治療或預防神經退行性病癥的組合物和方法與流程

本申請要求于2014年4月16日提交的澳大利亞臨時申請第2014901398號的優先權的權益，將其全部公開通過引用在此并入本文。

本發明涉及通過施用激活Nix介導的線粒體自噬的試劑來治療或預防神經退行性病癥的方法。

發明背景

神經退行性疾病是神經系統的致殘病癥的一大組，其特點是神經元亞型的受損和死亡。線粒體功能障礙被認為是各種神經退行性疾病包括帕金森病、阿爾茨海默病、亨延頓病和線粒體疾病的推定致病因素。

線粒體是基本的細胞器，其通過氧化磷酸化作用提供細胞的能量，調節鈣穩態和細胞死亡。然而，線粒體還是細胞活性氧(ROS)的主要來源。由于細胞的抗氧化劑，可以耐受ROS的正常水平，然而在線粒體呼吸缺陷的病理情形下，ROS產生的增加超過抗氧化劑保護的能力，其引起對各種細胞元件(包括線粒體)的損害。該損害的累積被認為導致線粒體功能障礙。因此，通過自噬來移除功能障礙的或損傷的線粒體(稱作線粒體自噬的過程)，對于維持恰當的細胞功能是關鍵的。

帕金森病(PD)由中腦多巴胺神經元的特異且進行性的神經元損失引起。多巴胺是負責在黑質和紋狀體之間傳遞信號的化學信使。多巴胺的損失引起紋狀體的神經細胞以不受控制的方式發作，其導致運動遲緩、靜止性震顫、僵硬和姿勢不穩定的主要臨床特征；可能嚴重且極有害的特征。

在家族型PD中鑒定的數個致病基因中，parkin(編碼E3泛素連接酶的基因)中的突變是常染色體隱性早發型PD的最常見遺傳原因。具有parkin突變的PD患者呈現典型的早發型震顫麻痹、行動緩慢、早期肌張力障礙以及L-多巴響應。而且，廣泛的疾病表現度和外顯率與Parkin-相關的PD有關。

Parkin還涉及線粒體的質量控制。Parkin與PTEN-誘導的假定激酶1(PINK1)(線粒體激酶)一起介導選擇性自噬移除損傷的線粒體。因此，PD-相關的parkin中的突變與受損的線粒體自噬相關。

PD不能治愈。當前的療法嚴重地依賴于通過給予患者口服劑量的多巴胺能試劑(像多巴胺前體左旋多巴或多巴胺激動劑)來補充多巴胺。此類療法可以提供緩解，但是與治療功效的衰減相關，伴隨持續的治療則需要增加的劑量，這與嚴重副作用的風險增加相關。對于PD的另外療法存在迫切的需求。

發明概述

本發明的發明人已確定，通過Nix介導的線粒體自噬的激活可以預防和治療神經退行性疾病或病癥。根據一個方面，本發明提供預防或治療對象中的神經退行性病癥的方法，其包括向所述對象施用治療有效量的增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑。

在一個實施方案中，所述試劑增加細胞中的Nix多肽或其片段，和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表達。

在一個實施方案中，所述試劑包含Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段。

在另一實施方案中，所述試劑包含編碼Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表達載體。

在一個實施方案中，所述細胞是神經元。

在一個實施方案中，神經退行性病癥包括對象的神經元中有缺陷的線粒體自噬。

在一個實施方案中，神經退行性病癥選自：帕金森病、阿爾茨海默病、路易體癡呆癥、克羅伊茨費爾特-雅各布病、亨延頓病、線粒體疾病、多發性硬化癥或肌萎縮側索硬化癥。

在一個實施方案中，神經退行性病癥是帕金森病。在另一實施方案中，帕金森病是早發型帕金森病(EOPD)。

在一個實施方案中，對象具有parkin和/或PINK1中的突變。

根據另一方面，本發明提供鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥有用的試劑的方法，其包括：(a)使細胞與試劑接觸；以及(b)檢測與Nix介導的線粒體自噬相關的多肽的生物活性或表達的增加，或(c)檢測編碼與細胞中Nix介導的線粒體自噬相關的多肽的多核苷酸的表達相對于未與所述試劑接觸的對照細胞的增加，其中增加所述活性或所述表達的試劑被鑒定為對治療神經退行性病癥有用。

在一個實施方案中，在鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥有用的化合物的方法中使用的細胞，顯示受損的Parkin-相關的線粒體自噬。

在一個實施方案中，在鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥有用的化合物的方法中使用的細胞，包含parkin和/或PINK1中的突變。

在一個實施方案中，在鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥的有用的化合物的方法中使用的細胞，分離自患有神經退行性病癥或者處于患神經退行性病癥風險的對象。

在一個實施方案中，在鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥的有用的化合物的方法中使用的細胞，是干細胞、可誘導的多能干細胞(iPS細胞)、祖細胞或由此來源的任意細胞、成纖維細胞、嗅覺神經球或神經元。

根據另一方面，本發明提供用于治療神經退行性病癥的試劑盒，其包含：含有治療有效量的增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑的藥物組合物、用于鑒定需要此類治療的對象的操作指南，以及用于向所述對象施用藥物組合物的用法說明。

在一個實施方案中，藥物組合物包含增加細胞中Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表達的試劑。

在一個實施方案中，藥物組合物包含Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段。

在一個實施方案中，藥物組合物包含編碼Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表達載體。

根據另一方面，本發明提供增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑在制備用于預防或治療神經退行性病癥的藥物中的用途。

根據另一方面，本發明提供這樣的試劑：其增加細胞中Nix介導的線粒體自噬以用于預防或治療神經退行性疾病。

因此，本發明至少涉及下述一系列有編號的實施方案：

實施方案1：預防或治療對象中的神經退行性病癥的方法，其包括向對象施用治療有效量的增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑。

實施方案2：根據實施方案1所述的方法，其中所述試劑增加細胞中的Nix多肽或者其片段或變體或類似物，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或變體或類似物的生物活性或表達。

實施方案3：根據實施方案1或2所述的方法，其中所述試劑包含Nix多肽或者其片段或變體，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或變體。

實施方案4：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述試劑包含編碼Nix多肽或者其片段或變體和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或變體的表達載體。

實施方案5：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述試劑包含編碼Nix多肽或者其片段或變體的表達載體。

實施方案6：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述細胞是神經元或神經元的前體。

實施方案7：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中神經退行性病癥與線粒體功能障礙相關。

實施方案8：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中神經退行性病癥包括受損的線粒體自噬。

實施方案9：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中神經退行性病癥選自：帕金森病、阿爾茨海默病、路易體癡呆癥、克羅伊茨費爾特-雅各布病、亨延頓病、多發性硬化癥或肌萎縮側索硬化癥。

實施方案10：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中神經退行性病癥是帕金森病。

實施方案11：根據前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述對象具有parkin和/或PINK1中的突變。

實施方案12：鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥有用的試劑的方法，其包括：(a)使細胞與試劑接觸；以及(b)檢測與細胞中Nix介導的線粒體自噬相關的一種或多種多肽的生物活性或表達相對于未與所述試劑接觸的對照細胞的增加，或(c)檢測與編碼細胞中Nix介導的線粒體自噬相關的多肽的一種或多種多核苷酸的表達相對于未與所述試劑接觸的對照細胞的增加，其中增加所述活性或所述表達的試劑被鑒定為對治療神經退行性病癥有用。

實施方案13：根據實施方案12所述的方法，其中與Nix介導的線粒體自噬相關的所述一種或多種多核苷酸或所述一種或多種多肽包括Nix和/或GABARAP-L1。

實施方案14：根據實施方案12或13所述的方法，其中所述細胞顯示受損的Parkin-相關的線粒體自噬。

實施方案15：根據實施方案12-14中任一項所述的方法，其中所述細胞包含parkin和/或PINK1中的突變。

實施方案16：根據實施方案12-15中任一項所述的方法，其中所述細胞分離自患有神經退行性病癥或處于患神經退行性病癥的風險的對象。

實施方案17：根據實施方案12-16中任一項所述的方法，其中所述細胞是成纖維細胞、嗅覺神經球或神經元。

實施方案18：用于治療神經退行性病癥的試劑盒，其包含：含有治療有效量的增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑的藥物組合物、用于鑒定需要此類治療的對象的操作指南，以及用于向所述對象施用藥物組合物的用法說明。

實施方案19：根據實施方案18所述的試劑盒，其中所述藥物組合物包含增加細胞中Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表達的試劑。

實施方案20：根據實施方案18或19所述的試劑盒，其中所述藥物組合物包含Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段。

實施方案21：根據實施方案18-20中任一項所述的試劑盒，其中所述藥物組合物包含編碼Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表達載體。

實施方案22：增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑在制備用于預防或治療神經退行性病癥的藥物中的用途。

實施方案23：增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑，其用于預防或治療神經退行性疾病。

實施方案24：根據實施方案22所述的用途或根據實施方案23所述的試劑，其中所述試劑增加細胞中Nix多肽或者其片段或變體或類似物和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或變體或類似物的生物活性或表達。

實施方案25：根據實施方案22所述的用途或根據實施方案23所述的試劑，其中所述試劑包含Nix多肽或者其片段或變體，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或變體。

實施方案26：根據實施方案22所述的用途或根據實施方案23所述的試劑，其中所述試劑包含編碼Nix多肽或者其片段或變體的表達載體。

實施方案27：根據實施方案22或實施方案24-26中任一項所述的用途，或根據實施方案23-26中任一項所述的試劑，其中所述神經退行性病癥與線粒體功能障礙相關。

實施方案28：根據實施方案22或實施方案24-27中任一項所述的用途，或根據實施方案23-27中任一項所述的試劑，其中所述神經退行性病癥包含受損的線粒體自噬。

實施方案29：根據實施方案22或實施方案24-28中任一項所述的用途，或根據實施方案23-28中任一項所述的試劑，其中所述神經退行性病癥選自：帕金森病、阿爾茨海默病、路易體癡呆癥、克羅伊茨費爾特-雅各布病、亨延頓病、多發性硬化癥或肌萎縮側索硬化癥。

實施方案30：根據實施方案29所述的用途或根據實施方案29所述的試劑，其中所述神經退行性病癥是帕金森病。

實施方案31：根據實施方案22或實施方案24-30中任一項所述的用途，或根據實施方案23-30中任一項所述的試劑，其中所述神經退行性病癥與parkin和/或PINK1中的突變相關。

附圖說明

圖1顯示，在分離自攜帶parkin中的純合突變但不患有PD的個體的細胞中，線粒體的功能得以保持(1A)。還示例了，分離自攜帶parkin中的雜合突變的PD個體的細胞更易受線粒體毒素如魚藤酮的攻擊(1B和C)。

圖2顯示，在分離自攜帶parkin中的純合突變但不患有PD的個體(“攜帶者”)的細胞中，線粒體自噬是正常的。

圖3顯示，在分離自攜帶parkin中的純合突變但不患有PD的個體的細胞中，線粒體自噬和自噬的異常誘導中缺乏Parkin功能的補償。

圖4顯示，在分離自攜帶parkin中的純合突變但不患有PD的個體的細胞中，Nix和GABARAP-L1的表達升高。

圖5顯示，在分離自攜帶parkin中的純合突變但不患有PD的個體的細胞中，Nix的敲除廢除了CCCP誘導的線粒體自噬。

圖6顯示，在分離自攜帶parkin中的復合雜合突變的PD個體的細胞中，Nix表達的特異性誘導。

圖7顯示，在分離自攜帶parkin中的復合雜合突變的PD個體的細胞中，Nix的特異性誘導恢復了線粒體自噬。圖7(B)還描述了在分離自攜帶PINK1中的純合突變的PD個體的細胞中，線粒體自噬的恢復。

圖8顯示，在分離自攜帶parkin中的復合雜合突變的PD個體的細胞和分離自攜帶PINK1中的純合突變的PD個體的細胞中，Nix的敲除廢除了由誘導Nix表達的試劑恢復的CCCP誘導的線粒體自噬。

圖9顯示，在分離自攜帶parkin中的復合雜合突變的PD個體的細胞中，增加Nix的表達恢復了CCCP誘導的線粒體自噬。

圖10顯示，在分離自攜帶parkin中的復合雜合突變的PD個體的細胞以及分離自攜帶PINK1中的純合突變的PD個體的細胞中，Nix的過表達恢復了線粒體功能。

本文提及的序列

SEQ ID NO:1：編碼Nix多肽的氨基酸序列：

SEQ ID NO:2：編碼Nix多肽的核酸序列：

SEQ ID NO:3：編碼GABA(A)受體相關蛋白樣1(GABARAP-L1)多肽的氨基酸序列：

SEQ ID NO:4：編碼GABA(A)受體相關蛋白樣1(GABARAP-L1)多肽的核酸序列：

SEQ ID NO:5：aggacaagagaaataaggcc(線粒體DNA正向引物)

SEQ ID NO:6：taagaagaggaattgaacctctgactgtaa(線粒體DNA反向引物)

SEQ ID NO:7：tttttgtgtgctctcccaggtct(核DNA正向引物)

SEQ ID NO:8：tggtcactggttggttggc(核DNA反向引物)

SEQ ID NO:9：ttcacaaagcgccttcccccgtaaatga(線粒體DNA探針)

SEQ ID NO:10：ccctgaactgcagatcaccaatgtggtag(核DNA探針)

SEQ ID NO:11：ttggatgcacaacatgaatcagg(Nix正向引物)

SEQ ID NO:12：tcttctgactgagagctatggtc(Nix反向引物)

SEQ ID NO:13：gacgccttattcttctttgtc(GABARAP-L1正向引物)

SEQ ID NO:14：catgattgtcctcatacagttc(GABARAP-L1反向引物)

SEQ ID NO:15：gtttgtggataagacagtcc(GABARAP-L2DNA正向引物)

SEQ ID NO:16：gaagccaaaagtgttctctc(GABARAP-L2反向引物)

SEQ ID NO:17：ttccccttggccatcaaga(PINK1正向引物)

SEQ ID NO:18：accagctcctggctcattgt(PINK1反向引物)

SEQ ID NO:19：gtcctctcccaagtccacac(β-肌動蛋白正向引物)

SEQ ID NO:20：gggagaccaaaagcttcat(β-肌動蛋白反向引物)

發明詳述

定義

本文使用的術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”意指：(1)改善或穩定對象的病況或疾病，或者(2)預防或減輕與對象的病況或疾病相關的癥狀的發展或惡化。

本文使用的術語“預防(prevent)”、“預防(preventing)”、“預防(prevention)”等指降低在對象中發展病癥或病況的可能性，所述對象未患病癥或病況，但是處于發展病癥或病況的風險或易于發展病癥或病況。

本文使用的術語“施用(administration)”或“施用(administering)”意指本文公開的化合物的施用途徑。施用的示例性途徑包括但不限于：經口施用、靜脈內施用、腹膜內施用、動脈內施用以及肌肉內施用。施用的優選途徑可以根據各種因素而改變，所述因素例如，包含如本文公開的試劑的藥物組合物的組分，可能的或實際的疾病的位點以及疾病的嚴重性。

本文使用的術語“有效的量(amount effective)”或“有效量(effective amount)”意指當施用至對象用于治療疾病時足以實現疾病的此類治療的本文公開的試劑的量。患者中的任何改善被認為足以實現治療。有效量的本文公開的用于治療神經退行性疾病的試劑，可以根據施用方式、患者的年齡、體重和總體健康狀況而改變。最后，開處方者或研究人員將決定合適的量和劑量方案。

本文使用的術語“神經退行性病癥”和“神經退行性疾病”在本文檔中可互換使用，并且意指以異常的細胞死亡為特點的神經系統(例如，中樞神經系統或外周神經系統)疾病。神經退行性病況的實例包括：阿爾茨海默病、唐氏綜合征、額顳癡呆癥、進行性核上性麻痹、匹克氏病、尼曼-匹克氏病、帕金森病、亨延頓病、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮、肯尼迪病(也被稱為脊髓延髓肌肉萎縮)、以及脊髓小腦共濟失調(例如，1型、2型、3型(也被稱為馬查多-約瑟夫病)、6型、7型和17型))、脆性X(Rett's)綜合征、脆性XE精神發育遲滯、弗里德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia)、肌強直營養不良、脊髓小腦共濟失調8型以及脊髓小腦共濟失調12型、亞歷山大病(Alexander's disease)、阿爾帕氏病(Alper's disease)、肌萎縮側索硬化癥(或運動神經元病)、遺傳性痙攣性截癱、線粒體疾病、共濟失調性毛細血管擴張、巴騰病(也被稱為Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、卡納萬病(Canavan disease)、科凱恩氏綜合征(Cockayne syndrome)、皮質基底節變性、克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、缺血性中風、克拉伯病(Krabbe disease)、路易體癡呆癥、多發性硬化癥、多系統萎縮癥、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、匹克氏病(Pick's disease)、原發性側索硬化癥、雷弗素姆病(Refsum's disease)、山霍夫氏病(Sandhoff disease)、希爾德氏病(Schilder's disease)、脊髓損傷、脊髓性肌萎縮癥、Steele-Richardson-Olszewski病、以及脊髓癆。

本文使用的術語“與線粒體功能障礙相關的神經退行性病癥”，意指以線粒體功能障礙為特點或涉及線粒體功能障礙的神經退行性病況。示例性的與線粒體功能障礙相關的神經退行性病況包括但不限于：弗里德賴希共濟失調、肌萎縮側索硬化癥、線粒體肌病、腦病、高乳酸血癥(lactacidosis)、中風(MELAS)、肌抽躍癲癇合并紅色襤褸肌纖維癥(MERRF)、卡恩斯-塞爾綜合征(Kearn-Sayre Syndrome)、慢性進行性眼肌麻痹(chronic progressive ophthalmoplegia)、阿爾帕氏病、利氏病(Leigh’s disease)、癲癇、帕金森病、阿爾茨海默病、亨延頓病和線粒體疾病。

本文使用的術語“對象”和“患者”在本文可互換使用。它們指受疾病或病癥的折磨或者易患疾病或病癥但是可能患有或未患有所述疾病或病癥的人或另外的哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、羊、馬或靈長類)。在某些實施方案中，所述對象是人類。

本文使用的術語“試劑”意指任意小分子化合物、抗體、核酸分子或多肽或者它們的片段。

本文使用的術語“線粒體自噬”指從細胞移除功能障礙的或受損的線粒體的過程。例如，線粒體自噬可以通過以下自噬過程發生：所述自噬過程的特點是將細胞器包入被稱作自噬體的雙膜囊泡，自噬體與溶酶體融合以形成自噬溶酶體，并且隨后降解該自噬溶酶體。

本文使用的“Nix多肽”意指與SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性且具有Nix生物活性的蛋白或其片段。

本文使用的“Nix多核苷酸”意指編碼Nix多肽的核酸分子(例如SEQ ID NO:2)。

本文使用的“Nix介導的線粒體自噬”，意指涉及Nix的線粒體的自噬清除，并且包括Nix與其它蛋白的相互作用，所述其它蛋白包括自噬體膜上的蛋白(如LC3和GABARAP-L1)。Nix介導的線粒體自噬可能涉及Nix與Parkin的相互作用，并且還可能獨立于Parkin而發生。

本文使用的“GABARAP-L1多肽”，意指與SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性且具有GABARAP-L1生物活性的蛋白或其片段。

本文使用的“GABARAP-L1多核苷酸”，意指編碼GABARAP-L1多肽的核酸分子(例如SEQ ID NO:4)。

本文使用的術語“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。該部分優選地含有參考核酸分子或多肽的全長的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000、1500、2000、2500或3000個核苷酸或氨基酸。

本文使用的術語“變體”，當提及多肽時意指含有原始多肽的氨基酸序列的變異的多肽，其保留原始多肽的至少某些生物學活性，或者相比于原始多肽可以具有增加的活性。

本文使用的術語“類似物”，指不相同但具有類似的功能和/或功能特征的分子。

當術語“包含(comprise/comprises)”、“包含(comprised)”或“包含(comprising)”在本申請文件(包括權利要求書)中使用時，它們應被解釋為指定陳述的特征、整數、步驟或組分的存在，但是不排除一種或多種其它特征、整數、步驟或組分、或者它們的組的存在。

本文引用的專利文獻或者以現有技術給出的其它材料不應當被認為承認所述文獻或材料是已知的，或者其包含的信息是在任何權利要求的優先權日的公知常識一部分。

線粒體自噬和神經退行性病癥

如本文所討論的，線粒體是調控細胞能量代謝和細胞死亡的必需細胞器。因此，將功能障礙的線粒體以及它們經線粒體自噬的移除中的缺陷與許多病理生理學的病癥和疾病聯系起來。例如，在阿爾茨海默病中，已證明β-淀粉樣片段靶向線粒體并引起線粒體功能障礙，以及由造成亨延頓病的單基因突變引起對線粒體功能和生理機能的破壞。因此，受損的線粒體自噬涉及各種神經退行性疾病，如帕金森病和阿爾茨海默病。

相反，線粒體自噬的維持或恢復與神經保護作用相關。的確，最近已證明，在亨延頓病的背景下，PINK1的過表達與parkin介導的線粒體自噬和神經保護作用的恢復相關(Cell Death and Disease(2015)6,e1617)。

本發明提供通過增加細胞中Nix介導的線粒體自噬來預防或治療對象中的神經退行性病癥的方法。

線粒體自噬和帕金森病

在與單基因的帕金森病(PD)相關的基因中，parkin和PINK1中的突變已被鑒定為常染色體隱性早發型PD(EOPD)的最常見遺傳原因。Parkin編碼E3泛素連接酶，以及PINK1編碼線粒體絲氨酸/蘇氨酸激酶，二者均涉及健康的線粒體功能和形態的維持。來自證明暴露于線粒體毒素(如1-甲基-4-苯基-1,2,5,6-四氫吡啶(MPTP)和魚藤酮)引起了帕金森癥的數據，已經了解線粒體功能障礙在PD中的作用。最近的研究證明，當通過羰基氰酯-3-氯苯腙(CCCP)消耗線粒體膜電位時，以PINK1依賴的方式將Parkin募集至線粒體，從而通過泛素-蛋白酶體系統促進線粒體外膜蛋白(如線粒體融合蛋白Mitofusin(Mfn)1和2)的泛素化和降解。該過程防止功能障礙的線粒體與健康線粒體集合的融合，并且通過自噬-溶酶體系統(在本文被稱作線粒體自噬的過程)促進功能障礙線粒體的清除。一致地，已證明parkin或PINK1中的突變會損傷PD細胞模型(使用患者來源的細胞或已引入parkin或PINK1中的突變的細胞)中的線粒體自噬，其導致功能障礙的線粒體的累積。由于其對線粒體質量控制的有害影響，受損的線粒體自噬涉及PD中的神經變性和疾病進展。

通過對包含parkin中的各種突變的家族中觀察到的帕金森癥的表型可變性的分析(Koentjoro,et al.,2012,Mov Disord 27(10),1299-303)，發明人發現，替代性線粒體自噬的激活能夠補償受損的Parkin介導的線粒體自噬。

在源自純合子parkin突變攜帶者(其不具有確切的PD的臨床表現)的細胞模型(“攜帶者細胞”)中，觀察到正常的線粒體功能和清除。相反，攜帶者或“先證者(proband)”的女兒(其為復合雜合子且還缺乏功能性Parkin)呈現早發型PD。在源自復合雜合子的細胞模型(“患者細胞”)中，觀察到對線粒體自噬的損傷。

發明人意外地確定，Nip3樣蛋白X(Nix)(也被稱為BNIP3L)的表達，以及其與結合伴侶γ-氨基丁酸A型受體相關的蛋白樣1(GABARAP-L1)的結合，是升高的并且與線粒體自噬的維持相關。

Nix是線粒體外膜蛋白，已證明其在線粒體的自噬清除中發揮重要作用。與其提出的作為線粒體自噬受體的功能一致，顯示Nix與自噬體膜上的蛋白(如LC3和GABARAP-L1)相互作用，并且參與Parkin的線粒體轉運和自噬的誘導。

發明人證明，涉及Nix的替代性線粒體自噬的激活，能夠維持線粒體自噬的功能，并且與預防對象中的神經退行性病癥相關。

因此，本發明提供預防或治療對象中的神經退行性病癥的方法，所述方法包括向對象施用治療有效量的增加細胞中Nix介導的線粒體自噬的試劑。在一個實施方案中，所述試劑增加細胞中的Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的細胞生物活性或表達水平。

在另一實施方案中，所述試劑是編碼Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表達載體。

Nix和GABARAP-L1多肽、變體和類似物

本發明提供Nix和/或GABARAP-L1多肽或片段或變體或類似物以及編碼Nix和/或GABARAP-L1多肽或片段或變體或類似物的表達載體的用途。在一個實施方案中，本發明提供通過在序列中產生變化來優化Nix和/或GABARAP-L1氨基酸序列或核酸序列的方法。此類變化可以包括某些突變、缺失、插入或翻譯后修飾。在其它實施方案中，本發明還包括任何天然存在的Nix和/或GABARAP-L1多肽的變體或類似物。變體與本發明的天然多肽的不同可以在于：氨基酸序列的差異、翻譯后修飾或者這二者。Nix和/或GABARAP–L1多肽的變體與本文所描述的天然氨基酸序列的全部或部分通常呈現至少85％，更優選90％，以及最優選95％或甚至99％的同一性。序列比較的長度為至少5、10、15或20個氨基酸殘基，優選至少25、50、或75個氨基酸殘基，以及更優選多于100個氨基酸殘基。

通過原始序列的改變，變體或類似物可以不同于本文所描述的天然多肽。這些包括天然的或誘導的遺傳變體(例如，由輻射或暴露于乙烷甲基硫酸鹽(ethanemethylsulfate)導致的隨機突變，或者如Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.),CSH Press,1989，或最新分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel,1987)中所描述的定點誘變得到的)。還包括環化肽、分子和類似物，其含有除L-氨基酸之外的殘基(例如，D-氨基酸)，或者非天然的氨基酸或合成的氨基酸(例如，β或γ氨基酸)。

氨基酸包括天然的和合成的氨基酸，以及以與天然的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然的氨基酸是由遺傳密碼子編碼的氨基酸，以及后來修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、γ-羥基谷氨酸、以及O-磷酸絲氨酸、O-磷酸蘇氨酸。氨基酸類似物是與天然氨基酸具有相同的基本化學結構的化合物，即，與氫、羧基、氨基和R基結合的碳(例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍)，但是所述化合物含有天然氨基酸中不存在的一些改變(例如，修飾的側鏈)；術語“氨基酸模擬物”指這樣的化合物：其具有與氨基酸的通常化學結構不同的結構，但是以與天然氨基酸類似的方式起作用。氨基酸類似物可以具有修飾的R基(例如，正亮氨酸)或者修飾的肽骨架，但是保留與天然氨基酸相同的基本化學結構。在一個實施方案中，氨基酸類似物是D-氨基酸、β-氨基酸或N-甲基氨基酸。

氨基酸和類似物是本領域熟知的。氨基酸在本文可以由其通常已知的三字母符號或者由IUPAC-IUB生化命名委員會推薦的一字母符號來提及。同樣地，核苷酸可以由其通常接受的單字母密碼來提及。除全長的多肽以外，本發明還包括本發明的多肽中任一種的片段。根據本發明的方法，可以施用具有被設計來模擬Nix和/或GABARAP-L1功能活性的化學結構的非蛋白的Nix和/或GABARAP-L1類似物。Nix和/或GABARAP-L1的變體和類似物，可以優于原始多肽的生理活性。設計類似物的方法是本領域熟知的，以及根據此類方法通過修飾化學結構可以進行類似物的合成，使得到的類似物呈現參考Nix和/或GABARAP-L1多肽的活性。這些化學修飾包括但不限于，在參考多肽的特定碳原子處代入替代性R基以及改變飽和度。優選地，多肽類似物對體內的降解相對具有抗性，當施用時其導致更久的治療效果。用于測量功能活性的分析包括但不限于下文的實施例中所述描述的那些。

因此，以編碼Nix和/或GABARAP-L1蛋白、其變體或片段的多核苷酸為特色的多核苷酸療法，是用于治療或預防神經退行性病癥的一種治療方法。期望在包含受損的或功能障礙的線粒體的細胞中表達此類蛋白，以促進那些線粒體的去除。可以將此類核酸分子遞送至患有神經退行性病癥或疾病或者處于發展所述神經退行性病癥或疾病風險的對象的細胞。必須將所述核酸分子以它們可被吸收的形式遞送至對象的細胞，以便可以產生治療有效水平的Nix和/或GABARAP-L1蛋白或其片段。

可以施用編碼Nix和/或GABARAP-L1的表達載體，用于整體表達或者可以將其用于轉導所選擇的組織。可以將轉導病毒(例如，逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒)載體用于體細胞基因療法，特別是因為它們高的感染效率以及穩定的整合和表達(參見，例如，Cayouette et al.,Human Gene Therapy 8:423-430,1997；Kido et al.,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer et al.,Journal of Virology 71:6641-6649,1997；Naldini et al.,Science272:263-267,1996；和Miyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。例如，可以將編碼Nix和/或GABARAP-L1蛋白、其變體或片段的多核苷酸，克隆進逆轉錄病毒載體，并且可以從其內源性啟動子、從逆轉錄病毒的長末端重復序列、或者從特異性針對目標靶細胞類型的啟動子處驅動表達。可以使用的其它病毒載體，包括例如，疫苗病毒、牛乳頭瘤病毒、或皰疹病毒如EB病毒(Epstein-Barr Virus))(還參見，例如以下文獻中的載體：Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis et al.,Biotechnology 6:608-614,1988；Tolstoshev et al.,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet 337:1277-1278,1991；Cornetta et al.,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller et al.,Biotechnology 7:980-990,1989；Le Gal La Salle et al.,Science 259:988-990,1993；以及Johnson,Chest 107:77S-83S,1995)。逆轉錄病毒載體開發得特別好，并且已被用于臨床背景(Rosenberg et al.,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson et al.,美國專利第5,399,346號)。優選地，使用病毒載體來全身地施用Nix和/或GABARAP-L1多核苷酸。

還可以采用非病毒的方法用于將治療引入需要治療或預防神經退行性疾病的患者的細胞。例如，在脂轉染存在下(Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono et al.,Neuroscience Letters 17:259,1990；Brigham et al.,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger et al.,Methods in Enzymology 101:512,1983)，脫唾液酸血清類粘蛋白-聚賴氨酸綴合(Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 263:14621,1988；Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 264:16985,1989)，或者通過外科條件下進行微注射(Wolff et al.,Science 247:1465,1990)的情況下，通過施用核酸可以將核酸分子引入細胞。優選地，可以將核酸與脂質體和魚精蛋白聯合施用。

還可以使用涉及體外轉染的非病毒方法實現基因轉移。此類方法包括使用磷酸鈣、DEAE葡聚糖、電穿孔和原生質體的融合。脂質體也可能潛在地有益于將DNA遞送進細胞。也可以通過以下步驟來實現向患者的受影響組織移植正常的基因：將正常的核酸轉移進離體的可培養細胞類型(例如，自體或異體的原代細胞或其后代)，其后將所述細胞(或其子代)注射進靶組織。

從任何合適的表達系統(例如慢病毒表達系統)，使用任何合適的啟動子(例如，人巨細胞病毒(CMV)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子或金屬硫蛋白啟動子)可引導用于多核苷酸療法方法的cDNA的表達，并且通過任何合適的哺乳類調控元件進行調控。例如，若需要，可以使用已知優選在特定的細胞類型中引導基因表達的增強子，以引導核酸的表達。使用的增強子可以包括但不限于，特點為組織特異性或細胞特異性增強子的那些。可選地，如果將基因組克隆用作治療構建體，則可以通過同源調控序列或者通過源自異源來源的調控序列(若需要)來介導調控。

本發明中包括的另外治療方法，涉及將重組治療劑，如重組的Nix和/或GABARAP-L1蛋白、其變體或片段，直接地施用至可能或實際的受疾病影響組織的部位或者全身地施用(例如，通過任何常見的重組蛋白施用技術)。施用的蛋白的劑量取決于大量因素，包括各患者的大小和健康狀況。對于任何具體的對象，具體的劑量方案應當根據個體需要以及施用或監督組合物施用的人的專業判斷隨著時間進行調整。

對增加Nix介導的線粒體自噬的試劑的篩選

如本文所討論，通過增加Nix介導的線粒體自噬，可以補償由于parkin或PINK1中的突變導致的對Parkin-相關的線粒體自噬的損傷。考慮到具有線粒體缺陷的對象具有正常的和有缺陷的線粒體的混合群體，能選擇性地降低有缺陷的線粒體數的試劑有益于神經退行性病癥的治療。若需要，測試能增加Nix和/或GABARAP-L1的表達或生物活性的試劑在促進選擇性消除細胞(例如，包含mtDNA遺傳缺陷的細胞、包含parkin或PINK1中的遺傳突變的細胞、黑質細胞或多巴胺能神經元細胞)中的有缺陷線粒體方面的功效。此類方法對個性化醫學應用特別有用，例如，鑒定很可能對患有神經退行性病癥的對象有益的試劑。在一個實例中，在添加線粒體解偶聯劑或誘導線粒體自噬的其它試劑之前、同時或之后，將候選化合物添加至細胞(例如，神經元培養物)的培養基。然后使用技術人員已知的標準方法，包括本文所描述的那些，來測量細胞中線粒體的功能和線粒體自噬的程度。將候選試劑存在下的線粒體功能和/或線粒體自噬的程度，與未接受候選試劑的相應對照培養基中所測量的水平進行比較。

在一個實施方案中，在包含parkin和/或PINK1中的突變的細胞中，分析所述試劑促進選擇性消除有缺陷的線粒體的能力。能促進Nix和/或GABARAP-L1的表達或生物活性的增加、或有缺陷線粒體的減少的化合物被鑒定為可用于本發明中；可以將這樣的候選化合物例如用作治療劑以預防、延遲、緩解、穩定或治療以線粒體功能障礙為特點的神經退行性病癥。

在一個實施方案中，本發明提供鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥有用的試劑的方法，所述方法包括：(a)使細胞與試劑接觸；以及(b)檢測細胞中與Nix介導的線粒體自噬相關的多肽的生物活性或表達相對于未與所述試劑接觸的對照細胞的增加，或者(c)檢測細胞中編碼與Nix介導的線粒體自噬相關的多肽的多核苷酸相對于未與所述試劑接觸的對照細胞的增加，其中能增加所述活性或所述表達的試劑被鑒定為對神經退行性病癥的治療有用。

在另一實施方案中，本發明提供鑒定對預防或治療對象中的神經退行性病癥有用的試劑的方法，所述方法包括：(a)使細胞與試劑接觸；以及(b)檢測細胞中的Nix多肽和/或GABARAP-L1多肽的生物活性或表達相對于未與所述試劑接觸的對照細胞的增加，或者(c)檢測細胞中編碼Nix多肽和/或GABARAP-L1多肽的多核苷酸的表達相對于未與所述試劑接觸的對照細胞的增加，其中能增加所述活性或所述表達的試劑被鑒定為對治療神經退行性病癥有用。

若需要，可以對通過該方法(或任何其它適當的方法)分離得到的試劑進一步純化(例如，通過高效液相色譜法)。此外，可以測試此類候選試劑用于在神經元細胞中調節線粒體自噬的能力。在其它實施方案中，通過鑒定線粒體功能的增加、細胞死亡的減少、或細胞存活的增加來測量所述試劑的活性。可以將通過該方法分離得到的試劑例如用作治療劑以治療對象中與線粒體功能障礙相關的神經退行性病癥。

本領域技術人員理解，通常將候選化合物對包含有缺陷的線粒體自噬的細胞的影響，與候選化合物不存在下的相應對照細胞進行比較。

候選試劑包括小分子、肽、肽模擬物、多肽和核酸分子。還可以將本文列出的序列中的每一個用于發現和發展治療神經退行性病癥的治療化合物。針對表達可將編碼的蛋白用作藥物篩選的靶標。另外，編碼該編碼的蛋白的氨基端區域的DNA序列、或各mRNA序列的Shine-Delgarno序列或其它翻譯促進序列，可以用來構建促進目標編碼序列表達的序列。通過標準技術(同上的Ausubel et al.)可以分離得到此類序列。本發明的小分子的分子量，優選小于2,000道爾頓，更優選地300至1,000道爾頓，以及最優選地400至700道爾頓。優選這些小分子是有機分子。

本發明還包括通過上述篩選分析鑒定的新試劑。任選地，將此類試劑表征在一個或多個合適的動物模型中，以測定化合物對神經退行性病癥的治療功效。期望地，動物模型中的特征還可以用來確定用此類化合物治療的毒性、副作用或作用機制。而且，在任何上述篩選分析中鑒定的新試劑，可以用于治療對象中的神經退行性病癥。此類試劑可單獨使用或者與本領域已知的其它常規療法聯合使用。

用于篩選的細胞

在一個實施方案中，在包含parkin或PINK1中的突變的細胞中進行本文所描述的篩選。

在另一實施方案中，在具有神經元特征的多巴胺能細胞中進行本文所描述的篩選。此類細胞是本領域已知的，并且包括，例如，BE(2)-M17成神經細胞瘤細胞(Martin et al.,J Neurochem.2003Nov；87(3):620-30)、Cath.a-differentiated(CAD)細胞(Arboleda et al.,J Mol Neurosci.2005；27(l):65-78)、CSM14.1(Haas et al.,J Anat.2002Jul；201(l):61-9)、MN9D(Chen et al.,Neurobiol Dis.2005Aug；19(3):419-26)、N27細胞(Kaul et al.,J Biol Chem.2005Aug5；280(31):28721-30)、PC12(Gorman et al.,Biochem Biophys Res Commun.2005Feb 18；327(3):801-10)、SN4741(Nair et al.,Biochem J.2003Jul l；373(Pt l):25-32)、CHP-212、SH-SY5Y和SK-N-BE。在可選的實施方案中，本文所描述的篩選可以在源自干細胞、iPS細胞或祖細胞的多巴胺能細胞中進行。

在另一實施方案中，本文所描述的篩選可以在神經元、成纖維細胞、嗅覺神經球或神經祖細胞、或者源自成纖維細胞或嗅覺神經球或神經祖細胞的神經元中進行。

測試試劑和提取物

通常，根據本領域已知的方法，從天然產物或合成(或半合成)提取物的大文庫或者化學文庫，或者從多肽或核酸文庫鑒定能夠調整線粒體自噬的試劑。藥物發現和研發領域的技術人員將理解，測試提取物或試劑的明確來源對于本發明的篩選程序不是關鍵的。用于篩選的試劑可以包括已知的試劑(例如，用于其它疾病或病癥的已知治療劑)。可選地，實際上，使用本文所描述的方法可以篩選任意數量的未知化學提取物或試劑。此類提取物或試劑的實例包括但不限于：基于植物、真菌、原核生物或動物的提取物，發酵液和合成試劑，以及既有試劑的修飾物。

眾多方法還可用于產生化學試劑的任意數量的隨機或直接的合成物(例如，半合成物或完全合成物)，其包括但不限于：基于糖類、脂類、肽和核酸的試劑。合成的化合物文庫可商購自：Brandon Associates(Merrimack,N.H.)和Aldrich Chemical(Milwaukee,Wis.)。可選地，使用本領域技術人員已知的標準合成技術和方法學，可以從容易獲得的起始材料合成待用作候選試劑的化學試劑。用于合成通過本文所描述的方法鑒定的試劑的合成化學轉化和保護基方法學(保護和去保護)，是本領域已知的并且包括，例如，在R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.,John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)，以及其后面的版本中所描述的那些。

可選地，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然試劑的文庫，可商購自包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor Branch Oceanographic Institute(Ft.Pierce,Fla.)和PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,質量.)的許多來源。此外，若需要，根據本領域已知的方法，例如，通過標準提取和分級分離方法，產生天然和合成產生的文庫。用于合成分子文庫的方法的實例可見于本領域，例如見于DeWitt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909,1993；Erb et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:11422,1994；Zuckermann et al.,J.Med.Chem.37:2678,1994；Cho et al.,Science 261:1303,1993；Carrell et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994；Carell et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994；和Gallop et al.,J.Med.Chem.37:1233,1994。而且，若需要，使用標準的化學、物理或生物化學方法，容易修飾任何文庫或化合物。

試劑的文庫可呈現為以下形式：溶液(例如，Houghten,Biotechniques 13:412-421.1992)、或者磁珠上(Lam,Nature354:82-84,1991)、芯片上(Fodor,Nature 364:555-556,1993)、細菌(Ladner，美國專利第5,223,409號)、孢子(Ladner美國專利第5,223,409號)、質粒(Cull et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:1865-1869,1992)、或者噬菌體上(Scott and Smith,Science249:386-390,1990；Devlin,Science 249:404-406,1990；Cwirla et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:6378-6382,1990；Felici,J.Mol.Biol.222:301-310,1991；同上的Ladner)。

此外，藥物發現和研發領域的技術人員容易理解去重復的方法(例如，分類去重復、生物去重復和化學去重復，或者其任意組合)，或者應當盡可能消除重復物或已知其活性的材料的重復。

當鑒定了目標粗提取物時，需要進一步分級分離陽性先導提取物，以分離導致觀察到的效果的化學組分。因此，提取、分級分離和純化過程的目標是，仔細定性和鑒定粗提取物內改變編碼與Nix介導的線粒體自噬相關多肽的基因的轉錄活性的化學實體。分級分離和純化此類異質提取物的方法是本領域已知的。若需要，根據本領域已知的方法，對顯示可用作治療神經退行性病癥的治療劑的試劑進行化學修飾。

藥物療法

本發明提供用于治療神經退行性病癥的增加Nix和/或GABARAP-L1的表達或活性的試劑，包括上文鑒定的篩選中鑒定的試劑。在一個實施方案中，本發明提供包含編碼Nix和/或GABARAP-L1多肽的表達載體的藥物組合物。在另一實施方案中，使用本文描述的方法發現具有醫學價值的化學實體，可用作藥物或用作例如，通過合理的藥物設計來對既有試劑進行結構修飾的信息。對于治療用途，可以全身施用使用本文公開的方法鑒定的組合物或試劑，例如，在藥學可接受的載體中配制。優選的施用途徑包括，例如，皮下施用、靜脈內施用、腹膜內施用、肌肉內施用或皮膚內注射、鼻內(例如鼻噴霧)施用或經皮(例如局部貼劑)施用，所述施用在患者中提供持續、持久的藥物水平。將使用在生理可接受載體中的治療有效量的神經退行性病癥治療劑，進行人患者或其它動物的治療。合適的載體及其制劑描述于，例如，E.W.Martin的雷明頓藥物科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)。待施用的治療試劑的量根據施用方式、患者的年齡和體重、以及神經退行性病癥的臨床癥狀而改變。通常，量將在用于治療線粒體疾病的其它試劑的量的范圍中，盡管在某些情況下，由于化合物特異性的增加會需要較少的量。將化合物以控制神經退行性病癥的臨床或生理癥狀的劑量施用，如通過本領域技術人員已知的診斷方法，或使用測量與神經退行性病癥相關、或與Nix介導的線粒體自噬相關的基因(例如，Nix)的轉錄調控的任何分析所測定的。

藥物組合物制劑

用于治療神經退行性病癥的本發明的試劑或其類似物的施用，可以是導致與其它組分組合的治療劑的濃度在緩解、減輕或穩定神經退行性病癥或其癥狀中有效的任何合適的手段。在一個實施方案中，試劑的施用降低細胞中有功能障礙或有缺陷的線粒體的百分比和/或增加健康線粒體的百分比。

施用此類試劑的方法是本領域已知的。本發明提供通過本領域已知的任何手段來治療性施用試劑。所述化合物可以以任何合適的量包含在任何合適的載體物質中，并且通常按重量計以所述組合物總重量的1％-95％的量存在。該組合物可以以適合于腸胃外(例如，皮下、靜脈內、肌肉內或腹膜內)施用途徑的劑型提供。可以根據常規的藥物實踐來配制該藥物組合物(參見，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)。合適的制劑包括：經口施用的形式，儲庫制劑，通過貼劑遞送的制劑，待被局部、經鼻或經皮遞送的半固體劑型。

可以將根據本發明所述的藥物組合物配制成，當施用時基本上立即釋放活性化合物，或者在施用后任意預定的時間或時間段釋放活性化合物。后者的組合物類型通常被稱為緩釋制劑，其包括：(i)在延長的時間段內在身體中產生基本上恒定濃度的藥物的制劑；(ii)在預定的滯后時間之后，在延長的時間段內在身體中產生基本上恒定濃度的藥物的制劑；(iii)通過在身體中維持相對恒定有效的水平，在預定時間段期間維持作用，并伴有與活性物質在血漿水平中的波動(鋸齒形動力學模式)相關的不良副作用最小化的制劑；(iv)通過，例如鄰近或處在中樞神經系統或腦脊液中的緩釋組合物的空間放置來集中作用的制劑；(v)允許方便的給藥，以便例如每一周或兩周施用一次劑量的制劑；以及(vi)通過使用載體或化學衍生物以將治療試劑遞送至特定細胞類型(例如，處于細胞死亡風險的神經元細胞)來靶向神經退行性病癥的制劑，所述特定細胞類型的功能受神經退行性病癥干擾。對于一些應用，緩釋制劑避免了在一天中頻繁給藥以將血漿水平維持在治療水平的需求。可以采用多種策略中的任一種，以便獲得其中釋放速率超過所討論化合物的新陳代謝速率的緩釋。在一個實例中，通過適當選擇各種制劑的參數和成分，包括，例如，各種類型的緩釋組成和包衣來獲得緩釋。因此，將治療劑與合適的賦形劑一起配制進藥物組合物，當施用時，所述藥物組合物以受控的方式釋放治療劑。實例包括單個單元或多個單元片劑或膠囊組成、油類溶液、懸液、乳劑、微膠囊、微球體、分子復合物、納米顆粒、貼劑和脂質體。

腸胃外組合物

通過注射、輸注或植入(皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內等)以劑型、制劑、或者經合適的遞送裝置或含有常規的無毒藥學可接受的載體和佐劑的植入物的方式，經腸胃外施用藥物組合物。此類組合物的配制和制備是藥物配制領域的技術人員熟知的。

用于腸胃外使用的組合物，可以以單元劑型(例如，單劑量安瓿瓶)，或含有數個劑量且可以添加合適防腐劑的小瓶的形式提供(參見下文)。組合物可以是溶液、懸液、乳劑、輸注裝置、或用于植入的遞送裝置的形式，或者其可以以在使用之前用水或其它合適的媒介物復溶的干粉的形式存在。除活性治療劑以外，組合物可以包含合適的腸胃外可接受的載體和/或賦形劑。可以將活性治療劑摻入用于緩釋的微球體、微膠囊、納米顆粒、脂質體等。而且，組合物可以包含懸浮劑、溶解劑、穩定劑、pH調節劑、張力調節劑和/或分散劑。

如上所示，本發明所述的藥物組合物可以是適于無菌注射的形式。為了制備此類組合物，將合適的活性治療劑溶解或懸浮于腸胃外可接受的液體媒介物中。

緩釋的腸胃外組合物

緩釋的腸胃外組合物可以是懸液、微球體、微膠囊、磁性微球體、油類溶液、油類懸液或乳劑的形式。可選地，可以將活性藥物摻入生物相容的載體、脂質體、納米顆粒、植入物或輸注裝置中。用于制備微球體和/或微膠囊的材料是，例如，生物可降解的生物蝕解聚合物，如泌乳過多的(polygalactia)聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(2-羥乙基-L-谷氨酰胺)和聚(乳酸)。當配制緩釋的腸胃外制劑時，可以使用的生物相容的載體是碳水化合物(例如，葡聚糖)、蛋白(例如，白蛋白)、脂蛋白或抗體。用于植入物的材料可以是非生物可降解的(例如，聚二甲基硅氧烷)、或生物可降解的(例如，聚(己內酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯)或以上的組合物)。

用于經口使用的固體劑型

用于經口使用的制劑包括在具有無毒的藥學可接受的賦形劑的混合物中含有活性成分的片劑。此類制劑是技術人員已知的。賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纖維素、淀粉包括馬鈴薯淀粉、碳酸鈣、氯化鈉、乳糖、磷酸鈣、硫酸鈣或磷酸鈉)；成粒劑和崩解劑(例如，纖維素衍生物(包括微晶纖維素)、淀粉(包括馬鈴薯淀粉)、交聯羧甲基纖維素鈉、海藻酸鹽或藻酸)；粘合劑(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯樹膠、藻酸、海藻酸鈉、明膠、淀粉、預膠化淀粉、微晶纖維素、硅酸鎂鋁、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及潤滑劑；助流劑以及抗結合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油或滑石粉)。其它藥學可接受的賦形劑可以是著色劑、調味劑、增塑劑、濕潤劑、緩沖劑等。

片劑可以是無包被的，或者可以通過已知的技術將它們包被以任選地延遲在胃腸道中的崩解和吸收從而在較長的時期內提供持久的作用。可以使包衣適于以預定模式釋放活性藥物(例如，為了得到緩釋的制劑)，或者使其直到通過胃之后才釋放活性藥物(腸溶包衣)。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如，基于羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、甲基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)、或者腸溶包衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素醋酸琥珀酸酯、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、蟲膠和/或乙基纖維素)。

而且，可以使用時延材料如，例如，單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

固體片劑組合物可以包含適于保護組合物抵抗有害化學變化(例如，在釋放活性的神經退行性病癥治療物質前的化學降解)的包衣。可以將包衣以類似于上文的藥劑百科全書(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)中所述描述的方式應用在固體劑型上。

可以將至少兩種活性的神經退行性病癥治療劑在片劑中一起混合，或者可以將其分開。在一個實例中，第一活性治療劑包含在所述片劑的內部，以及第二活性治療劑在外部，使得大部分的第二活性治療劑在第一活性治療劑的釋放之前釋放。

用于經口使用的制劑還可作為以下形式存在：咀嚼片或硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯淀粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或者軟明膠膠囊，其中活性成分與水或油類媒介(例如，花生油、液狀石蠟或橄欖油)混合。可以按常規方式使用例如混合器、流化床設備或噴霧干燥裝備，利用以上提及的片劑和膠囊的成分制備粉末和顆粒。

緩釋經口劑型

可以將用于經口使用的緩釋組合物制備成通過控制活性物質的溶解和擴散來釋放神經退行性病癥活性治療劑。通過試劑的片劑、膠囊、小球或粒狀制劑的合適包衣，或者通過將化合物摻入適當的基質，可以實現溶解或擴散緩釋。緩釋包衣可以包含以上提及的包衣物質中的一種或多種，和/或例如，蟲膠、蜂蠟、糖蠟(glycowax)、蓖麻蠟、巴西棕櫚蠟、十八烷醇、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕櫚硬脂酸甘油酯、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、DL-聚乳酸、醋酸丁酸纖維素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、異丁烯酸甲酯、2-羥基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝膠、1,3-丁二醇、甲基丙烯酸乙二酯和/或聚乙二醇。在緩釋的基質制劑中，基質材料還可以包括，例如，水合甲基纖維素、巴西棕櫚蠟和十八烷醇、卡波姆934、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或鹵代的碳氟化合物。

含有一種或多種治療劑的緩釋組合物，還可以是漂浮片或膠囊的形式(即，當經口施用時在胃內容物頂部漂浮一定時間的片劑或膠囊)。可以通過使化合物與賦形劑和20-75％w/w水解膠體(如羥乙基纖維素、羥丙基纖維素或羥丙基甲基纖維素)的混合物成粒來制備化合物的漂浮片制劑。然后，可以將獲得的顆粒壓縮成片劑。在與胃液接觸時，片劑在其表面周圍形成基本上不透水的凝膠屏障。該凝膠屏障參與維持小于1的密度，從而允許所述片劑在胃液中保持漂浮。

局部施用形式

用于以半固體局部施用本發明試劑的劑型包括軟膏、糊劑、乳霜、洗液和凝膠。可以與粘膜粘著劑聚合物一起配制該劑型，以用于在皮膚應用區域處持續釋放活性成分。可以將活性化合物在無菌條件下與藥學可接受的載體以及可能需要的任何防腐劑、緩沖液或推進劑一起混合。通過將目標化合物與通常用于局部的液體制劑、乳霜制劑和凝膠制劑的常規藥物稀釋劑和載體組合，可以制備此類局部制備物。

隨著添加合適的增稠劑和/或膠凝劑，可以將軟膏和乳霜例如與水狀基質或油狀基質一起配制。此類基質可以包括水和/或油，例如，液狀石蠟、植物油(如花生油或蓖麻油)。根據基質的性質，可以使用的增稠劑包括軟石蠟、硬脂酸鋁、十六十八醇、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氫化羊毛脂、蜂蠟等。

可以將洗液與水狀基質或油狀基質一起配制，并且通常還包含以下的一種或多種：穩定劑、乳化劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑、著色劑、香料等。軟膏、糊劑、乳霜和凝膠還可以包含賦形劑，所述賦形劑包括但不限于：動物和植物脂肪、油類、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或者以上的混合物。

根據該試劑，合適的賦形劑包括：礦脂、羊毛脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、海藻酸鈉、卡波姆、甘油、乙二醇、油類、甘油、苯酸鹽、對羥苯甲酸酯和表面活性劑。本領域技術人員顯而易見的是，具體化合物的溶解性將部分決定如何配制化合物。水凝膠制劑適合于水溶劑。當化合物不以活性所需濃度溶于水中時，乳霜或軟膏制備物通常是優選的。在該情況下，可能需要油相、水相/有機相和表面活性劑來制備所述制劑。因此，基于溶解性和賦形劑主動相互作用信息，可以設計劑型并且可以選擇賦形劑來配制原型制備物。

局部藥物組合物還可以包含一種或多種防腐劑或抑菌劑，例如，羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、氯甲酚、苯扎氯銨等。局部藥物組合物還可以含有其它活性成分，其包括但不限于：抗菌劑(特別是抗生素)、麻醉劑、止痛劑和止癢劑。

劑量

通過從用于小鼠的化合物的量進行推算可以最初確定人的劑量，如技術人員認為，相比于動物模型改變用于人的劑量是本領域常規的。在某些實施方案中，預期劑量的變化可以是約1mg化合物/Kg體重至約5000mg化合物/Kg體重；或者約5mg/Kg體重至約4000mg/Kg體重、或約10mg/Kg體重至約3000mg/Kg體重；或者約50mg/Kg體重至約2000mg/Kg體重；或者約100mg/Kg體重至約1000mg/Kg體重；或者約150mg/Kg體重至約500mg/Kg體重。在其它實施方案中，該劑量可以是約1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000mg/Kg體重。在其它實施方案中，預期可以使用更高的劑量，此類劑量的范圍可以是約5mg化合物/Kg體重至約20mg化合物/Kg體重。在其它實施方案中，該劑量可以是約8、10、12、14、16或18mg/Kg體重。當然，如在此類治療方案中常規進行的，根據最初臨床試驗的結果和具體患者的需求，可以上調或下調該劑量的量。

治療方法

本發明提供通過經Nix介導的線粒體自噬調整有功能障礙或有缺陷的線粒體的消除來治療神經退行性病癥或其癥狀的方法。所述方法包括將治療有效量的藥物組合物施用至對象(例如，哺乳動物如人)，所述藥物組合物包含使用本文描述的方法調整從細胞清除有功能障礙或有缺陷的線粒體的試劑。因此，一個實施方案是治療患有或易患神經退行性病癥的對象的方法。所述方法包括在治療病癥的條件下向對象施用治療有效量的足以治療所述病癥的本文描述的試劑的步驟。

本文的方法包括向對象(包括被鑒定為需要此類治療的對象)有效量本文描述的試劑，或者產生此類效果的本文描述的組合物。鑒定需要此類治療的對象可以是對象或健康護理專業人員的判斷，以及可以是主觀的(例如意見)或客觀的(例如通過測試或診斷方法測量)。

本發明的治療方法(包括預防性治療)通常包括向有此需要的對象(例如，動物、人)，包括哺乳動物，特別是人施用治療有效量的本文的試劑。此類治療將適于施用至患有、患、易患神經退行性病癥或者處于發展神經退行性病癥風險的對象，特別是人。

通過診斷測試或者對象或健康護理提供者的意見(例如，遺傳測試、酶或蛋白標志物、家族史等)產生的任何客觀或主觀測定，可以確定“處于風險”的那些對象。

在一個實施方案中，本發明提供監測治療進程的方法。所述方法包括測定對象中的Nix和/或GABARAP-L1表達水平或其它診斷測量(例如，篩選，分析)水平的步驟，所述對象患有神經退行性病癥或者處于發展神經退行性病癥的風險，其中所述對象已施用足以治療病癥或其癥狀的治療量的本文所描述的試劑。可以將在所述方法中測定的表達水平，與在健康正常對照或在其它受折磨患者中的已知表達水平相比較，以確立對象的疾病狀態。在優選的實施方案中，在比第一水平測定晚的時間點測定在對象中表達的第二水平，并且將兩個水平進行比較，以監測疾病進程或療法功效。在某些優選實施方案中，在開始本發明所述的治療之前，測定對象中表達的預處理水平；然后將標志物的該預處理水平與在治療開始后對象中的標志物水平進行比較，以確定治療的功效。提供以下實施例以說明本發明，而不是限制本發明。本領域技術人員將理解，可用與以上描述的發明一致的許多方式改變下文提供的具體構建，同時保留所述試劑或其組合的關鍵特性。

試劑盒

本發明提供用于治療或預防神經退行性病癥的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包含治療性或預防性組合物，所述組合物包含有效量的單位劑型的本發明試劑(例如，增加細胞中的Nix介導的線粒體自噬的試劑，包括增加Nix的表達和/或活性的試劑；Nix多肽或者其片段或變體，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或變體，或者編碼Nix多肽或者其片段或變體和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或變體的表達載體)。在一些實施方案中，所述試劑盒包含容納有治療性或預防性化合物的無菌容器；此類容器可以是盒、安瓿瓶、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝或本領域已知的其它合適容器形式。此類容器可以由塑料、玻璃、多層紙、金屬箔或適于保存藥物的其它材料制成。

若需要，將本發明的試劑與施用它的說明書一起提供給患神經退行性病癥或者處于發展神經退行性病癥風險的對象。該說明書通常包含關于使用治療或預防神經退行性病癥的組合物的信息。在其它實施方案中，該說明書包括以下的至少一項：化合物的描述；用于治療或預防神經退行性病癥或其癥狀的劑量安排和施用；注意事項；警告；適應癥；禁忌；過劑量信息；不良反應；動物藥理；臨床研究；和/或參考。說明書可以直接打印在容器上(當存在時)，或為張貼至容器的標簽，或為在容器中或隨容器供應的單獨紙張、小冊子、卡片或目錄。

組合療法

任選地，可以將具有治療或預防功效的試劑與用于治療神經退行性病癥的任何其它標準療法聯合施用。若需要，本發明的試劑可以單獨施用，或者與對治療神經退行性病癥有用的常規治療聯合施用。例如，對治療帕金森病有用的治療劑包括但不限于：芐甲炔胺(deprenyl)、金剛烷胺或抗膽堿能的藥物、左旋多巴、卡比多巴(carbidopa)、恩他卡朋(entacapone)、普拉克索、雷沙吉蘭(rasagiline)、抗組胺、抗抑郁劑、多巴胺激動劑、單胺氧化酶抑制劑(MAOI)以及其它。

除非另有說明，本發明的實踐使用常規的分子生物學技術(包括重組技術)、微生物學技術、細胞生物學技術、生物化學技術和免疫學技術，這些都在本領域技術人員的能力范圍內。此類技術在文獻中有充分地解釋，如《分子克隆：實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook，1989)；《寡核苷酸的合成》(Oligonucleotide sythesis)(Gait,1984)；《動物細胞培養》(Animal Cell culture)(Freshney,1987)；《酶學方法》(Methods in Enzymology)《實驗免疫學手冊》(Handbook of Experimental Immunology)(Weir,1996)；《哺乳動物細胞的基因轉移載體》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell)(Miller and Calos,1987)；《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)”(Ausubel,1987)；《PCR：聚合酶鏈式發應》(PCR:The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis,1994)；《新編免疫性實驗指南》(Current Protocols in Immunology)(Coligan,1991))。這些技術可用于產生本發明的多核苷酸和多肽，以及，同樣地，在制備和實踐本發明時可以考慮這些技術。

提出下述實施例以便為本領域普通技術人員提供如何制備和使用本發明的分析、篩選和治療方法的完整公開和描述，并非旨在限制本發明人認為的本發明的范圍。

實施例

實施例1.線粒體的功能在Parkin缺陷攜帶者的細胞中是正常的

發明人鑒定了不具有功能性Parkin蛋白的健康的parkin純合突變攜帶者。由于線粒體是產生ATP形式能量的主要細胞器和受parkin突變影響的最初靶標，測定了來自Parkin缺陷突變攜帶者(其后稱為“攜帶者”)和患者(缺乏功能性Parkin的復合雜合子；其后稱為“患者”)的成纖維細胞中的線粒體ATP合成率。

方法

細胞培養

之前已描述了用于建立和培養人成纖維細胞和人嗅覺神經球細胞系的方案(Koentjoro,et al.,2012,Mov Disord 27(10),1299-303；Park,et al.,2011；Hum Mutat 32(8),956-64)。對于所有實驗，對細胞進行傳代至最多15代。

ATP合成率的評估

如之前描述，測定ATP合成率(Shepherd,et al.,2006)。簡言之，通過胰蛋白酶化收獲成纖維細胞，隨后使用BCA蛋白分析試劑盒(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)，根據生產商的說明書測定總的蛋白濃度。將細胞以1mg/mL總蛋白稀釋于細胞懸浮緩沖液(150mM KCl，25mM Tris-HCl pH 7.6，2mM EDTA pH 7.4，10mM KPO₄pH 7.4，0.1mM MgCl₂和0.1％(w/v)BSA(Sigma))中。通過將250μL細胞懸液與750μL底物緩沖液(10mM蘋果酸，10mM丙酮酸鹽，1mM ADP，40μg/mL毛地黃皂苷和0.15mM五磷酸腺苷(Sigma))于37℃孵育10分鐘來誘導ATP的合成。該孵育之后，通過向50μL小份的反應混合物添加450μL煮沸的淬滅緩沖液(100mM Tris-HCl，4mM EDTA pH 7.75(Sigma))并且于100℃孵育2分鐘來終止反應。將得到的反應混合物以1:10在淬滅緩沖液中進一步稀釋，并且使用ATP生物發光測定試劑盒(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)，根據生產商的說明書，在FB10光度計(Berthold Detection Systems,Pforzheim,Germany)中測量ATP的量。

細胞毒性測試

根據生產商的方案，使用CytoTox 96非放射性細胞毒性分析試劑盒(Promega,Madison,WI,U.S.A.)測定細胞死亡。簡言之，將人嗅覺神經球細胞以每孔50,000個細胞接種在24孔培養板中，并且培養48小時。然后將細胞暴露于增加劑量的魚藤酮(Sigma；1.5μM、2.5μM和12.5μM)72小時。將50μL小份的培養基與底物混合物孵育30分鐘。使用Benchmark酶標儀(Bio-Rad,Hercules,CA,U.S.A.)，于490nm用分光光度法測量乳酸脫氫酶(LDH)的活性。

結果

當與對照相比時(37.4±1.2)，在患者細胞中ATP合成率顯著降低(31.4±3.0，p<0.05)，但是在攜帶者細胞中不顯著降低(36.4±3.5)(圖1A)。然后將細胞用魚藤酮處理，以檢查其在攜帶者細胞中的作用。魚藤酮是線粒體復合體I抑制劑，并且顯示增加線粒體功能障礙細胞(如Parkin相關的PD細胞模型)中的細胞毒性。當暴露于魚藤酮時，患者的細胞呈現增加的毒性，而對照和攜帶者細胞類似地響應(圖1B和1C)。

圖1顯示(A)當與對照相比時，在源自攜帶者的成纖維細胞中腺苷三磷酸(ATP)合成率是正常的，但是在患者的成纖維細胞中顯著降低。(B)使用釋放進培養基的乳酸脫氫酶(LDH)活性，測試人嗅覺神經球細胞對魚藤酮的敏感性。當與對照(白色柱)相比時，增加劑量的魚藤酮(0、1.5、2.5和12.5μM)以劑量響應模式顯著地提高患者細胞(黑色柱)培養基中的LDH活性，而攜帶者(灰色柱)顯示與對照細胞類似的細胞毒性程度。(C)人嗅覺神經球細胞中，魚藤酮誘導的細胞死亡。使用以上描述的細胞毒性分析測試細胞對魚藤酮的敏感性。當與對照(白色柱)和攜帶者細胞(灰色柱)相比時，增加劑量的魚藤酮(0、1.5、2.5和12.5μM)以劑量響應方式顯著降低患者細胞(黑色柱)中的細胞活力。在單因素方差分析和隨后的事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，*；p<0.05，**；p<0.01和***；p<0.001。

這些結果表明患者中的線粒體功能障礙，但是在攜帶者細胞中保持線粒體的功能，盡管具有相同的Parkin缺陷病況。

實施例2.在攜帶者細胞中CCCP誘導的線粒體自噬是正常的。

在攜帶者細胞中觀察到的正常線粒體功能，暗示了補償Parkin損失的線粒體質量控制的正常功能。使用CCCP在攜帶者細胞中誘導線粒體自噬，并且使用三種不同方法的組合進行檢查；通過檸檬酸合酶活性(線粒體基質酶)測量線粒體質量，通過實時定量PCR測量mtDNA含量，以及通過共聚焦顯微鏡共定位線粒體和自噬體。為了使用共聚焦顯微鏡在視覺上監測線粒體自噬，產生了表達自噬體標志物GFP-LC3和線粒體標志物RFP-Mito的成纖維細胞。

方法

慢病毒的產生和細胞系的建立

綠色熒光蛋白(GFP)標記LC3載體來自Ernst Wolvetang博士的惠贈。使用Lenti-X HTX慢病毒包裝系統(Clontech,Mountain View,CA,USA)和Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，根據生產商的說明書，產生表達GFP-LC3的慢病毒。在轉染后48小時和72小時，收集含有慢病毒的培養基，隨后在測量病毒滴度之前，使用Lenti-X濃縮器(Clontech)進行濃縮。

為了產生表達GFP-LC3的穩定細胞系，在4μg/mL聚凝胺(Sigma,St.Louis,MO,USA)的存在下，用1感染復數(MOI)的慢病毒轉導成纖維細胞24小時，隨后在含有2μg/mL殺稻瘟素(Invitrogen)的培養基中生長，用于篩選。

線粒體清除的評估

將成纖維細胞以每孔200,000個細胞接種在6孔培養板中，并且用10μM的DMSO或CCCP(Sigma)處理24小時，以通過降低線粒體膜的電位來誘導線粒體自噬。

為了測量線粒體質量，使用檸檬酸合酶分析試劑盒(Sigma)，根據生產商的說明書，測定檸檬酸合酶(線粒體基質酶)的活性。簡言之，用細胞刮棒收獲成纖維細胞，并且將其重懸于細胞裂解緩沖液(補充有蛋白酶抑制劑混合物的CelLytic M細胞裂解試劑(Sigma))，隨后進行簡短的超聲處理。使用BCA蛋白分析試劑盒(Thermo Scientific)，根據生產商的說明書，在測定蛋白的濃度之后，將10μg總蛋白與底物緩沖液(1×分析緩沖液，300μM乙酰CoA，100μM 5，5′-二硫基-(2-硝基苯甲酸))混合，隨后添加100μM草酰乙酸鹽溶液以起始反應。在添加草酰乙酸鹽溶液之前和之后，每10秒測定反應混合物于412nm(OD412)處的光吸收，持續1.5分鐘。通過從添加草酰乙酸鹽之后每分鐘的OD412，減去添加草酰乙酸鹽之前每分鐘的OD412(本底活性)，來測定檸檬酸合酶活性。

使用如之前所報道的實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR)(Parfait,et al.,1998)，進行線粒體DNA的定量。簡言之，用細胞刮棒收獲成纖維細胞。然后，使用QIAamp DNA Mini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)，根據生產商的說明書，提取總DNA(即核DNA[nDNA]和線粒體DNA[mtDNA])。根據生產商的說明書，使用TaqMan基因表達預混液(Invitrogen)，在Rotor Gene 6000(Qiagen)上進行多重qPCR分析。用于反應的引物和TaqMan探針在下文表1中列出。使用Rotor-Gene 6000系列軟件v.1.7，相對于nDNA計算mtDNA的量。

表1.用于定量線粒體DNA的引物和探針

使用共聚焦顯微鏡，進行線粒體和自噬體的共定位研究。簡言之，將表達GFP-LC3的30,000個成纖維細胞接種至35mmμ-Dish培養皿(Ibidi,Martinsried,Germany)并且培養48小時，隨后根據生產商的說明書，用CellLight Mitochondria-RFP BacMan 2.0(Invitrogen)進行轉導以標記線粒體。24小時孵育之后，用20μM CCCP(Sigma)處理細胞4小時以誘導線粒體自噬，并且使用Leica TCS SP5II共聚焦顯微鏡(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)進行活細胞成像。得到來自至少兩次獨立實驗的50個單個細胞的圖像并進行分析。使用LAS-AF軟件v.2.6.0(Leica Microsystems)，用以下的條件和運計測定共定位度：共定位度[％]＝共定位區域÷閾值和背景消除設為30％的前景區域；前景區域＝圖像區域-背景區域。

結果

暴露于CCCP引起對照(相比于媒介物對照平均51.8％的降低，p<0.001)和攜帶者細胞(相比于媒介物對照38.7％的降低，p<0.001)中的線粒體質量顯著降低，但是在患者細胞中沒有引起顯著降低(p＝0.16)。類似地，通過CCCP的處理，mtDNA的含量在對照(35.4％，p<0.01)和攜帶者細胞(27.6％，p<0.01)中顯著減少，但是在患者細胞中不顯著(p＝0.84)。在共聚焦顯微鏡中，在CCCP處理之前，觀察到GFP-LC3和RFP-Mito之間最小限度的共定位(數據未示出)。當通過CCCP誘導線粒體自噬時，在對照和攜帶者的細胞中觀察到GFP-LC3和RFP-Mito之間顯著增加的共定位，其表示線粒體自噬提高，而此類變化在患者細胞中未觀察到。共定位的定量揭示了患者細胞中的共定位度(8.6±9.5％，p<0.01)相比于對照(100±28.3％)顯著較低，其暗示了有缺陷的線粒體自噬，而攜帶者細胞中觀察到的共定位(101.9±36.5％)與對照細胞相當。

圖2顯示(A)相比于媒介物處理的相對物，檸檬酸合酶活性在對照和攜帶者的細胞中顯著降低，但是在患者細胞中不顯著。(B)從媒介物處理的細胞(黑色柱)或者用10μM CCCP(白色柱)處理24小時的細胞分離DNA，隨后使用實時定量PCR進行線粒體DNA的定量。在CCCP處理之后，線粒體DNA(mtDNA)相對于核DNA(nDNA)的相對量，在對照和攜帶者的細胞中顯著減少，但是在患者細胞中不顯著。在雙尾學生t-檢驗中，N.S；不顯著，**；p<0.01，***；p<0.001。(C)將表達GFP-LC3(自噬體標志物，左圖中的綠色熒光)和RFP-Mito(線粒體標志物，中間圖中的紅色熒光)的成纖維細胞，用20μM CCCP處理4小時。在對照和攜帶者的細胞中觀察到GFP-LC3和RFP-mito(右圖中的黃色點)之間高的共定位度，其表示線粒體自噬提高，但是在患者細胞中沒有提高。比例尺：10μm。(D)從50個單個細胞計算共定位度。當與對照相比時，患者細胞呈現顯著低的共定位度，而攜帶者細胞顯示類似的程度。在單因素方差分析，隨后事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，**；p<0.01。

實施例3.在攜帶者細胞中線粒體自噬和自噬異常激活的過程中缺乏Parkin功能的補償

為了確認攜帶者細胞中線粒體自噬中缺乏對Parkin功能的補償，評估了當CCCP處理時線粒體的Parkin募集和線粒體融合蛋白2(Mfn2)的泛素化。

方法

線粒體的分離

使用采用標準Dounce勻漿器和甘露糖醇-蔗糖-EDTA(MSE)緩沖液(25mM甘露糖醇，75mM蔗糖，100mM EDTA(Sigma))的方案，從成纖維細胞分離線粒體。簡言之，通過胰蛋白酶消化收集細胞，并且將其在3mL冷MSE緩沖液中重懸。使用機動Dounce勻漿器(Kika Labortechnik，Staufen，Germany)裂解細胞。向勻漿液添加另外3ml MSE緩沖液，隨后于4℃以600×g離心10分鐘。然后將含有線粒體的上清液于4℃以12,000×g進一步離心15分鐘，收集線粒體。在離心之后，保留上清液(“細胞溶質級分”)，并且根據生產商的說明書，通過具有9kDa分子量截留的離心蛋白濃縮器(Thermo Scientific)進行濃縮。同時，將含有線粒體的小球(“線粒體級分”)用1ml MSE緩沖液洗滌兩次，并且最后重懸于60μL裂解緩沖液(補充有蛋白酶抑制劑混合物的CelLytic M細胞裂解試劑(Sigma))中。

蛋白印跡分析

使用XCell SureLock小型電泳槽電泳系統和XCell II印跡模塊(Invitrogen)，通過蛋白印跡測定蛋白的表達。簡言之，使用NuPAGE Novex 4％-12％Bis-Tris SDS/聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)，對20至30μg總細胞裂解物或線粒體/細胞溶質級分進行電泳，并將其轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Thermo Scientific)。然后依次應用蛋白特異性一抗和綴合有辣根過氧化物酶的二抗來探測膜上有印跡的蛋白。分析中使用的抗體詳述于下文表2中。使用SuperSignal West Pico或Femto化學發光底物(Thermo Scientific)產生化學發光，并使用LAS4000(Fujifilm,Tokyo,Japan)進行檢測。

表2.在蛋白印跡分析中使用的抗體

TBST.具有Tweer20的Tris緩沖鹽水。RT.室溫

RNA的提取和實時定量RT-PCR分析

使用RNeasy小量提取試劑盒(Qiagen)，根據生產商的說明書，制備來自成纖維細胞的總RNA，然后根據生產商的說明書，用SuperScript III第一鏈合成系統(Invitrogen)將其反轉錄進cDNA。使用得到的cDNA，采用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen)，根據生產商的說明書，在Rotor Gene 6000(Qiagen)上以實時定量RT-PCR(qRT-PCR)的方式測定基因表達。反應中使用的引物在下文表3中列出。

表3.用于qRT-PCR分析的引物

結果

當暴露于CCCP時，Parkin在對照細胞的線粒體級分中高度累積，而在細胞溶質級分中的蛋白是減少的，表明線粒體的Parkin募集。此外，在CCCP處理之后，對照細胞顯示泛素化Mfn2的增加且非泛素化形式的量減少，表明了Parkin-介導的泛素化和Mfn2的降解。然而，當CCCP處理時，在攜帶者細胞中沒有觀察到這些Parkin相關事件中的任一種，這確認了線粒體自噬過程中Parkin功能的缺乏。此外，在CCCP處理之前和之后，相比于對照，PINK1轉錄物的表達水平在攜帶者中沒有升高，這支持了在攜帶者細胞中Parkin/PINK1介導的線粒體自噬缺乏補償激活。此外，存在介導線粒體的非特異性降解的極度活躍自噬的可能性。因此，還通過監測CCCP處理時LC3-I向LC3-II(作為用于自噬功能的指示劑)的轉化，測試這種可能性。而且，在別處已表明CCCP以與針對雷帕霉素相當的數量級的激活誘導HeLa細胞、HCT116細胞和MEF中的自噬。在檢查的所有細胞系中，在CCCP處理之前和之后檢測到LC3-II/β-肌動蛋白比值的類似增加，表明自噬機制在基礎條件和/或誘導線粒體自噬條件下的功能正常。綜合考慮，這些結果表明，攜帶者細胞中觀察到的CCCP誘導的線粒體自噬不受PINK1/Parkin通路或自噬的異常激活介導，這暗示涉及獨立于Parkin的線粒體自噬通路。

如圖3所示，(A)從用媒介物或10μM CCCP處理6小時的成纖維細胞分離線粒體和細胞溶質級分，并且通過蛋白印跡測定Parkin和Mfn2的亞細胞定位。對于線粒體級分使用針對VDAC的抗體，以及對于細胞溶質級分使用針對β-肌動蛋白的抗體，確認了級分的質量。在對照細胞中，在基礎條件下野生型50kDa Parkin主要存在于細胞溶質級分中。當暴露于CCCP時，Parkin的水平在線粒體級分中增加而在細胞溶質級分中減少，表明Parkin向線粒體的易位。在攜帶者細胞中不存在Parkin向線粒體的易位。在暴露于CCCP之后，在對照中觀察到非泛素化形式Mfn2表達的降低以及泛素化形式(Ub-Mfn2)的存在，但是在攜帶者細胞中未觀察到。Mito：線粒體級分；Cyto：細胞溶質級分；Mfn2：線粒體融合蛋白2；VDAC，電壓依賴性陰離子通道。(B-D)將成纖維細胞在基礎條件下培養，或者用10μM CCCP處理6小時，然后收集蛋白。(B)通過蛋白印跡來測定對照、攜帶者和患者細胞中LC3-I和LC3-II的表達，并且使用光密度法對條帶進行定量。將β-肌動蛋白(42kDa)用作上樣對照。(C)當進行CCCP處理時，相比于未處理組，LC3-II/β-肌動蛋白比值的水平顯著增加；然而，在細胞系之間不存在差異。CCCP誘導LC3-I向LC3-II的轉化。在雙尾學生t-檢驗中，*；p<0.05，以及**；p<0.01。(D)當與對照相比時，在CCCP處理之前和之后，PINK1的表達在攜帶者和患者細胞中減少。在單因素方差分析，隨后的事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，*；p<0.05，以及**；p<0.01。

實施例4.在攜帶者細胞中Nix和GABARAP-L1的表達水平是升高的

為了評估Nix介導的線粒體自噬是否為攜帶者細胞中由CCCP誘導的線粒體自噬增加的原因，使用qRT-PCR評估基礎條件和CCCP處理條件下Nix、GABARAP-L1和GABARAP-L2的表達水平。

方法

在提取總RNA以及cDNA合成之前，將成纖維細胞在基礎條件下培養，或者用10μM CCCP處理6小時。通過qRT-PCR測定Nix、GABARAP-L1和GABARAP-L2的表達。

結果

在基礎條件下，Nix的表達在對照和攜帶者細胞之間是相當的，但是當通過CCCP誘導線粒體自噬時，其在攜帶者細胞中顯著增加(p<0.01)。在兩種條件下，當與對照相比時，攜帶者細胞還顯示升高水平的GABARAP-L1，但GABARAP-L2的表達減少。另一方面，甚至在CCCP處理之后，當與對照細胞相比時，發現這些基因的表達在患者細胞中維持顯著較低。綜合考慮，這些結果表示在攜帶者細胞中Nix被CCCP處理誘導和其結合伴侶GABARAP-L1的高表達水平，這暗示它們涉及替代性線粒體自噬。

圖4顯示(A)基礎條件下，在對照和攜帶者的細胞中Nix的表達是類似的，但是在患者細胞中顯著降低。當與對照和患者細胞相比時，在攜帶者細胞中觀察到升高水平的GABARAP-L1。當與對照相比時，在攜帶者和患者細胞中GABARAP-L2的表達顯著減少。(B)在CCCP處理條件下，當與對照相比時，攜帶者細胞顯示Nix和GABARAP-L1顯著高的表達，但GABARAP-L2沒有顯著高的表達。當與對照和攜帶者的細胞相比時，在患者細胞中Nix、GABARAP-L1和GABARAP-L2的表達保持顯著降低。在單因素方差分析，隨后的事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，*；p<0.05，以及**；p<0.01。

實施例5.Nix的敲除損傷了在攜帶者細胞中CCCP誘導的線粒體自噬

為了確認Nix涉及CCCP誘導的線粒體自噬，我們使用siRNA使Nix沉默，并且評估在CCCP誘導的線粒體自噬中的變化。

方法

siRNA介導的Nix敲除

使用Dharmacon ON-TARGET加SMART pool-人BNIP3L(稱為Nix siRNA；Thermo Scientific,#L-011815-00-0005)和DharmaFECT1siRNA轉染試劑(Thermo Scientific,#T-2001-01)，根據生產商的說明書，進行成纖維細胞中Nix的敲除。將ON-TARGET加非靶向siRNA#1(稱為雜亂(scramble)siRNA；Thermo Scientific,#D-001810-01-05)用作陰性對照。

轉染后48小時，分別使用qRT-PCR和蛋白印跡，在mRNA和蛋白水平確認基因敲除。靶mRNA水平大于95％的減少被認為是成功敲除。

結果

siRNA轉染后48小時，Nix的表達水平在mRNA水平(>95％)和蛋白水平顯著降低，表示成功敲除。暴露于CCCP后，轉染有雜亂siRNA的細胞顯示由檸檬酸合酶活性測量的線粒體質量的顯著降低(相比于各自的媒介物對照，在對照細胞中63.0％的降低，p<0.001，在攜帶者細胞中30.1％的降低，p<0.05)，表示正常的線粒體自噬。然而，Nix siRNA的轉染廢除了攜帶者中的線粒體質量的降低，但在對照細胞中沒有廢除(對照細胞中47.6％的降低，p<0.01，以及攜帶者細胞中8.5％的降低，p＝0.15)。對轉染有雜亂siRNA的細胞中mtDNA含量的評估(對照細胞中20.7％的降低，p<0.001，以及攜帶者中33.0％的降低，p<0.05)，以及轉染有Nix siRNA的細胞中mtDNA含量的評估(對照細胞中36.0％的降低，p<0.01，以及在攜帶者細胞8.1％的降低，p＝0.39)，獲得類似的結果。此外，當通過CCCP誘導線粒體自噬時，相比于轉染有雜亂siRNA的細胞，轉染有Nix siRNA的攜帶者細胞顯示GFP-LC3和RFP-mito共定位的顯著減少，而在基礎條件下，觀察到轉染有雜亂siRNA和Nix siRNA的攜帶者細胞之間類似較低的共定位度(數據未示出)。共定位的定量揭示，當與各自的雜亂siRNA細胞相比時，在Nix siRNA感染的攜帶者細胞中的顯著降低(63.0％的降低，p<0.001)，這表明CCCP誘導的線粒體自噬的損傷。綜合考慮，這些結果表示，在具有Parkin功能損失的攜帶者細胞中，Nix促進CCCP誘導的線粒體自噬。

圖5顯示在mRNA水平(A)和蛋白水平(B)確認了Nix的成功敲除。(C和D)在Nix敲除之后，從媒介物處理的細胞或用10μM CCCP處理24小時的細胞制備細胞裂解物和DNA。(C)使用檸檬酸合酶分析來測量線粒體質量。當CCCP處理時，檸檬酸合酶的活性在用雜亂siRNA處理的細胞和Nix siRNA處理的對照細胞中顯著降低，但在用Nix siRNA處理的攜帶者細胞中沒有顯著降低。(D)線粒體DNA的定量顯示，在CCCP處理之后，mtDNA針對nDNA的相對量在雜亂siRNA處理的細胞和Nix siRNA處理的對照細胞中顯著減少，但在用Nix siRNA處理的攜帶者細胞中沒有顯著減少。在雙尾學生t-檢驗中，NS；不顯著，*；p<0.05，**；p<0.01，***；p<0.001。(E)將表達GFP-LC3(自噬體標志物，左圖中的綠色熒光)和RFP-Mito(線粒體標志物，中間圖中的紅色熒光)的成纖維細胞，用25nM雜亂siRNA或Nix siRNA處理。在siRNA轉染后72小時，將細胞與20μM CCCP孵育4小時以誘導線粒體自噬。在CCCP的處理下，在用雜亂siRNA處理的攜帶者細胞中觀察到GFP-LC3和RFP-Mito之間的高共定位度(右圖中的黃點)，這表示升高的線粒體自噬，而Nix siRNA損害了攜帶者細胞中的線粒體自噬。比例尺：10μm。(F)從50個單個細胞的圖像計算共定位度。在CCCP的處理下，當與雜亂siRNA處理的相對物相比時，Nix siRNA處理的攜帶者細胞呈現顯著低的共定位度。雙尾學生t-檢驗中，***；p<0.001。

實施例6.患者細胞中Nix表達的特異性誘導恢復了線粒體自噬

為了確認Nix表達和CCCP誘導的線粒體自噬之間的關系，相對于對照和攜帶者的細胞，我們增加了Nix表達缺陷細胞中Nix的表達，并且評估了CCCP誘導的線粒體自噬中的變化。

方法

Nix的表達增加

為了評估豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)對Nix表達的影響，將對照細胞和患者細胞(“先證者”)暴露于PMA(10nM或20nM)24小時。24小時之后收獲細胞，并且通過如上概述的蛋白印跡測定Nix和GABARAP-L1蛋白的表達。

使用如上概述的方法，評估誘導Nix的表達對線粒體自噬的功能性影響。將患者細胞用CCCP和PMA共處理24小時，并且經通過檸檬酸合酶活性測量的線粒體質量以及通過實時定量PCR測量的mtDNA含量來檢查線粒體自噬。用于該分析的細胞包括如上文所描述的“患者”細胞，以及分離自被鑒定在c.1309T>G(p.W437G)處具有PINK1純合突變-“PINK1突變(PINK1mut)”的PD患者個體的細胞。

結果

圖6顯示，通過蛋白印跡來測定對照和患者細胞中Nix(A-B)和GABARAP-L1(C-D)的表達，并且使用光密度法對條帶進行定量。將β-肌動蛋白(42kDa)用作上樣對照。當PMA處理時，與媒介物對照相比，Nix/β-肌動蛋白比值的水平增加(A-B)。當暴露于PMA時，GABARAP-L1的表達沒有增加(C-D)。

與通過暴露于PMA來特異性誘導患者細胞中Nix的表達一致，在CCCP的存在下施用10nM PMA的細胞表現出線粒體質量和線粒體DNA的顯著降低。經檸檬酸合酶分析來評估線粒體質量表明，向對照細胞施用PMA不影響CCCP誘導的線粒體自噬。然而，在缺乏功能性Parkin且在響應CCCP處理時具有受損的線粒體自噬的細胞中，PMA顯著地降低了線粒體質量(以媒介物對照為100％，針對CCCP+PMA相對于CCCP，79.82％±4％相對于103.7％±2％，p<0.01)。類似地，與在對照細胞中觀察到的水平類似(72.79±6％)，當細胞施用PMA時線粒體DNA顯著地減少(以媒介物對照為100％，針對CCCP+PMA相對于CCCP，77.06±4％相對于93.97±5％，p<0.05)。

圖7顯示通過PMA誘導Nix恢復了患者細胞中的線粒體自噬。(A)從媒介物處理的細胞(黑色柱)、CCCP處理的細胞(白色柱)、PMA處理的細胞(灰色)以及用10nM PMA和10μM CCCP(檢驗者(checker))處理24小時的細胞制備細胞裂解物，隨后測量檸檬酸合酶活性。PMA和CCCP的共處理顯著降低了患者細胞和“PINK1突變”細胞中檸檬酸合酶的活性，另外所述降低在單獨的CCCP處理時沒有觀察到。(B)從媒介物處理的細胞(黑色柱)、CCCP處理的細胞(白色柱)、PMA處理的細胞(灰色)以及用10nM PMA和10μM CCCP(檢驗者)處理24小時的細胞分離DNA，隨后使用實時定量PCR進行線粒體DNA的定量。在PMA和CCCP共處理后，線粒體DNA(mtDNA)針對核DNA(nDNA)的相對量，在患者細胞和PINK1突變細胞中顯著減少。在單因素方差分析，隨后進行的事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，NS；不顯著*；p<0.05，以及**；p<0.01。

這些結果表示，施用增加Nix表達的試劑能夠恢復Parkin功能損失相關的受損的線粒體自噬。

實施例7.患者細胞和攜帶PINK1突變的細胞中Nix的敲除廢除了通過特異性誘導Nix所實現的CCCP誘導的線粒體自噬的恢復。

為了評估在用誘導Nix表達的試劑所處理的患者細胞中觀察到的線粒體自噬恢復的特異性，在分離自攜帶parkin復合雜合突變的個體的細胞以及分離自攜帶PINK1純合突變的個體的細胞中評估線粒體自噬。

方法

siRNA-介導的Nix敲除

為了評估豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)-誘導的線粒體自噬恢復的特異性，如上文的實施例5中所概述的，使對照細胞、分離自攜帶parkin復合雜合突變的個體的細胞(“患者”)以及分離自攜帶PINK1純合突變的個體的細胞(“PINK1”)進行siRNA-介導的Nix敲除。簡言之，將細胞暴露于非靶向siRNA(雜亂siRNA)或靶向Nix的siRNA(Nix siRNA)，隨后用CCCP和PMA共處理24小時。

24小時之后收獲細胞，并且如上概述的經通過實時定量PCR測量mtDNA含量來評估Nix的敲除對線粒體自噬的影響。

結果

圖8(A)顯示用雜亂siRNA或靶向Nix的siRNA處理細胞后Nix的表達。實現了Nix的成功敲除。圖8(B)還顯示了，當與各自的Nix siRNA-媒介物處理的細胞相比時，在PMA和CCCP共處理之后，用Nix siRNA處理的患者細胞和PINK1細胞不顯示mtDNA的顯著減少。在單因素方差分析，隨后的事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，NS；不顯著，以及*；p<0.05。

通過PMA和CCCP連續處理，Nix-沉默細胞中mtDNA的量相對于nDNA不存在減少，表明在缺乏功能性parkin或PINK1的細胞中PMA相關的線粒體自噬恢復是Nix特異的。

這些結果確認，在缺乏PINK1/Parkin線粒體自噬通路的細胞中，通過PMA所恢復的線粒體自噬確實是由Nix介導的。

實施例8.Nix的過表達恢復了患者細胞中CCCP誘導的線粒體自噬。

為了確認Nix表達和CCCP誘導的線粒體自噬之間的關系，我們在缺乏功能性parkin的患者細胞(且相對于對照和“攜帶者”細胞具有有缺陷的Nix表達)中過表達Nix，并且評估在CCCP誘導的線粒體自噬中的變化。

方法

Nix的過表達

將在pCMV6-Nix(Origene；#RC203315)中的野生型Nix cDNA(NM_004331)，亞克隆進含有FLAG標簽的pER4慢病毒載體。使用Lenti-X HTX慢病毒包裝系統(Clontech,Mountain View,CA,USA)和Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，根據生產商的說明書，產生用于表達Nix-FLAG的慢病毒。在轉染后48小時和72小時，收集含有慢病毒的培養基，隨后在測量病毒滴度之前，使用Lenti-X濃縮器(Clontech)進行濃縮步驟。在4μg/mL聚凝胺的存在下，用空的慢病毒載體(pEmpty)或慢病毒Nix-FLAG載體(pNix-FLAG)以每個細胞10個感染單位慢病毒的比例，轉導成纖維細胞24小時，并且用于隨后的實驗。

使用上文概述的方法，評估Nix的過表達對線粒體自噬的功能性影響。簡言之，用CCCP或媒介物將轉導有慢病毒的細胞處理24小時，并且經由通過實時定量PCR測量的mtDNA含量，以及如實施例2中概述的自噬體和線粒體的共定位度來檢查線粒體自噬。

結果

圖9顯示，Nix的過表達恢復了缺乏功能性parkin的細胞(包括患者細胞；“Parkin突變”)和分離自攜帶純合PINK1突變的個體的細胞(“PINK1突變”)中CCCP誘導的線粒體自噬。用含有空載體(pEmpty)或含有Nix-FLAG載體(pNix-FLAG)的慢病毒轉導成纖維細胞。從媒介物處理的細胞和CCCP處理的細胞分離DNA，隨后使用實時定量PCR進行線粒體DNA的定量。(A)在表達Nix-FLAG的Parkin和PINK1突變體中，當與媒介物處理的細胞相比時，在CCCP處理之后，線粒體DNA(mtDNA)相對于核DNA(nDNA)的相對量顯著減少。在單因素方差分析，隨后的事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，NS；不顯著，**；p<0.01。(B)將轉導有慢病毒的表達GFP-LC3(綠色)和RFP-Mito(紅色)的患者細胞，用20μM CCCP處理4小時。在表達Nix-FLAG的患者細胞中觀察到自噬體和線粒體的共定位(右圖中的黃色點)，這表示線粒體自噬的激活，但在表達空載體的患者細胞中沒有觀察到。比例尺：10μm。使用徠卡(Leica)應用套件高級熒光(LAS AF)軟件，從50個單個細胞圖像計算共定位率(C)。CCCP處理后，相比于轉導有空載體的細胞，表達Nix-FLAG的患者細胞呈現顯著高的共定位率。在雙尾學生t-檢驗中，***p<0.001。

圖10顯示Nix的過表達改善Parkin和PINK1突變的成纖維細胞中的線粒體功能。用空慢病毒載體(pEmpty)或Nix-FLAG載體(pNix-FLAG)轉導Parkin和PINK1突變細胞，并且培養72小時。在毛地黃皂苷-透性化的細胞中，在蘋果酸和丙酮酸鹽的存在下，用分光光度法測量線粒體的ATP合成率。當與轉導有空載體的細胞相比時，過表達Nix的細胞顯示ATP合成率的顯著增加。在單因素方差分析，隨后事后Tukey’s HSD多重比較檢驗中，如在圖中所示，NS；不顯著，**；p<0.01，以及相對于表達pEmpty的對照細胞在表達pEmpty的突變細胞中^##；p<0.01。

這些結果表明，向缺乏功能性parkin或PINK1且呈現受損的線粒體自噬和線粒體功能的細胞施用增大Nix表達的試劑，恢復了線粒體自噬和線粒體的功能。

序列表

<110> 北悉尼地方衛生區

<120> 治療或預防神經退行性病癥的組合物和方法

<130> P093792C

<140> AU 2014901398

<141> 2014-04-16

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ser Ser His Leu Val Glu Pro Pro Pro Pro Leu His Asn Asn Asn

1 5 10 15

Asn Asn Cys Glu Glu Asn Glu Gln Ser Leu Pro Pro Pro Ala Gly Leu

20 25 30

Asn Ser Ser Trp Val Glu Leu Pro Met Asn Ser Ser Asn Gly Asn Asp

35 40 45

Asn Gly Asn Gly Lys Asn Gly Gly Leu Glu His Val Pro Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Ile His Asn Gly Asp Met Glu Lys Ile Leu Leu Asp Ala Gln His

65 70 75 80

Glu Ser Gly Gln Ser Ser Ser Arg Gly Ser Ser His Cys Asp Ser Pro

85 90 95

Ser Pro Gln Glu Asp Gly Gln Ile Met Phe Asp Val Glu Met His Thr

100 105 110

Ser Arg Asp His Ser Ser Gln Ser Glu Glu Glu Val Val Glu Gly Glu

115 120 125

Lys Glu Val Glu Ala Leu Lys Lys Ser Ala Asp Trp Val Ser Asp Trp

130 135 140

Ser Ser Arg Pro Glu Asn Ile Pro Pro Lys Glu Phe His Phe Arg His

145 150 155 160

Pro Lys Arg Ser Val Ser Leu Ser Met Arg Lys Ser Gly Ala Met Lys

165 170 175

Lys Gly Gly Ile Phe Ser Ala Glu Phe Leu Lys Val Phe Ile Pro Ser

180 185 190

Leu Phe Leu Ser His Val Leu Ala Leu Gly Leu Gly Ile Tyr Ile Gly

195 200 205

Lys Arg Leu Ser Thr Pro Ser Ala Ser Thr Tyr

210 215

<210> 2

<211> 3505

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

cgtcaggggc aggggaggga cggcgcaggc gcagaaaagg gggcggcgga ctcggcttgt 60

tgtgttgctg cctgagtgcc ggagacggtc ctgctgctgc cgcagtcctg ccagctgtcc 120

gacaatgtcg tcccacctag tcgagccgcc gccgcccctg cacaacaaca acaacaactg 180

cgaggaaaat gagcagtctc tgcccccgcc ggccggcctc aacagttcct gggtggagct 240

acccatgaac agcagcaatg gcaatgataa tggcaatggg aaaaatgggg ggctggaaca 300

cgtaccatcc tcatcctcca tccacaatgg agacatggag aagattcttt tggatgcaca 360

acatgaatca ggacagagta gttccagagg cagttctcac tgtgacagcc cttcgccaca 420

agaagatggg cagatcatgt ttgatgtgga aatgcacacc agcagggacc atagctctca 480

gtcagaagaa gaagttgtag aaggagagaa ggaagtcgag gctttgaaga aaagtgcgga 540

ctgggtatca gactggtcca gtagacccga aaacattcca cccaaggagt tccacttcag 600

acaccctaaa cgttctgtgt ctttaagcat gaggaaaagt ggagccatga agaaaggggg 660

tattttctcc gcagaatttc tgaaggtgtt cattccatct ctcttccttt ctcatgtttt 720

ggctttgggg ctaggcatct atattggaaa gcgactgagc acaccctctg ccagcaccta 780

ctgagggaaa ggaaaagccc ctggaaatgc gtgtgacctg tgaagtggtg tattgtcaca 840

gtagcttatt tgaacttgag accattgtaa gcatgaccca acctaccacc ctgtttttac 900

atatccaatt ccagtaactc tcaaattcaa tattttattc aaactctgtt gaggcatttt 960

actaacctta tacccttttt ggcctgaaga cattttagaa tttcctaaca gagtttactg 1020

ttgtttagaa atttgcaagg gcttcttttc cgcaaatgcc accagcagat tataattttg 1080

tcagcaatgc tattatctct aattagtgcc accagactag acctgtatca ttcatggtat 1140

aaattttact cttgcaacat aactaccatc tctctcttaa aacgagatca ggttagcaaa 1200

tgatgtaaaa gaagctttat tgtctagttg ttttttttcc cccaagacaa aggcaagttt 1260

ccctaagttt gagttgatag ttattaaaaa gaaaacaaaa caaaaaaaaa aggcaaggca 1320

caacaaaaaa atatcctggg caataaaaaa aatattttaa accagctttg gagccacttt 1380

tttgtctaag cctcctaata gcgtctttta atttatagga ggcaaactgt ataaatgata 1440

ggtatgaaat agaataagaa gtaaaataca tcagcagatt ttcatactag tatgttgtaa 1500

tgctgtcttt tctatggtgt agaatctttc tttctgataa ggaacgtctc aggcttagaa 1560

atatatgaaa ttgctttttg agatttttgc gtgtgtgttt gatatttttt acgataatta 1620

gctgcatgtg aatttttcat gaccttcttt acatttttta ttttttattt ctttattttt 1680

ttttctctaa gaagaggctt tggaatgagt tccaatttgt gatgttaata caggcttctt 1740

gttttaggaa gcatcaccta tactctgaag cctttaaact ctgaagagaa ttgtttcaga 1800

gttattccaa gcacttgtgc aacttggaaa aacagacttg ggttgtggga acagttgaca 1860

gcgttctgaa aagatgccat ttgtttcctt ctgatctctc actgaataat gtttactgta 1920

cagtcttccc aaggtgattc ctgcgactgc aggcactggt cattttctca tgtagctgtc 1980

ttttcagtta tggtaaactc ttaaagttca gaacactcaa cagattcctt cagtgatata 2040

cttgttcgtt catttctaaa atgtgaagct ttaggaccaa attgttagaa agcatcagga 2100

tgaccagtta tctcgagtag attttcttgg atttcagaac atctagcatg actctgaagg 2160

ataccacatg ttttatatat aaataattac tgtttatgat atagacattg atattgacta 2220

tttagagaac cgttgttaat tttaaaacta gcaatctata aagtgcacca ggtcaacttg 2280

aataaaaaca ctatgacaga caggtttgcc agtttgcaga aactaactct tttctcacat 2340

caacatttgt aaaattgatg tgttatagtg gaaaataaca tatagattaa acaaaatttt 2400

tatctttttt caagaatata gctggctatc tttaagaaag atgatatatc ctagttttga 2460

aagtaatttt cttttttctt tctagcattt gatgtctaaa taattttgga catctttttc 2520

ctagaccatg tttctgtctt actcttaaac ctggtaacac ttgatttgcc ttctataacc 2580

tatttatttc aagtgttcat atttgaattt ctttgggaag aaagtaaatc tgatggctca 2640

ctgatttttg aaaagcctga ataaaattgg aaagactgga aagttaggag aactgactag 2700

ctaaactgct acagtatgca atttctatta caattggtat tacagggggg aaaagtaaaa 2760

ttacacttta cctgaaagtg acttcttaca gctagtgcat tgtgctcttt ccaagttcag 2820

cagcagttct atcagtggtg ccactgaaac tgggtatatt tatgatttct ttcagcgtta 2880

aaaagaaaca tagtgttgcc ctttttctta aagcatcagt gaaattatgg aaaattactt 2940

aaaacgtgaa tacatcatca cagtagaatt tattatgaga gcatgtagta tgtatctgta 3000

gccctaacac atgggatgaa cgttttactg ctacacccag atttgtgttg aacgaaaaca 3060

ttgtggtttg gaaaggagaa ttcaacaatt aatagttgaa attgtgaggt taatgtttaa 3120

aaagctttac acctgtttac aatttgggga caaaaaggca ggcttcattt ttcatatgtt 3180

tgatgaaaac tggctcaaga tgtttgtaaa tagaatcaag agcaaaactg cacaaacttg 3240

cacattggaa agtgcaacaa gttcccgtga ttgcagtaaa aatatttact attctaaaaa 3300

aatgagaatt gaagacttag ccagtcagat aagttttttc atgaacccgt tgtggaaatt 3360

attggaatta actgagccaa agtgattatg cattcttcat ctattttagt tagcactttg 3420

tatcgttata tacagtttac aatacatgta taacttgtag ctataaacat tttgtgccat 3480

taaagctctc acaaaacttt aaaaa 3505

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Lys Phe Gln Tyr Lys Glu Asp His Pro Phe Glu Tyr Arg Lys Lys

1 5 10 15

Glu Gly Glu Lys Ile Arg Lys Lys Tyr Pro Asp Arg Val Pro Val Ile

20 25 30

Val Glu Lys Ala Pro Lys Ala Arg Val Pro Asp Leu Asp Lys Arg Lys

35 40 45

Tyr Leu Val Pro Ser Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Tyr Phe Leu Ile

50 55 60

Arg Lys Arg Ile His Leu Arg Pro Glu Asp Ala Leu Phe Phe Phe Val

65 70 75 80

Asn Asn Thr Ile Pro Pro Thr Ser Ala Thr Met Gly Gln Leu Tyr Glu

85 90 95

Asp Asn His Glu Glu Asp Tyr Phe Leu Tyr Val Ala Tyr Ser Asp Glu

100 105 110

Ser Val Tyr Gly Lys

115

<210> 4

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

cagctctagc gaaaagccgc cggtatttct ccatctggct ctcctctacc tccaggcagg 60

ctcacccgag atccccgccc cgaacccccc ctgcacactc ggcccagcgc tgttgccccc 120

ggagcggacg tttctgcagc tattctgagc acaccttgac gtcggctgag ggagcgggac 180

agggtcagcg gcgaaggagg caggccccgc gcggggatct cggaagccct gcggtgcatc 240

atgaagttcc agtacaagga ggaccatccc tttgagtatc ggaaaaagga aggagaaaag 300

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gtgcctgatc tggacaagag gaagtaccta gtgccctctg accttactgt tggccagttc 420

tacttcttaa tccggaagag aatccacctg agacctgagg acgccttatt cttctttgtc 480

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gaagactatt ttctgtatgt ggcctacagt gatgagagtg tctatgggaa atgagtggtt 600

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tcccttctct ttgggcagag attctatttt tgacatttgc acaagacagg tagggaaagg 1020

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cagacatcac agtaccaccc caggggtggc agtagacaac aacccagaaa tttagacagg 1200

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gcatttccaa ttgtagacta aaaccactct tagcatctcc tctagtattt tccatgtatc 1440

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tctcattcag gattcttgct cccatgctgc tgtcccttca ggctcacatg cacaggaatg 1560

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accttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1885

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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tcttctgact gagagctatg gtc 23

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gacgccttat tcttctttgt c 21

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gggagaccaa aagcttcat 19