎培養基，并且作為非限制性實例，通常可使用以下作為用于培養細胞的基礎培養基：MEM(最低必需培養基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培養基)或K-SFM(角質形成細胞-無血清培養基)。除此之外，可以不受限地使用本領域中使用的任何培養基。優選地，培養基可以選自于由如下所組成的組：α-MEM培養基(GIBCO)、K-SFM培養基、DMEM培養基(Welgene)、MCDB 131培養基(Welgene)、IMEM培養基(GIBCO)、DMEM/F12培養基、PCM培養基、M199/F12(混合物)(GIBCO)和MSC擴增培養基(MSC expansion medium；Chemicon)。

可以向此類基礎培養基中加入痕量營養物、氮和碳的可吸收源，并且作為非限制性實例，可以加入血清源、生長因子、氨基酸、抗生素、維生素、還原酶和/或糖源。然而，顯而易見的是，本領域普通技術人員可以選擇或組合用于各種組織來源的干細胞的最合適的培養基，而且可對干細胞進行適當地培養。在一個示例性的實施方式中，使用α-MEM培養基和K-SFM培養基。

同樣顯而易見的是，本領域普通技術人員可以基于本領域的常識通過調節例如合適的培養環境、時間和溫度的條件對干細胞進行培養。

在一個示例性的實施方式中，將間充質干細胞在α-MEM培養基中培養并增殖至細胞融合為約80％-90％、優選約90％，使用例如PBS漂洗，然后進一步在K-SFM培養基中培養約20小時至25小時、優選24小時。

術語“融合(％)”在本領域中常規地用于表示每面積的細胞濃度(飽和度)，而且是本領域普通技術人員在實驗中常用的單位，以相對地表示細胞培養中的每單位面積的細胞數量(細胞密度)。本發明還包括制備直徑為8μm以下的小尺寸干細胞及其條件培養基的方法。

同時，該方法可以進一步包括用胰蛋白酶對在根據本發明的培養基中培養的干細胞進行處理的操作。當用胰蛋白酶對經培養的干細胞進行處理時，可以獲得單細胞類型的干細胞，而且在本文中，胰蛋白酶進行處理以抑制細胞之間的積聚并產生單細胞類型的干細胞。可以用能夠抑制細胞之間形成積聚的物質來替換胰蛋白酶。

可以在常規已知的容器中進行干細胞的培養。例如，可以使用三維生物反應器或旋轉器、或者在普通的粘附容器中培養干細胞。

刺激毛發生長的功能

本發明涉及直徑為10μm以下、最優選8μm以下的小尺寸干細胞的預防脫發和刺激毛發生長的極其出色的功能的用途。

通過毛發周期的正常化引起直徑為8μm以下的小尺寸干細胞的預防脫發和刺激毛發生長的功能，并且通過刺激毛囊干細胞的活性增加了毛囊的數量和厚度以減少用于將毛發周期中的休止期轉變為生長期的時間并增加真皮乳頭細胞的產生。

人毛發經歷在其中生長期、退行期和休止期的周期得以重復的過程，并進行毛發掉落和再生，且毛發周期通過調節激素或各種生長因子來操作。毛發被埋在皮膚中并覆蓋有稱為毛囊的表皮和真皮。毛囊上存在真皮乳頭(控制毛發的組織)，而且毛發母細胞直接在真皮乳頭上形成毛發，以產生新的毛發，并且在分裂時推動毛發向上。真皮乳頭細胞具有由生長期(其中細胞的生長是活躍的)、退行期(其中開始退化)和休止期所組成的周期。當在休止期后接收到來自相鄰細胞的信號時，細胞重新進入生長期，并且進行細胞更新，并因此產生新的毛發。

毛囊是僅在哺乳動物中的皮膚器官，并且通過表皮和間充質之間的相互作用從產前期產生。

響應于真皮的信號，毛囊的產生在產前期開始，并因此表皮變厚且在板中形成。產生自厚的表皮板(epidermal plate)的表皮信號誘導了間充質來源的真皮細胞的積聚，并且從所形成的積聚體再次產生真皮信號。該信號刺激了表皮細胞的增殖，并誘導表皮細胞侵入真皮，以包圍積聚體，從而形成真皮乳頭。因此，形成了第一毛囊結構，然后發生表皮細胞的增殖和分化，并導致發育成產生毛發的成熟毛囊。在成熟毛囊中，通過毛囊的基底膜的毛發基質細胞和真皮乳頭細胞之間的相互作用，毛發基質細胞發生特定分化，從而使毛發產生并生長。另外，該相互作用產生了毛囊的周期、維持了器官、并確定了生物特性(例如毛發的厚度和形態)。

調節毛囊中的生物特性的兩個重要因素是外根鞘(ORS)細胞(其為毛囊表皮)和間充質來源的真皮乳頭(DP)，并且毛發通過重復毛發周期而生長和掉落。

角質層和毛發分別通過皮膚表面和毛囊的增殖和分化而產生和掉落，并且連續對它們進行補充、維持和再生的基本細胞源是干細胞。已知毛囊在膨大部(swelling part)中具有表皮干細胞的容器，其參與了毛囊的維持以及皮脂腺和毛干表皮的更新。另外，在毛囊下的真皮鞘(DS)中存在間充質來源的過渡擴增細胞(transit-amplifying cell)，以在生長期維持毛囊的真皮乳頭，并且已知間充質來源的過渡擴增細胞是能夠替代生物合成皮膚的真皮組分(即成纖維細胞)的細胞源，并且成為研究的對象。因此，可以看出，通過本發明的激活處于休止期中的毛囊干細胞的方法可對脫發進行有效治療。

特別地，本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞顯著減少了用于將毛發周期中的休止期轉變至生長期的時間。即，通過刺激處于休止期中的毛囊干細胞的激活，使毛發周期的調節正常化。

在下文中，將對本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞的預防脫發和刺激毛發生長的功能的特征進行描述。

(i)本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞激活了參與真皮乳頭細胞的產生的干細胞以及參與毛發長度的延伸的干細胞。

已經報道，能夠使毛發生長的常規源僅影響誘導毛發生長所需的各種因素的一部分。例如，在已知的現有文獻中，參與毛發生長的毛囊干細胞的激活是以下干細胞的激活：參與真皮乳頭(DP)的產生的干細胞或參與毛發長度的延伸的干細胞。

相反，根據本發明，由于除了該兩種類型的干細胞之外的大多數與毛發相關的毛囊干細胞均被激活，因此毛囊的數量和厚度增加，并且組織的厚度也增加。即，本發明提供了同時影響各種因素的源，并將所述源用于脫發和刺激毛發生長的聯合治療。

(ii)本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞大大減少了用于將毛發周期中的休止期轉變至生長期的時間。

因此，通過使毛發周期調節正常化，本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞展示出永久性的毛發生長作用，而不是對激素的暫時性作用。

包括的常規藥物延緩了脫發的進行或有助于維持處于生長期中的現有毛發，而不進行永久性治療，因此當停止使用藥物時，立即發生脫發。

然而，由于毛囊的數量和厚度增加，并且通過使毛發周期正常化增加了真皮乳頭(DP)的產生，本發明的小尺寸干細胞能夠基于永久性的毛發生長作用從根本上治療脫發。

在本發明的一個示例性實施方式中，確認了小尺寸的臍帶血來源的間充質干細胞使轉變成生長期的時間最短。此外，與廣泛已知的作為用于毛發生長的藥物的和PRP相比，小尺寸的臍帶血來源的間充質干細胞更顯著地增加了毛囊的數量和厚度，即它們顯示出最高的毛發生長作用。

另外，確認了與其中混合有各種尺寸的干細胞的常規的異種干細胞相比，本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基通過激活毛囊干細胞展示出高的刺激毛發生長作用。

如常規所知的，當培養間充質干細胞時，將具有各種尺寸分布的干細胞混合。然而，在本發明中，當僅將本發明的直徑為8μm以下的小尺寸細胞取出用于培養時，顯著地展示出刺激毛發生長的作用。

也就是說，對于預防脫發和刺激毛發生長的作用而言，干細胞的“尺寸”是非常重要的因素，直徑為8μm以下的小尺寸干細胞具有出色的減少黑色素的作用，而不論干細胞來源的組織類型(例如脂肪、骨髓或臍帶血)，特別地，直徑為8μm以下的小尺寸臍帶血來源的干細胞具有最出色的作用。

組合物及其用途

因此，一方面，本發明提供了用于刺激毛發生長的組合物、其制備方法以及使用該組合物預防脫發和刺激毛發生長的方法，所述組合物含有直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分。

干細胞能夠以如下的不顯示出毒性的有效濃度范圍而被包含，但本發明不限于此：10％(v/v)至30％(v/v)、優選15％(v/v)至25％(v/v)、最優選20％(v/v)。

作為本發明的示例性實施方式，本發明的組合物包括藥物組合物和/或化妝品組合物。

藥物組合物

另一方面，本發明提供了用于預防脫發或刺激毛發生長的藥物組合物，所述藥物組合物含有直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分。

脫發或禿頭癥主要分為瘢痕性禿頭癥和非瘢痕性禿頭癥，非瘢痕性禿頭癥包括先天性禿頭癥、男性類型禿頭癥和斑禿，在本發明中，包括所有上述類型，但本發明不限于此。

包含在本發明的藥物組合物中的藥學上可用的載體為在制備中常規使用的載體，包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、海藻酸鹽/酯、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。除了上述成分之外，本發明的藥物組合物還可以含有潤滑劑、保濕劑、甜味劑、矯味劑、乳化劑、懸浮劑或防腐劑。

本發明的藥物組合物的合適劑量由于各種原因而變化，所述原因例如制備方法、給予方法、患者年齡、體重、性別、疾病嚴重程度、飲食、給予時間、給予途徑、排泄速率和反應靈敏度，并且普通的技術熟練的醫生可以容易地確定期望治療的有效劑量，并開出有效劑量的藥物組合物。同時，本發明的藥物組合物的劑量可以是但不限于每天0.01mg/kg(體重)至2000mg/kg(體重)。

本發明的藥物組合物可以口服給予或腸胃外給予，且優選腸胃外給予并且，當腸胃外給予時，可以通過靜脈內注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射或經皮給予來給予藥物組合物。本發明的藥物組合物的給予途徑可以根據施用該藥物組合物的疾病的類型來確定。

例如，最優選通過局部施用至皮膚來給予本發明的藥物組合物。除了頭皮以外，還可施用本發明的藥物組合物的區域可以是需要毛發生長的軀體的任何區域。例如，可將藥物組合物用于其中的毛發由于損傷造成的疤痕而損壞的區域上，或為了簡單的美容作用而用于寬前額或M型前額、睫毛或眉毛，以及用于改善無毛癥的狀況。

最優選地，經注射通過經皮給予來給予本發明的組合物。

在本文中，為了使組合物在充分擴散入皮膚的真皮中之后流經毛細血管，即，為了防止組合物未經充分擴散而短暫地穿過真皮并立即流入體內，可以在將注射器針眼朝上放置時注射組合物。

化妝品組合物

在另一方面，本發明提供了用于預防脫發或刺激毛發生長的化妝品組合物，所述化妝品組合物含有直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分。

本發明的化妝品組合物能夠以本領域中常規制備的任何產品形式制備，例如，乳液、面霜、化妝水、面膜、粉底、洗液、美容液或發用化妝品，但本發明不限于此。

可以通過加入常規添加劑將組合物制備成如下的類型：洗發香波、潤發劑、生發油、發膠、洗發劑、發膜、噴發劑、發用摩絲、焗油膏、染發劑、護發素、其混合物(例如洗發香波和潤發劑的混合物、潤發劑和焗油膏的混合物)或用于刺激毛發生長的液體型毛發生長液，并且還可以包括氣溶膠類型的組合物。

當本發明的化妝品組合物的產品形式為膏劑、面霜或凝膠時，作為載體組分，可以使用動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、二氧化硅、滑石或氧化鋅。當本發明的化妝品組合物的形式為粉劑或噴霧劑時，作為載體組分，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末，特別地，當本發明的化妝品組合物的形式為噴霧劑時，可以額外地包含推進劑，例如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚。當本發明的化妝品組合物的形式為溶液劑或乳劑時，作為載體組分，可以使用溶劑、增溶劑或乳化劑，例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脫水山梨糖醇脂肪酸酯。當本發明的化妝品組合物的形式為懸浮劑時，作為載體組分，可以使用液相稀釋劑，例如水、乙醇或丙二醇；懸浮液，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯或聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯；微晶纖維素；偏氫氧化鋁；膨潤土；瓊脂或黃蓍膠。當本發明的化妝品組合物的形式為含表面活性劑的清潔劑時，作為載體組分，可以使用脂族醇硫酸酯/鹽、脂族醇醚硫酸鹽/酯、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽/酯、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯。

除了活性成分以外，本發明的化妝品組合物中包含的成分可包括在化妝品組合物中常用的組分，例如常規助劑(包括抗氧化劑、穩定劑、增溶劑、維生素、色素和矯味劑)和載體。

可以通過任何常用的方法來制備化妝品組合物。

用于預防脫發和刺激毛發生長的化妝品組合物可以通過例如直接施用或者注射至頭皮或毛發的經皮給予來使用。

基于成人體重，本發明的組合物中包含的混合提取物(其為活性成分)的施用量可以為40mg/kg以下、優選20mg/kg-40mg/kg。

可以使用本領域已知的將組合物施用至皮膚的所有方法。可以通過單次施用或重復施用、或者單獨施用或與另一化妝品組合物組合施用來使用本發明的化妝品組合物。另外，可以根據常規方法來使用具有出色的皮膚保護作用的本發明的化妝品組合物，并且使用次數可以根據使用者的皮膚狀況或品味而變化。

此外，從不同的觀點出發，本發明還涉及使用直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為有效成分的治療脫發的方法。

在上述方法中，所使用的干細胞或其組合物與先前所述相同。

在治療脫發的方法中，特別地，優選使用注射通過經皮給予來給予干細胞或其組合物。在本文中，為了使組合物在充分擴散入皮膚的真皮中之后流經毛細血管，即，為了防止組合物未經充分擴散而短暫地穿過真皮并立即流入體內，可以在將注射器針眼朝上放置時注射組合物。

如上所述，基于藥物組合物和化妝品組合物，對根據本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基進行了描述，但是，對于本領域的普通技術人員來說顯而易見的是，本發明包括具有預防脫發和刺激毛發生長作用的各種類型的組合物以及使用該組合物的方法，所述組合物包含直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基作為活性成分。

也就是說，根據本發明的直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基刺激了毛囊干細胞的激活，以縮短用于將毛發周期中的休止期轉變至生長期的時間，并增加了真皮乳頭細胞的產生，因此具有非常出色的預防脫發和刺激毛發生長的作用，而且本發明還包括基于此類作用的各種用途。

有益效果

根據本發明，直徑為8μm以下的小尺寸干細胞或其條件培養基刺激了毛囊干細胞的激活，以減少用于將毛發周期中的休止期轉變至生長期的時間，并增加了真皮乳頭細胞的產生，從而展現出非常出色的脫發預防作用和毛發生長刺激作用，因此在可施用的領域中非常有用。

附圖說明

圖1是說明了當獲取小鼠組織來觀察毛囊時，制造用來有效地觀察毛囊的長度或數量的片段的方法的示意圖；

圖2是顯示C3H小鼠的hUCB-MSC組和對照組的毛發生長作用(用裸眼觀察)的圖像；

圖3是顯示在C3H小鼠的皮膚組織的hUCB-MSC組和對照組中的毛囊的數量和長度以及皮膚厚度的比較的顯微圖像；

圖4是在第5周至第7周用裸眼觀察到的分離自對照以及脂肪來源的間充質干細胞、骨髓來源的間充質干細胞和臍帶血來源的間充質干細胞的小尺寸細胞在C3H小鼠中的毛發生長作用的比較的圖像；

圖5是顯示分離自對照以及脂肪來源的間充質干細胞、骨髓來源的間充質干細胞和臍帶血來源的間充質干細胞的小尺寸細胞在C3H小鼠中的毛發生長作用(第7周)的動物組織學分析的結果組合的圖像；

圖6是顯示分離自對照以及脂肪來源的間充質干細胞、骨髓來源的間充質干細胞和臍帶血來源的間充質干細胞的小尺寸細胞的條件培養基在C3H小鼠中的毛發生長作用(第8周)的動物組織學分析的結果組合的圖像；

圖7是顯示CCk-8實驗結果的圖表，以確認小尺寸hUCB-MSC隨時間對HaCaT細胞增殖的作用；以及

圖8是通過活/死細胞染色顯示出在對照以及脂肪來源的間充質干細胞、骨髓來源的間充質干細胞和臍帶血來源的間充質干細胞中增殖真皮乳頭(DP)細胞的作用的圖像。

具體實施方式

在下文中，將參照實施例對本發明進行進一步的詳細描述。僅提供實施例用于解釋本發明，并且對于本領域的普通技術人員來說顯而易見的是，不應解釋為本發明的范圍限于所述實施例。

本發明人分離了來源于各種組織的各種尺寸的干細胞，以觀察對毛發細胞生長的作用并確認刺激毛發生長的作用。這是基于小尺寸干細胞使細胞的衰老延緩的事實；并且細胞變得越老，細胞的尺寸變得越大并且增殖速率越低。

材料和方法

1.干細胞的制備

(1)干細胞的分離

在本發明中，使用Medipost Co.,Ltd.(韓國)提供的人臍帶血來源的間充質干細胞。可以通過獲取臍帶血、從臍帶血分離間充質干細胞并對干細胞進行培養來獲得所述細胞，如下是對操作的詳細描述：

在獲取臍帶血的操作中，在正常的陰道分娩中，在出生后，從取出的臍帶靜脈中獲取臍帶血，而胎盤仍保留在子宮中；或者在剖宮產中，在出生后，從臍帶靜脈中獲取臍帶血，而胎盤也從子宮中取出。

在本發明中，當從出生后自子宮取出的臍帶靜脈中獲取臍帶血時，在出生后，通過無菌操作從將胎盤連接至胎兒的臍帶靜脈中獲取臍帶血。首先，獲得臍帶靜脈，然后使用收集針將臍帶血放進含有抗凝血劑的臍帶血儲袋中。

從獲取的臍帶血中分離和培養間充質干細胞的方法可以是包括韓國專利號10-0494265中公開的方法在內的任何常用的方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)。

通過離心從所獲得的臍帶血中分離出單核細胞，漂洗數次以除去殘渣，并以合適的密度接種在培養容器中并進行培養。在細胞以單層增殖后，使用相差顯微鏡將以集落形式增殖的均勻的紡錘體形狀的細胞識別為間充質干細胞。另外，當細胞生長至融合時，通過傳代培養將細胞增殖為需要的細胞數量。

同時，用作對照的各種細胞為HEK293細胞、脂肪細胞(ATCC，USA)、骨髓(LONZA，USA)、hDPC和HaCat(由韓國中央大學給予)。

(2)條件培養基的制備

從hUCB-MSC、BM-MSC和Adipo-MSC制備條件培養基。在37℃下含有5％CO₂的培養箱中，將處于儲存狀態的細胞(儲存在LN2槽中)解凍并進行培養，并在含有2％FBS的α-MEM(GIBCO)培養基中增殖，以具有約90％的細胞融合。

然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細胞洗滌3次，在不向其中添加酚紅的角質形成細胞-無血清培養基(K-SFM)中孵育24小時，以獲得條件培養基，并將上述程序重復3天。另外，將獲得的條件培養基過濾(Top Filer System，Nunc)，然后儲存在冷藏設備中并冷凍。

2.共培養

將hUCB-MSC(5000個細胞/頂部腔室、10,000個細胞/頂部腔室、15,000個細胞/頂部腔室、20,000個細胞/頂部腔室)在頂部腔室(孔徑：1μm)中與transwell腔室(Falcon，USA)中的毛發相關細胞(DP和HaCat)一起進行共培養。

3.小尺寸細胞的分離

在37℃下的5％CO₂的培養箱中，將處于儲存狀態的細胞(儲存在LN2槽中)解凍并進行培養，以及使用8μm和20μm的膜過濾器分離并獲得小尺寸干細胞。

在本文中，使用20μm的膜過濾器，然后使用8μm的膜過濾器獲得直徑為8μm至20μm的細胞。

另外，通過將干細胞分為以下三個組來進行測試，包括：在分離前的其中混合有各種尺寸的干細胞的異種干細胞的組1、直徑為8μm以下的干細胞的組2以及直徑為20μm以上的干細胞的組3。

4.用于觀察毛發生長的C3H小鼠的制備

作為實驗地點，使用Medipost Co.,Ltd(IRB批準編號：131021-1)和Gyeonggi Biocenter(IACUC項目編號：IACUC2014-4-10)，C3H小鼠購自Saeronbio Inc.，并在Jackson實驗室制備。

特別地，在本發明的實驗中使用的C3H小鼠(Jackson lab，日本)是用作毛發生長作用模型的小鼠模型，其中當毛發被除去時開始休止期，并且不同于其它物種，C3H小鼠需要極長的時間以轉變至生長期。即，不同于其它種的小鼠，在不進行休止期誘導藥物處理時，由于休止期非常長，因此C3H小鼠是用于確認毛發生長作用的出色的動物模型(Journal of Investigative Dermatology(2005)124，288-289)。

C3H小鼠皮膚的表面在毛發生長的生長期變成黑色，在退行期變成粉紅色，因此可以通過觀察小鼠的皮膚顏色來檢測毛發生長的時間。

本發明人獲得了7周齡C3H小鼠，并使小鼠通過1周的適應來適應環境。另外，本發明人打算通過將臍帶血來源的間充質干細胞注射到小鼠模型中，以觀察從毛發周期的休止期轉變成生長期的時間。在該實例中，將向其注射PBS的小鼠模型用作陰性對照。

同時，對小鼠進行麻醉以除去毛發。通過將3.36ml甲苯噻嗪(Bayer Korea Ltd.，2094L，韓國)混入5ml舒泰(zoletil)(條形碼#3UHC，韓國)中并加入7.47ml鹽水(JW Pharmaceutical，REG#10055，韓國)來制備15.83ml溶液以作為麻醉劑，并使用胰島素注射器(BD Ultra-FineTM II，韓國)用20μl所述溶液對小鼠進行麻醉。

另外，在麻醉后，使用毛發修剪器除去小鼠的毛發。將小鼠置于干凈的紙上，以與毛發生長方向相反的方向進行首次毛發去除。在使小鼠維持24小時后，然后重新檢查以將剩余毛發除去。

5.本發明的干細胞的注射

為了防止本發明的干細胞穿過皮膚中的真皮直接流入小鼠體內，將注射器針眼朝上放置，并將其放入麻醉小鼠的真皮中，以防止未經充分擴散而短暫地穿過真皮并立即流入體內。在本文中，當注射臍帶血來源的間充質干細胞時，緊緊地抓住皮膚以使干細胞不向外泄漏，并且通過摩擦皮膚以將針從皮膚拔出而完全注射干細胞。

6.獲取小鼠的組織

為了檢查根據本發明的作用，從向其注射了臍帶血來源的間充質干細胞的小鼠中獲取皮膚組織。

準備6孔板、鉗子、手術剪、干凈的紙和毛發去除器，首先，除去小鼠先前生長的毛發。使用鉗子選取最接近頭部的背部皮膚，使用手術剪切開皮膚組織，將經切割的組織貼在紙上并再次以六邊形形狀切開。在本文中，小心地進行切割而不損壞待拍照的組織部分，并且在將紙與組織的端部匹配以容易地彼此粘附的同時進行切割。

圖1是示出了制備用于觀察毛囊的長度和厚度的片段的方向(上部)以及制備用于觀察毛囊的數量和尺寸的片段的方向(下部)的示意圖。當以這些方向獲取組織時，可以對毛囊的縱向橫截面和數量橫截面進行觀察。

7.H&E染色

將獲得的組織儲存在-80℃下，用PBS漂洗15分鐘用于觀察，再用含有4％蔗糖的PBS漂洗三次，每次15分鐘。然后，使所得產物在4℃下與含有30％蔗糖的PBS反應過夜。第二天，將所得產物用其中溶解有30％蔗糖的水性洗滌用品再漂洗三次，每次15分鐘，并將皮膚組織切割成10μm的厚度。

將所制備的組織在25℃下用Harris蘇木精染色30秒，并用水漂洗10分鐘。另外，將所得組織在25℃下用曙紅染色1分鐘，并在25℃下用95％乙醇漂洗兩次，每次10秒。隨后，用100％乙醇漂洗組織兩次，每次10秒，并使其在25℃下與二甲苯反應2分鐘，使用顯微鏡(Nikon，ECLIPS E600W，日本)對組織進行觀察。能夠通過H&E染色觀察毛囊的形態，并確認毛發生長周期。

8.免疫組織化學

通過與4％多聚甲醛(PFA，Sigma，USA)在25℃下反應15分鐘來固定樣品。15分鐘后，用冷的PBS漂洗樣品，使用PBS加入0.3％Triton X-100(Sigma，USA)，并在25℃下與樣品反應10分鐘，以便使免疫抗體容易地滲透到樣品中。

然后，將樣品漂洗3次，每次5分鐘，并在25℃下在含有1％BSA的PBS中封閉1小時。其后，將小鼠PCNA(1:250，Abcam，Cambridge，UK)和兔Ki-67(1:250，Abcam，Cambridge，UK)的一抗在4℃下與樣品反應過夜。另外，加入小鼠Alexa488(1:400，Jackson實驗室，California，USA)和兔Cy3(1:400，Jackson實驗室，California，USA)的二抗，以在25℃下進行30分鐘和1小時的另外的反應。

隨后，將二抗丟棄，并在不暴露至光的暗處用PBS漂洗三次。將樣品的細胞核在25℃下用1μg/ml的DAPI(1:1000；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)染色5分鐘，并置于熒光顯微鏡(Nikon)和共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM700/德國，Nikon Eclipse TE2000-U/日本)上進行觀察。

9.CCK8分析

為了檢測細胞增殖，將400μl的培養基和40μl的細胞計數試劑盒的試劑(CCK-8，Dojindo，USA)在37℃和5％CO₂下處理1小時，將培養基轉移至96孔板，以使用分光光度計在450nm下對光密度(OD)進行檢測。

10.使用活/死細胞染色的定量分析

活/死細胞染色是使用兩種顏色的熒光探針對活細胞和死細胞進行染色的方法。由于溴乙啡啶二聚體(EthD)，死細胞在565nm至605nm的通道波長下顯示紅色，由于鈣黃綠素，活細胞在440nm至480nm的通道波長下顯示綠色。

除去條件培養基的上清液，將沉淀物用PBS漂洗一次或兩次，然后在室溫下用以下混合物染色30分鐘：其中，在10ml的PBS中混合2mM的活/死細胞存活力/細胞毒性試劑盒的試劑(Invitrogen)、20μl的EthD-1和5μl的4mM鈣黃綠素AM。

通過Incucyte^TM FLR(Essen Bioscience Inc.USA，ZEISS，LSM 510META)熒光圖像，將所述染色用于觀察活細胞或死細胞。

實施例

實施例1：人臍帶血來源的間充質干細胞(hUCB-MSC)對毛發生長的作用

1-1.用裸眼觀察毛發生長

在C3H小鼠中誘導休止期，將PBS注射到小鼠的半個背部中以作為陰性對照，并分別以1×10⁶個細胞/100μl和5×10⁵個細胞/100μl，將hUCB-MSC 3組和HEK293細胞組一次注射到小鼠的另一半背部的一個點中以作為測試組。

然后，對小鼠的毛發生長觀察5周，結果示于圖2。

如圖2所示，僅在hUCB-MSC組中，C3H小鼠通過將毛發周期從休止期轉變至生長期而顯示出毛發生長。在本文中，與以1×10⁶個細胞注射時相比，當以5×10⁵個細胞注射細胞時，毛發更長且在更寬的范圍生長，并且第2組的干細胞的直徑為8μm以下。即，當以5×10⁵個細胞/100μl注射直徑為8μm以下的hUCB-MSC時，展示出最出色的毛發生長作用。

1-2.毛囊的觀察

接下來，本發明人試圖在C3H小鼠組織狀態中觀察hUCB-MSC對毛發生長的作用，以及參與毛發生長的毛囊。

為此，通過上述方法制造組織片段，并通過H&E染色進行染色，以觀察毛囊的數量和長度以及皮膚組織的厚度。

結果，如圖3所示，在根據本發明注射hUCB-MSC的組中，觀察到相當高數量的毛囊，毛囊的長度長，而且皮膚組織的厚度厚兩倍以上。在本文中，當注射5×10⁵個直徑為8μm以下的hUCB-MSC細胞時，獲得最大數量和最大長度的毛囊以及最大厚度的皮膚。

1-3.條件培養基的毛發生長作用的觀察

通過相同的方法，將通過上述方法(制備的實施例1-(2))制備的條件培養基給予小鼠，觀察8周后小鼠的毛發生長，結果示于圖6。

如從示出了對于hUCB-MSC而言的小鼠和毛囊圖像的圖6看出的，并且特別地，與直徑為20μm以上的hUCB-MSC的條件培養基相比，當給予直徑為8μm以下的hUCB-MSC的條件培養基時，顯示出色的毛發生長作用，從毛囊圖像還可以看出毛囊的數量和長度有顯著差異。

根據該結果，可以確認直徑為8μm以下的干細胞及其條件培養基具有最出色的毛發生長作用。

實施例2.各種組織來源的干細胞的毛發生長作用

2-1.用裸眼觀察毛發生長

本發明人比較了脂肪來源的間充質干細胞(脂肪細胞-MSC，AD-MSC)、骨髓來源的間充質干細胞(骨髓-MSC，BM-MSC)和臍帶血來源的間充質干細胞細胞(hUCB-MSC)的毛發生長作用，以檢查干細胞的組織來源對毛發生長的影響。

為此，在休止期誘導C3H小鼠后，以5×10⁵個細胞的量將AD-MSC、BM-MSC和hUCB-MSC一次注射到一個點中，在第5周、第6周和第7周觀察毛發生長。

結果示于圖4。

如圖4所示，注射了hUCB-MSC的C3H小鼠具有最出色的毛發生長作用。在注射了UCB-MSC的組中，在第5周首先觀察到毛發生長現象，在至少第7周觀察到毛發在小鼠的90％以上的總面積中生長的現象。

另外，與用作陽性對照的組和PRP組相比，當注射hUCB-MSC時，觀察到明顯更高的毛發生長作用。

2-2.毛囊的觀察

另外，在額外的細胞移植后的第8周，對C3H小鼠皮膚組織中的毛囊進行觀察。

作為通過H&E染色來分析毛囊的數量和長度以及皮膚組織的厚度的結果，如圖5所示，與AD-MSC和BM-MSC相比，當使用hUCB-MSC時，觀察到毛囊的最大數量和最大長度，而且皮膚組織的厚度厚兩倍以上。

2-3.來源于其它組織的干細胞的條件培養基

通過與上述相同的方法，將通過上述方法(制備的實施例1-(2))制備的條件培養基給予小鼠，以觀察第8周的毛發生長，結果示于圖6。

如從圖6的圖像看出的，與AD-MSC條件培養基和BM-MSC條件培養基相比，當使用hUCB-MSC條件培養基時，觀察到毛囊的最大數量和最大長度，而且皮膚組織的厚度更大。

實施例3：真皮乳頭細胞產生的觀察

已知毛發生長與真皮乳頭(DP)部分的細胞增殖密切相關。基于這一事實，本發明人打算使用PCNA和Ki67抗體來確認DP部分的細胞增殖。

結果，如圖5所示，在來源于各種來源的成體干細胞中，當注射hUCB-MSC時，在DP部分中觀察到顯著的細胞增殖作用。

另外，如圖6所示，在來源于各種來源的成體干細胞的條件培養基中，當注射hUCB-MSC時，在DP部分中觀察到顯著的細胞增殖作用。

根據上述結果，在來源于各種組織的間充質干細胞中，可以看出臍帶血來源的間充質干細胞及其條件培養基是顯示出最高的毛發生長作用的來源。

對比實施例1：小尺寸hUCB-MSC的毛發生長作用

(1)體外實驗

為了根據尺寸比較干細胞的毛發生長作用，將直徑為8μm以下的小尺寸hUCB-MSC、直徑為20μm以上的大尺寸hUCB-MSC以及其中混合有各種尺寸的細胞的異種細胞用于分析。在異種細胞狀態中，制備AD-MSC和BM-MSC。將和PRP用作陽性對照，并將HEK293細胞和原始培養基用作陰性對照。

另外，為了觀察對HaCaT細胞和DP細胞的增殖的作用，使用并行培養系統在頂部腔室中對細胞進行體外處理。對細胞處理總計96小時以進行觀察，每24小時通過細胞計數檢測CCK-8中的細胞增殖。

結果示于圖7和圖8

確認DP和HaCaT細胞的增殖水平在72小時時最高，并且hUCB-MSC顯示比異種細胞高兩倍以上的細胞增殖。

另外，就取決于hUCB-MSC的尺寸的增殖方面的差異而言，在直徑為8μm以下的小尺寸hUCB-MSC中，DP細胞的增殖比起對照組的增殖高4.8倍以上(圖7)。

另外，以5,000個細胞至20,000個細胞的不同數量，對接種在并行培養系統的頂部腔室中的干細胞進行培養，而當干細胞的數量為15,000個時，顯示出最高的細胞增殖(圖8)。

另外，通過活/死細胞染色確認了直徑為8μm以下的小尺寸hUCB-MSC具有最高的DP細胞增殖作用(圖8)。

(2)體內實驗

與根據細胞尺寸來觀察毛發生長的上述體外結果類似，在圖5和圖6中示出了通過向C3H小鼠注射細胞來確認體內毛發生長作用而獲得的結果。

根據通過H&E染色獲得的結果，直徑為8μm以下的小尺寸hUCB-MSC及其條件培養基在毛囊的數量和長度以及皮膚厚度方面展示出色的作用。通過使用PCNA和Ki67熒光染色檢查比較產生相同的結果。

根據這些結果，可以看出具有8μm以下的小直徑的干細胞、特別是直徑為8μm以下的小尺寸的臍帶血來源的干細胞及其條件培養基刺激了DP細胞增殖和毛囊的生長以及由此刺激毛發生長，從而展示出最出色的預防脫發和刺激毛發生長的功能，并且與常規情況中所示的未根據尺寸進行分離而對異種干細胞進行簡單培養時相比，展示出特別突出的作用。

另外，當使用直徑為20μm以上的大尺寸細胞及其條件培養基時，對刺激毛發生長沒有顯著的作用，因此，可以看出干細胞的尺寸極大地影響了干細胞的脫發預防作用和毛發生長刺激作用。