膜聯蛋白A5M2單倍型的攜帶狀態及產科風險的制作方法

本發明涉及在孕前或孕后確定父母(男性和女性)的膜聯蛋白A5M2單倍型攜帶狀態，以使妊娠并發癥的風險最小，所述妊娠并發癥包括但不限于，習慣性流產(RPL)、不孕(例如，不明原因的男性不育、不明原因的女性不育、不明來源的不孕)體外受精(IVF)失敗、宮內人工授精(IUI)失敗、胎兒生長受限(FGR)、小于胎齡(SGA)新生兒、宮內胎死(IUFD)、妊娠高血壓(GH)、先兆子癇(PE)和/或靜脈血栓栓塞(VTE)。一旦確定M2攜帶狀態，則可以在懷孕前后使用包括給予低分子量肝素(LMWH)和/或其它抗凝血劑的干預方法。進一步還涉及提高活產率和/或體外受精(IVF)比率的方法、和/或降低臨床流產的方法。還涉及給予患者和/或配偶的M2攜帶狀態檢查攜帶狀態的方法，以及診斷和/或預后的方法。
背景技術：
：血栓形成傾向(Thrombophilias)是不良妊娠結果的主要原因(Markoffetal,2011)，有增加證據顯示，胎盤血管損害增加了習慣性流產(RPL)、宮內胎死(IUFD)、妊娠高血壓(GH)、先兆子癇(PE)、靜脈血栓栓塞(VTE)、胎兒生長受限(FGR)及小于胎齡(SGA)新生兒的風險(Younisetal,2003；Grandoneetal,2003；Chinnietal,2009；Tisciaetal,2009；Grandoneetal,2010；Tisciaetal,2012)。正常妊娠是獲得性高凝狀態，因此，具有遺傳性易感血栓的婦女在妊娠過程中或在產后期可能發生新發的凝血缺陷的臨床癥狀(Reyetal,2003；Chunilaletal,2009)。在許多臨床研究中已經報道了遺傳性血栓因子的易感作用(Rodgeretal,2010)，并且在大多數患者中遺傳子一直以來是萊頓第五因子FactorVLeiden(FVL)或凝血素(PTm)(Bicketal,2000)。然而，在2007年發現了習慣性流產(RPL)和附加的血栓相關的產科并發癥的遺傳因子(Bogdanovaetal,2007；Chinnietal,2010)。該命名為M2單倍型的缺陷是膜聯蛋白A5ANXA5基因核心啟動子中的序列變異。其包括核心啟動子的四個連續核苷酸取代，并且導致M2單倍型攜帶者與非攜帶者相比ANXA5基因在胎盤中表達降低。膜聯蛋白A5是具有結合鈣和磷脂特性的膜聯蛋白家族成員。主要在腎臟、肝臟和胎盤中廣泛分布(Morganetal,1998)。在母體和胎盤之間交界處的胎盤合體滋養細胞的頂膜上最豐富。ANXA5最遲被命名為“胎盤抗凝血蛋白”。其在體內和體外被廣泛研究(Thiagarajanetal,1990；Romischetal,1991)。其具有與磷脂結合活性相關的潛在抗凝血特性，并且是少數在細胞外被發現的膜聯蛋白之一(Gerkeetal,2005)。ANXA5在細胞膜上形成二維聚集的能力導致了ANXA5“防護罩”模型的發展，該模型假設ANXA5屏蔽在該位點的磷脂不能進行凝結反應，因此有助于維持胎盤總血液流動性。ANXA5在抗磷脂綜合征(APS)患者的胎盤中時缺少的，并且抗磷脂抗體介導的血管內皮上的膜聯蛋白5減少可能也導致全身性血栓形成(Rand,1999)。Bogdanova等(2012)重新審定了膜聯蛋白A5防護罩模型，并報道了30個患有產科APS的狼瘡樣抗凝患者((LAC陽性)組的初步基因型分析，顯示30個患者中11位是M2攜帶者，相對于產生產科抗磷脂抗體(aPA)風險的三倍。在檢測胎盤組織的非常基本的數據中，Markoff等(2010)不僅顯示M2/ANXA5胎盤(包括患FGR和PE的婦女的胎盤)中ANXA5表達減少是M2單倍體攜帶的結果，也顯示并非僅僅是母性來源，無論父母來源，這都可能發生胚胎誘導風險的結果。他們觀察到，正常的ANXA5等位基因并未補償觀察到的M2等位基因特異性減少的信使RNA水平，并且顯示與父母的血栓基因不與RPL相關的FVL和PTm不同(Tothetal,2008)，M2/ANXA5經胚胎起作用。這導致了30對RPL夫婦的試點研究，其中排除了所有RPL的其他因素(包括遺傳性血栓形成癥和APS)。在該小且非動力的抽樣中，研究顯示，與對照群體相比，這些RPL夫妻中的男性和女性都可能具有等同的增加的M2攜帶關系。作者推斷，父母攜帶M2/ANXA5單倍體可能與RPL相關，并且提供等同的風險。他們進一步假設，M2/ANXA5可能是通過影響胚胎抗凝血而導致妊娠病理的遺傳因子的第一個實例(Rogenhoferetal,2012)。Ueki等于2012年在其敲除的鼠模型中發現，在ANXA5空白(ANXA5-KO)的鼠中產仔數和胎兒重量都顯著降低，因此說明，母本向循環提供ANXA5對于維持正常妊娠時關鍵的。他們進一步觀察到，ANXA5-KO和WT雜交，顯示僅僅使用ANXA5-KO父本交配的幼仔降低了幼仔數目。他們也顯示，在妊娠期12、14及16天時向ANXA5-KO鼠給予肝素顯著提高幼仔數目。然而，當這些動物研究延伸至人類時，使用低分子量肝素并未顯示有益效果。例如，在Lancet雜志的Rodger等的研究中報道，“以前公布的高質量證據”存在，顯示對于以前妊娠丟失過的婦女、之前非中毒或晚發型子癇前期的婦女或者之前低于第5至第10百分數之間的小胎齡兒的婦女，產前的低分子肝素無有益效果(參見，,Rodgeretal,"AntepartumDalteparinVersusNoAntepartumDalteparinForthePreventionOfPregnancyComplicationsInPregnantWomenWithThrombophilia(TIPPS):AMultinationalOpen-LabelRandomisedTrial,'"Lancet2014Nov8；384(9955):1673-83)。因此，作者設計了一個充分有力的研究(花費12年實施)，從而最終以統計學證據回答了這個開放性的問題。Rodgers等專門解釋：我們的隨機試驗首先顯示之前沒有靜脈血栓形成的血栓形成傾向的女性并不從產前低分子量肝素中收益。我們的薈萃分析顯示，較低質量的證據顯示，低分子量肝素可能預防周期性嚴重的胎盤介導的妊娠并發癥(嚴重或早期發生的先兆子癇、低于第5百分數的小胎齡兒、以及胎盤早剝)，但是我們在我們試驗的亞組分析中并未記錄該益處。Rodgers等第9頁作者進一步闡述：該試驗闡述了在大的易患患者組中的關鍵質量問題。缺少益處是一個重要的發現。在20世紀90年代中期發現血栓易形成癥與妊娠并發癥之間相關導致低分子量肝素在之前患有妊娠并發癥的患或不患血栓易形成癥的女性中廣泛地適應癥外使用。這種適應癥外的使用更受到這些并發癥的情緒后果、并結合專家意見、共識小組和顯示有益的小的非隨機研究共同推動。產前低分子量肝素并非是良性干預；其可能并發肝素誘發的血小板減少癥(heparin-inducedthrombocytopenia)(雖然很少),硬膜外鎮痛(withholdingofepiduralanalgesia)、以及如我們試驗所示的,增加的輕度出血、過敏反應、皮膚反應、增加肝轉氨酶濃度、和引產風險。此外，每妊娠期高達400次皮下注射藥物既是身體又是經濟負擔。臨床醫生和患者可以放心在整個產前期試使用低分子量肝素不會導致骨礦物質密度的顯著改變。最后，治療無效的持續的信念阻礙了對有靜脈血栓風險和妊娠并發癥女性的有效治療的進一步研究。Rodgers等第8頁。因此，需要降低與ANXA5M2單倍型所導致的易栓癥相關的妊娠并發癥的改進方法。發明概述發明概述提供了以下詳細說明中進一步描述的簡化形式的概念選擇。該概述非意欲指出要求保護的主題的關鍵特征和重要特征，也非意欲確定要求保護的主題的范圍。本發明涉及治療M2單倍型妊娠的方法，其中，如果生物學母親或生物學父親被確定是ANXA5M2單倍型攜帶者，則確定為M2單倍體妊娠，然后M2單倍體型母親被給予有效劑量的抗凝血劑。令人吃驚并且與其他臨床試驗所得的結果相反，如果在懷孕、宮內人工授精、胚胎移植和/或著床之前立即給予、在懷孕時同時給予、和/或在懷孕后立即給予抗凝血劑，則活產率顯著提高。在一些實例中，發現生物學母親和生物學父親都是A5M2單倍型攜帶者。本發明的其他具體實施例包括降低產前并發癥的方法，包括鑒定M2單倍型妊娠，其中，當生物學母親或生物學父親之一為A5M2單倍型攜帶者時，則存在所述M2單倍型妊娠，然后M2單倍體型母親被給予有效劑量的抗凝血劑，其中，所述抗凝血劑降低產前并發癥的風險。優選地，在懷孕、宮內人工授精、胚胎移植和/或著床之前、同時或之后立即給予抗凝血劑。在其他實施例中，給予抗凝血劑至少4周、8周、12周或16周。產前并發癥的實例包括但不限于：習慣性流產(RPL)、不孕、體外受精(IVF)失敗、宮內人工授精(IUI)失敗、胎兒生長受限(FGR)、小于胎齡(SGA)新生兒、宮內胎死(IUFD)、妊娠高血壓(GH)、先兆子癇(PE)和/或靜脈血栓栓塞(VTE)。本發明的其他優選實施例包括確定M2單倍型妊娠的方法，包括鑒定生物學母親或生物學父親的M2單倍體攜帶狀態，其中，基于基因組分析進行所述鑒定；記錄生物學母親或生物學父親的M2單倍體攜帶狀態；如果生物學母親或生物學父親之一為A5M2單倍型，則報告是否存在M2單倍體妊娠。檢測的優選方法包括測序、PCR和/或SNP檢測技術。一旦確定M2攜帶狀態，則可以妊娠前和/或后施用包括給予低分子量肝素(LMWH)和/或其他抗凝血劑的本發明的方法。優選地，在懷孕、宮內人工授精、胚胎移植和/或著床之前、同時或之后立即給予抗凝血劑。因此，進一步涉及增加活產率和/或體外受精植入和/或臨床妊娠和/或降低臨床流產的方法。在其他實施例中，抗凝血劑增加移植率。在另一實施例中，抗凝血劑降低胎心檢測之前流產率。例如，在優選實施例中，A5M2單倍型妊娠的母親在使用方法檢測早期妊娠確定妊娠后立即就盡快給予抗凝血劑。在其他實施例中，在IVF的設置中，在胚胎轉移的同時給予抗凝血劑。甚至在進一步的優選實施例中，在妊娠前或在IVF的設置的胚胎轉移前就給予抗凝血劑。在其他具體實施方式中，直到母親生產嬰兒之前都一直給予抗凝血劑。在其他優選實施例中，所述抗凝血劑為低分子量肝素(LMWH)。在優選實施例中，抗凝血劑作為體外受精的部分給予。在IV治療過程中，可以在胚胎轉移的同時、之前或數日內給予母親LMWH。優選地，如LMWH的抗凝血劑給藥與胚胎轉移同時發生。在其他實施例中，LMWH被給藥至少4周、8周、12周或16周。在其他實施例中，直至母親生產前一直給藥。附圖說明圖1描述Carcedo(2001)在Biochem.J.356,571-579和BogdanovaN、HorstJ、ChlystunM、CroucherPJ、NebelA、BohringA、TodorovaA、SchreiberS、GerkeV、KrawczakM、MarkoffA(SEQIDNO:1))所公開的ANXA5啟動子結構。膜聯蛋白(ANXA5)基因啟動子的常見單體型與習慣性流產相關。(HumMolGenet2007；16:573-78)如在Bogdanova中所報道，圖1顯示了ANXA5基因核心啟動子區域的結構。以垂直線條標示邊界，并且根據第一個轉錄起始位點(tsp1)進行編號。不翻譯的外顯子以灰色陰影遮蓋。轉錄因子共識基序為小字體打印，轉錄因子的相應縮寫在序列信息上方以斜體顯示。Notl和BamHI限制性位點標以下劃線，啟動子中的Z-DNA延伸以斜體顯示。核苷酸標記轉錄起始點(tsp)標記下劃線。啟動子功能重要的區域(motifsAandB)涵蓋295-311和328-337位置的核苷酸。M2ANXA5啟動子單倍體中改變的核苷酸以粗體標示，替換的核苷酸在各自位置的上方以黑體大寫字母標示。在Bogdanova等中，M2ANXA5單倍型替換位置指定19G→A、1A→C、27T→C及76G→A(例如，參見574頁結果”下面的第一段)，以及相應于如圖1所示的243G→A、262A→C、288T→C和337G→A。同樣，這些相同的取代也稱作：(1)在US2012/0178156的SEQIDNo.2的186核苷酸所對應的位置處由G至A；(2)在US2012/0178156的SEQIDNo.2的203核苷酸所對應的位置處由A至C；(3)在US2012/0178156中SEQIDNo.2的229核苷酸所對應的位置處由T至C；以及(4)在US2012/0178156的SEQIDNo.2的276處的核苷酸所對應的位置處有G至A。詳細說明在以下的說明中詳細描述本發明的一個或多個實施例。通過說明書和附圖以及權利要求清晰闡述本發明的其他特點、目的和優點。在詳細描述本發明之前，可以理解，本發明并不限于具體列舉的材料或方法參數，當然可以改變。也應該理解，此處所使用的術語僅為了詳細描述本發明的實施例，并不意欲限制使用替換術語描述本發明。通過引用，所有出版物、專利和此處引用的專利，無論上下，都包含于此。如該說明書及附加的權利要求所使用的，除非清楚指明，否則單數形式的“一”、“一個”以及“某個”也包括復數的指引。例如，指引“多聚核苷酸”包括兩個或多個此多聚核苷酸分子的混合物，或多個所述多聚核苷酸分子。如此處所使用，術語“包括”或其變體指包含任意引用的整數(如特征、原件、特點、特性、方法/方法步驟或限制)，但不排除任何其他整數或整組整數。因此，如此處使用，術語包括為開放性的，不排除方法/方法步驟中的其他未引用的整數。在此處提供的任何組成和方法的實施例中，“包括”可以替換為“主要組成”或“組成”。此處使用的術語“主要組成”要求特定的整數或步驟，以及此外的基本不影響要求保護的發明的特征或功能的內容。如此處使用，術語“組成”指出現列舉整數(如特征、原件、特點、特性、方法/方法步驟或限制)或單獨的整數(如特征、原件、特點、特性、方法/方法步驟或限制)組。進一步詳細描述本發明。A.定義在本發明中，“M2單倍體妊娠”或“ANXA5M2單倍體妊娠”定義為生物學母親和/或生物學父親為膜聯蛋白ANXA5M2單倍體攜帶者的妊娠。認為“M2單倍體妊娠”包括生物學母親尚未妊娠的情況。并且，對于代孕母親，捐贈的卵子和/或精子都應該檢測，以及受體母親自己的風險也需檢測。在本發明中，“膜聯蛋白A5M2單倍體型”、“M2單倍體型”或“ANXA5M2單倍體型”(SEQIDNo.2)被定義為膜聯蛋白(“ANXA5)啟動子的取代，其中，取代為：(i)在圖1的243核苷酸所對應的位置處的G到A的點突變；(ii)在圖1的262核苷酸所對應的位置處的A到C的點突變；(iii)在圖1的288核苷酸所對應的位置處的T到C的點突變；以及(iv)在圖1的337核苷酸所對應的位置處的G到A的點突變。在本發明中，“M1單倍體型”、“為膜聯蛋白A5M1單倍體型”或“ANXA5M2單倍體型”(SEQIDNo.3)也在WO2006/053725andBogdanova等中公開，并且特征在于以下兩個核苷酸互換(1)在圖1的262核苷酸所對應的位置處的A到C，和(2)在圖1的288核苷酸所對應的位置處的T到C。在本發明中，“抗凝血劑”定義為用于防止血塊形成或防止已形成的血塊增大的藥物。抗凝血劑藥物通過阻礙凝血因子或血小板的作用而防止血塊形成。抗凝血劑藥物包括三組：凝血因子抑制劑、凝血酶抑制劑和抗血小板藥物。例如，可以在胚胎轉移或IUI的同時(例如同時和/或在同一過程中)給予凝血劑，或者在懷孕、植入、IUI、胚胎轉移、將要懷孕和/或學習妊娠后立即服用抗凝血劑(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天內)。直至生產前母親可以一直服用抗凝血劑。此外，可以在準備懷孕、懷孕、植入、IUI和/或胚胎轉移之前就服用凝血劑(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天內)。抗凝血劑的優選實例包括但不限于低分子量肝素(LMWH)或阿司匹林，優選低劑量阿司匹林。在特定的優選實施例中，給予妊娠母親低分子量肝素(LMWH)。可以從多種市售來源購買LMWH。在本發明中，患者可以在整個妊娠中每日都服用LMWH，直至基于治療醫生判斷生產前不久。M2單倍體型的女性攜帶者在生產后也應接受LMWH，并服用六周，以降低靜脈血栓栓塞(VTE)的風險。可以在胚胎轉移或IUI的同時(例如同時和/或在同一過程中)給予LMWH，或者在懷孕、植入、IUI、胚胎轉移、將要懷孕和/或學習妊娠后立即服用LMWH(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天內)。LMWH可以施用至少4、8、12或16周。LM而已WH可以一直施用至生產前。此外，可以在準備懷孕、懷孕、植入、IUI和/或胚胎轉移之前就及時施用LMWH(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天內)。如此處所使用，詞語“同時”限定為經歷過受精、IUI、懷孕和/或胚胎移植的數小時內。優選地，“數小時內”限定為經歷過受精、IUI、懷孕和/或胚胎移植30min、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時內。如此處所使用，“宮內人工授精”或“IUI”指一種類型的人工授精，其中，約在卵子從卵巢釋放時直接將精子濃縮液置入子宮或陰道。可以使用或不使用荷爾蒙和/或其他藥物(例如克羅米芬(Clomid))實施IUI，以增加卵巢釋放的卵子的數目。在本發明中，“產科并發癥”限定為在妊娠過程中由于血栓易形成癥和/或胎盤血管而導致的并發癥。產科并發癥的實例包括但不限于：習慣性流產(RPL)、不孕、體外受精(IVF)失敗、宮內人工授精(IUI)失敗、胎兒生長受限(FGR)、小于胎齡(SGA)新生兒、宮內胎死(IUFD),妊娠高血壓(GH)、先兆子癇(PE)和/或靜脈血栓栓塞(VTE)。在本發明中，抗凝血劑有效增加植入率。在其他實施例中，抗凝血劑有效降低早期流產(即檢測到胎心之前)的比率。在本發明中，“不孕”被限定為：夫妻甚至通過監控排卵和/或通過使用荷爾蒙或其他藥物(例如克羅米芬(Clomid))以增加妊娠幾率嘗試懷孕是都不能懷孕。不孕的實例包括但不限于：不明原因的男性不育、不明原因的女性不育和/或不知來源的不孕。可以理解，在此處描述的實施例的上下文中，此處所提及的“生物學父親”使女性個體妊娠。因此，如此處所使用，術語“生物學父親”含義為此處限定的女性個體的人類胚胎的生物學父親。在一些實施例中，女性個體已經妊娠，因此為“生物學母親”。在其他實施例中，女性個體還未妊娠，因此，為準“預期的生物學母親”。因此，術語“預期的生物學父親”的含義為人類雄性個體還未使雌性個體妊娠，但是預期所述男性個體將使女性個體妊娠。在此期間，女性個體也是“預期的”生物學母親。一旦所述男性個體使所述女性個體妊娠，則“預期的生物學父親”成為“生物學父親”，“預期的生物學母親”成為“生物學母親”。因此，本發明的方法包括以下情況：其中預期的生物學父親還未使母性個體妊娠，即女性和/或預期的生物學母親和預期的生物學父親計劃在妊娠前檢測母性個體患產科并發癥的傾向。例如，這包括計劃妊娠的夫婦或計劃通過自然生育或體外受精懷孕的女性。本發明的方法可以用于增加活產率，以提高植入的發生率、提高臨床妊娠的發生率，和/或降低臨床流產的發生率。在本發明中，術語“活產”限定為無論嬰兒是否足月都成功分娩成活嬰兒。“臨床流產”限定為受精胚胎(例如，在體外受精過程中的胚胎移植)是否導致臨床流產或活產。當確定妊娠后，例如可以通過超聲波掃描檢測胎心確認患者的“臨床妊娠”時期。本發明中“植入”指胚胎附著于子宮壁的能力(即使暫時的)。本發明的方法進一步包括女性個體已經妊娠的情況。此時，此時可能仍舊想通過檢測生物學父親的樣本或檢測胚胎的胚性樣本(例如通過循環胎細胞、絨毛膜切片、或羊膜穿刺，都獲得胚胎來源的樣品)檢查女性個體患產科并發癥的傾向。此外，但不排除也設想檢測(預期的)生物學母親。如果在體外進行受精，即體外受精，也設想在胚胎植入所述母體之前分析在體外受精胚胎的桑胚期之前或桑胚期獲得的單細胞樣品。“桑胚期”指人胚胎分化的16細胞階段。“桑胚期或之前”含義是設想獲得人胚胎分化的16-細胞期之前的、例如6-8細胞期的單細胞樣品。體外受精(IVF)是公知技術，其中，卵細胞在體外由子宮外的精子受精。也可以想到，意欲通過精子捐贈懷孕的女性在捐贈精子用于各女性個體的體外受精之前，利用本發明的方法通過檢測各個精子捐贈樣品而檢測其產科并發癥的傾向，然后在懷孕、宮內植入、胚胎轉移和/或植入的同時、之前或之后立即以抗凝血劑治療。因此，本發明以及本發明的具體方法也包括選擇非風險單體型M2攜帶者的精子捐贈的分層方法。因此，通過本發明的方法，能夠檢測、繼而選擇精子捐贈者，捐贈者在所有的可能性方面不能增加各個女性個體患產科并發癥的傾向。這些分析方法在母親的母性樣品已經檢測不攜帶風險單體型M2時更尤其有意義，因為，此時檢測預期的生物學父親(例如精子捐贈者)是否為上述風險單體型是非常重要的。如果這樣，之后能夠理智的選擇不同的精子捐贈者，優選不限定風險單體型M2的精子捐贈者。同樣，當生物學母親(或預期的生物學母親)不攜帶風險單體型M2(如母性樣本所測)時，在本發明的實施例中也是理智并具體設想檢測預期的生物學父親或生物學父親。也可以想到，意欲通過捐贈卵子懷孕的女性在捐贈卵子用于體外受精之前，利用本發明的方法通過檢測各個卵子捐贈者的基因型而檢測其產科并發癥的傾向。因此，本發明以及本發明的具體方法也包括選擇非風險單體型M2攜帶者的卵子捐贈的分層方法。因此，通過本發明的方法，能夠檢測、繼而選擇卵子捐贈者，捐贈者在所有的可能性方面不能增加各個女性個體患產科并發癥的傾向。這些分析方法在母親的母性樣品已經檢測不攜帶風險型單體M2時更尤其有意義，因為，此時檢測預期的生物學卵子捐贈者是否為上述風險單體型是非常重要的。如果這樣，之后能夠理智的選擇不同的卵子捐贈者，優選不限定風險單體型M2的卵子捐贈者。同樣，當生物學母親(或預期的生物學母親)不攜帶風險單體型M2(如母性樣本所測)時，在本發明的實施例中也是理智并具體設想檢測預期的生物學父親或生物學父親。在本發明中，母親及父親都可以導致女性個體患產科并發癥的傾向。因此，即使女性并不是風險單體型(母性樣品所測)的攜帶者，生物學父親和/或預期的生物學父親仍可能導致上述風險，因而也應檢測。如果胚胎的生物學父親或胚胎的生物學母親為風險單體型的雜合攜帶者，則也可以測試所述胚胎的樣品(如絨毛膜切片樣品或此處所描述的單細胞樣品)，以測試其是否為風險單體型的攜帶者(例如體外受精的實例)。如果生物學母親或生物學父親之一為風險單倍體型的純合攜帶者，則似乎也不必測試胚胎了，因為風險單倍體型M2的雜合出現已經說明各個女性個體具有產科并發癥的傾向。如果生物學父親不知或不可追查，進一步女性個體(生物學母親的情況)為非M2風險單倍體型的攜帶者，一方可能仍想檢測各女性個體患產科并發癥的傾向。此時，想得到測試胚胎來源的樣品(例如循環胚胎血細胞，絨毛膜切片或羊膜穿刺樣品)。然而，因為女性個體意欲檢測其患產科并發癥的傾向性，因此可以理解，應優選不僅僅獲得胚胎樣品。當由于其他原因胚胎樣品已經在手邊時，應想到只測試該樣品。在本發明中，習慣性流產(RPL)典型的特征是出現兩次貨或多次妊娠以胎兒流產終止。所述兩次或多次妊娠或連續發生或間隔發生，優選連續發生。在本發明中，先兆子癇(PE)為在妊娠中發生高血壓(妊娠誘導性高血壓)的醫學疾病。胎兒生長受限(或胎兒生長滯后)為其中胎兒未按比例生長的疾病。例如，當基本高度小于預期超過3cm時，應懷疑FGR。想得到在本發明的方法中，所述樣品為來自一方(父親或母親)的血液樣品，精液樣品，組織樣品，或細胞樣品。應理解只要各樣品包含允許本發明的方法檢測/診斷的遺傳物質，則任何生物樣品都適合。所述樣品可以經活檢獲得，如針吸活檢、手術活檢，經任何類型的圖片技術獲得，例如通過頰粘膜拭子等，或其他。本領域普通技術人員可以知曉其他能夠從人體獲得含遺傳物質的設備或方法。本領域普通技術人員也知道如何避免或防止污染，例如，"可從美國醫學遺傳學學院獲得產前檢查的通用標準和指南(2006EditionofStandardsandguidelinesforclinicalgeneticslaboratories,http://www.acmg.net/Pages/ACMG_Activities/stds-2002/g.htm)"，其總結了相應標準。B.檢測方法如WO2006/053725和BogdanovaN、HorstJ、ChlystunM、CroucherPJ、NebelA、BohringA、TodorovaA、SchreiberS、GerkeV、KrawczakM、MarkoffA所公開，膜聯蛋白(ANXA5)基因啟動子的常見單體型與習慣性流產相關。在HumMolGenet2007；16:573-78中，在人ANXA5啟動子中可以檢測到的風險單體型M2的特征在于以下四個核苷酸變化：(1)在圖1的243位核苷酸所對應的位置處的G到A；(2)在圖1的262位核苷酸所對應的位置處的A到C；(3)在圖1的288位核苷酸所對應的位置處的T到C；以及(4)在圖1(SEQIDNO：2)的337位核苷酸所對應的位置處的G到A。WO2006/053725和Bogdanova等也公開了在人ANXA5啟動子中也可以檢測到的風險單體型M1，并且特征為以下兩個核苷酸的變化：(1)在圖1的262位核苷酸所對應的位置處的A到C，以及(2)在圖1(SEQIDNO：3)的288位核苷酸所對應的位置處的T到C。確定和/或檢測M2單倍體型的裝置和方法是公知的(例如，參見WO2006/053725和Bogdanova等)，并且此處也詳細公開。“核苷酸檢測技術”對于本領域普通技術人員是公知的，包括其他任何類型的基于PCR技術，或任何其他能鑒定風險單體型M2的特征核苷酸變化的技術。本發明描述了此方法(參見實施例)，并且在WO2006/053725中公開。所述技術可以選自非限定組，舉例包括：雜交技術，核酸測序，PCR，限制性片段測定，單核苷酸多態性(SNPs)-測定，LCR(連接鏈反應)，或限制性片段長度多態性(RFLP)-測定。可以從標準技術建議文獻中獲得相應的實例和進一步詳細內容(例如Sambrook,Russell"MolecularCloning,ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(2001)；Ausubel,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1989)，或者HigginsandHames(Eds.))。如WO2006/053725的實施例所述，其他適合的方法為包括確定BamHI限制性位點的限制性片段測定或RFLP方法。如WO2006/053725所示，測定BamHI限制性位點的缺失(BamHI’)或存在(BamHI+)，并且作為本文所限定點突變缺失或出現的指征。方法的細節參見WO2006/053725的實施例。在具體實施例中，相關DNA片段通過PCR技術由基因組DNA擴增。所使用的潛在引物包括但不限于SEQIDNO:4(ANX5.P.F；WO2006/053725的SEQIDNO:22)和SEQIDNO:5(ANX5.exl.R；WO2006/05372的5SEQIDNO:23)所提供的引物。本領域普通技術人員易推導其他使用的引物對或引物，以擴增此處限定的膜聯蛋白A5(ANXA5)啟動子的相關片段或其片段。獲得擴增子后(參見實施例)，可以使用限制性酶BamHI消化(限制性消化)擴增子(限制性酶BamHI可以從RocheAppliedScience，Mannheim，Germany；MBIFermentas,St.Leon-Rot,Germany；NewEnglandBiolabs,FrankfurtamMain,Germany及其他供貨商獲得。詳細內容參見試驗部分。消化后根據本領域公知的方法運載(參見Sambrook/Russel,2001,(log.cit.)及其他)，進一步通過本領域常規技術，例如凝膠分析，例如瓊脂糖凝膠，分析BamHI/BamHI+限制位點。在本申請的上下文中具體想得到的其他技術為由IHGPharmaco確定的SNP檢測技術。所述技術在2006/038037和US7,803,545中充分說明，通過引用整體包含于本文中。具體地，在使用IHG技術的基因分型中，從主體獲得核酸樣品，擴增含多態性位點的基因片段，以提供負載基因片段的序列的擴增子群。典型地，通過使用與所述基因片段側翼相接的引物對通過PCR實現基因片段的擴增。經考慮選擇基因片段的特異性的適合引物。選擇引物擴增長度為90～400堿基、優選100～150堿基的基因片段。通常優選多態位點位于基因片段的中心區域，也認為接近基因片段的中部三分之一。總所周知，基因片段的PCR擴增導致雙鏈擴增子群。PCR擴增方法的更詳細內容參見WO93/19201。當被檢測的核酸是哺乳動物基因組DNA時，DNA樣品取自具有目的特異性特點的基因型的個體或其他部位。(術語“個體”意欲包括胚胎)DNA可以提取自所有有核細胞。典型地，方便起見，DNA取自外周血細胞。胚胎DNA可以取自胎盤細胞或羊水。其他DNA來源包括毛囊、干尸等。可以通過任何適合的方法分離DNA，例如，通過Miller等描述的快速鹽析出法(Miller,S.,Dykes,D.andPolesky,H.(1988)"AsimplesaltingoutprocedureforextractingDNAfromhumannucleatedcells"；Nucl.AcidsRes.16:1215)。可選擇地，可以通過逆轉錄酶將DNA以cDNA從mRNA中分離。也提供了IHG分子群，所述IHG分子群具有與基因片段相應的序列，但是如本文所述被修飾以包括調控核苷酸取代，刪除，插入或其組合。典型地，通過使用如PCR的擴增制備IHG群。在WO93/19201中也可以找到用于PCR擴增的更詳細的方法，其通過引用整體包含于本文。選擇PCR擴增所用引物，以提供IHG分子的擴增。優選地，IHG的長度可以與被研究的基因片段的長度基本相同(無論IHG的任何必要的插入或刪除的堿基)，或者長度不同，例如比基因片段短或長。然而，如果基因片段和IHG的長度不同(無論IHG的任何必要的插入或刪除的堿基)，則必須有足夠程度的重疊，以使在基因和IHG的擴增體之間形成異源雙鏈。分別擴增IHG和基因片段所用的引物可以相圖或不同。然而典型地，使用同樣的引物，從而獲得長度基本相圖(無論IHG的任何必要的插入或刪除的堿基)擴增的IHG和基因片段，如WO93/19201所教導，可以標記所述引物。基因片段和IHG的PCR擴增可以在同一或獨立的容器中完成(分別為“混合”或“獨立”PCR)。優選分別進行擴增，然后合并基因片段和IHG的擴增群，以可以形成異源雙鏈。如在含多態性位點的IHG和基因片段的混合群之間形成異源雙鏈通過以下步驟完成：首先，加熱IHG和基因片段的混合群，以將雙鏈DNA分離為單鏈DNA，然后冷卻，以形成異源雙鏈，例如，如WO–A-93/19201所述。根據其分子構象分離形成的異源雙鏈，所述分子構象影響其表觀分子量，但不影響實際分子量。例如，可以通過電泳實現分離。典型地，異源雙鏈的分離在如非變性聚丙烯酰胺凝膠的未充分變性凝膠上實現。在使期望分辨率的雙鏈溶液有效的條件下進行電泳。分離“表觀大小”不同——由其不同分子構象所導致——的雙鏈的分辨率通常為10bp的大小。通常大小標記也跑凝膠，以估量遷移率，及因此估量雙鏈的表觀尺寸。此外，或可選擇地，也可以使用PCR單獨擴增具有研究基因的已知等位基因的相應序列的對照DNA分子，以與所用的IHG形成異源雙鏈，然后所得樣品跑凝膠，以為所得的不同異源雙鏈提供凝膠上的標記。異源雙鏈的分布，即分辨率布圖，為等位基因特異性的。該分辨率布圖或PCR指紋接下來可以可視化。當PCR引物被標記時，可以顯示標記。攜帶分離的被標記雙鏈的底物與檢測標記存在的實際接觸。當PCR引物未標記時，負載了PCR指紋的底物在紫外光下可以與溴化乙錠或SYBRTM綠(可從MolecularProbes獲得)及可視化的核酸片段接觸；可選擇地，異源雙鏈可以通過銀染可視化。檢測M2單倍體型狀態的其他方法包括但不限于利用熒光分子和/或固相的方法。優選的固相結構可以為珠和/或盤。固相可以包括塑料、硅、玻璃、聚苯乙烯、鋁、鋼、鐵、銅、鎳、銀、金、纖維素或尼龍。此外，可以使用長度至少為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30個核苷酸的寡核苷酸片段檢測ANXA5M2單倍體型。此外，檢測ANXA5M2單倍體型狀態的方法可以包括利用新一代測序技術(NextGenerationSequencingtechnique)的方法。這些檢測方法是本領域普通技術人員已知的。具體實施方式實施例1、研究人群在2012年3月至2013年2月從就診于五個生育診所的患者中招募研究對象。獲得了所有患者的知情同意。在此期間，314為患者(157對夫婦)之前至少患有1次IVF周期(平均1.9IVF和0.2IUI)。獲得了詳細的臨床病史、以及是否有M2/ANXA5單倍體型攜帶的基因分型，并且形成了部分不孕的診斷調查。女性的平均年齡為36.3歲(從23～49歲)，其男性伴侶的平均年齡為38.6歲(從23～64歲)。女性的平均體重指數為25.5(從19～40.5)，其男性伴侶的平均體重指數為33.7(從21～36).基于其以前的病史以及患者的被檢測的意愿選擇進行篩查的患者，在咨詢時向其詳細說明研究本質。女性患者篩選抗磷脂抗體。在不育性方面，大多數男性群體為少精(oligospermia)(48％)、弱/少弱精子(27％)、無精(13％)。不育隨攜帶狀態改變，非攜帶者的發病率分別為41％、26％、和11％；攜帶者的發生率分別為35％、12％和12％的攜帶者。關于女性群體，最普遍的是不明原因(27％)、卵巢儲備不足(17％)、PCOS(11％)和子宮內膜異位癥(6％)。不育隨攜帶狀態改變，非攜帶者的發病率分別為30％、16％、16％和3％；攜帶者的發病率分別為26％、9％、18％和8％。這些患者主要為白種英國人(77％男性和75％女性)，印度/巴基斯坦人(8％)，其余為多種族人。整體而言，這種分類代表了UK和愛爾蘭的人口統計。實施例2、收集DNA以及確定M2攜帶狀態脫氧核苷酸(DNA)從夫妻的血液樣品中收集(第一群組)，其余組在特定收集紙上進行口腔細胞分析。進行詳細的實驗室檢查，以確保口腔細胞的轉移不發生數據質量的破壞。使用QIAmpDNAbloodminikit(QiagenGmbH,Hilden,德國)從白細胞或收集紙的洗脫液中提取DNA。以100ng的基因組DNA作為模板進行PCR反應，所述基因組DNA通過利用QIAmpDNAbloodminikit(QiagenGmbH,Hilden,德國)從白細胞分離，或者從收集試紙純化，包含于后續PCR反應中。使用Biotaq聚合酶進行PCR反應(Bioline.BiolineReagentsLimited,London,GreatBritain)，反應體積為25μ，L包含10xNH4緩沖液:160mM(NH2SO4,670mMTris-HCl(pH8.8),50mMMgCL2(終濃度為1.5mM)，50pM引物(正、反向引物)，200μΜdNTP's，聚合添加劑(Bioline)及2.5單位的Biotaq聚合酶。PCR循環條件為：94℃for45s,94℃30s、60℃30s、68℃1min，30個循環，最后延伸7分鐘。使用ZymoZR-96DNACleanandConcentratorkit(ZymoResearchCorporation.Irvine,California,美國)通過標準柱層析方法純化PCR產物。純化的擴增子在ABI3730x1DNA分析儀上、利用標準條件的ABIBigDyeterminatorchemistryv3.1測序。以ABISeqscapev2.5.(AppliedBiosystems,FosterCity,California,USA)進行痕跡分析和基因分型。調查M2單倍體型的出現(在ANXA5基因啟動子中4個連續核苷酸組的改變:243G/A[rsll2782763],262A/C[rs28717001],288T/C[rs28651243]及337G/A[rsl13588187])(SEQIDNO:2)。當四個突變中僅兩個(262A/C,288T/C)出現時，定義為單倍體型Ml(SEQIDNO:3)。利用Seqscape軟件(AppliedBiosystems,FosterCity,California,USA)以25％的混合堿基調用閾值進行所有基因型調用。如文中所述，Seqscape被編程用于分析4個特異性堿基的核苷酸變異。結果以突變報告形式產生，詳細說明了目的區域內的突變。通過室內LIMS系統(實驗室信息管理系統)實現報告產生，編程設置該系統僅允許特定組合的突變。LIMS系統標記任何給出預料外結果的樣品，并且在以新鮮樣品重復檢查前，由操作員核查。實施例3、基因型及統計分析M2/ANXA5單倍體型的雜合或純合攜帶者的患者被記錄為雜合或純合攜帶者。使用Guo和Thompson(1992)的方法進行Hardy-Weinberg偏差測試(也由Bogdanova等，2007，及Rogenhofer等2012，使用)。我們在單獨和整體考慮的男性和女性組內進行該測試。也檢測了非UK種族以外的個體，以觀察是否對結果有影響。由于過量的M2雜合型，但是特別是M2純合型(觀測9個V.預測3.4個)，因此IVF女性患者未在HWE中(p＝0.0052)。為了核查女性亞組中觀察到的顯著HWE偏差是否導致意外，我們從整體(男性女性混合的)中重新隨機抽樣155個，并且使用相同的方法評估HWE偏差的p值，并記錄該p值。重復該過程1000次，其中，僅3個記錄的p值較所有女性組的觀測p值更極端，因此說明，女性的HWE偏差是真實的，且不導致風險。Rogenhofer等在2012年由從石荷州基爾大學診所(UniversityClinicSchleswig-HolsteinKiel)的PopGen生物樣品庫所提取的人口控制樣品(n＝533)使用這些用于對比的對照。PopGen人口對照來自德國西北，并且是通過官方人口注冊鑒定的健康個體(Krawczaketal2006)。該研究中所使用的樣品包括分布于三個年齡組(18-30、30-50及50-80歲)的數目幾乎相等的男性和女性。明斯特繁殖對照組為來自機構注冊的匿名個體(Rogenhofer,等2012)，他們都具有成功的妊娠，沒有文件記錄的習慣流產史。實施例4、患者基因型頻率在314位患者及157對夫婦中(由于4位男性(無精子2，少精1，65歲1)；2位女性：1位早期絕經，1位絕經，因此，6位患者未被基因定型)，綜合患者攜帶率為25％(N＝78)，與女性(24％N＝37)和男性的(27％N＝41)幾率類似。然而，在這些夫妻中，有高M2攜帶率(44％；n＝69)(規定為一方或雙方都為M2攜帶者或純合基因型)。在這些測試患者中，沒有陽性抗磷脂指征(APS)。在這些攜帶者中，夫妻分亞組為，其中，一方為非攜帶者，一方為純合型的(4％N＝7)；或者雙方都是攜帶者(4％N＝6)；或者一方是攜帶者，一方為純合型的(2％N＝3)。有9個女性純合型，和一位男性和女性患者的基因型分布如表1所示。表1男性/女性患者的基因型分布基因型NM1M2指ANZXA5基因啟動子單倍體型：N＝標準/野生型M1包括262A→C及288T→C(6個雜合型)M2包括243G→A、262A→C、288T→C和337G→A(16個雜合型)表2顯示了男性和女性中分別出現的HWE預測的基因型以及觀察到的基因型頻率。在男性中，無顯著的HWE偏差，但是在女性中偏差顯著(p＝0.005)。將分析限制到英國和愛爾蘭種族分析給出同樣的結果(數據未顯示)。表2男性和女性中觀察的和HWE預測的基因型統計，經馬爾可夫蒙特卡羅(MCMC)計算的用于檢測偏離HWE的估計p值NS＝非統計顯著注釋數值為數字(百分率)在本研究中包括的IVF夫妻和兩個不同的對照組的ANXA5基因啟動子單倍體型基因型頻率如表3所示。注釋數值為數字(百分率)預測值對應于HWE所預測的值與明斯特對照組(女性)和PopGen對照組(男性和女性)相比，M2單倍體型在男性和女性IVF患者中都豐富。由于過量的M2雜合型，但是特別是M2純合型(觀測9個V.預測3.4個)，因此IVF女性患者未在HWE中(p＝0.0052)。為了核查女性亞組中觀察到的顯著HWE偏差是否導致意外，我們從整體(男性女性混合的)中重新隨機抽樣155個，并且使用相同的方法評估HWE偏差的p值，并記錄該p值。重復該過程1000次，其中，僅3個記錄的p值較所有女性組的觀測p值更極端，因此說明，女性的HWE偏差是真實的，且不導致風險。表4顯示了患者之前的IVF、IUI及妊娠史。之前失敗IVF周期的數目在一個純合型的和一個非攜帶的夫妻(平均3.1的以往IVF)和南方為攜帶者的夫妻(平均2.1的以IVF)中最高。表4患者以往IVF和IUI周期及妊娠史*妊娠流產標注值為數字、(平均值)或(平均值，范圍)所有攜帶者/純合組(范圍0-4)的過往活產率非常低，非攜帶者夫妻(N＝13)觀察到稍高的比率。在攜帶者夫妻中，在17例報道了流產日期的流產中，患者最近報道的流產平均發生在10.1周(范圍是5-23周)。在非攜帶者夫妻中，在53例流產的25例中，流產(N＝53)平均發生在9周。實施例5、男性不育和M2攜帶頻率157位男性中的63位(40％)具有不育相關因子。在本組中攜帶幾率為27％(N＝17)，整體而言，少精是最常見的原因(40％N＝不孕男性中的25位)，之后為少弱精(OATS-13％，N＝不孕男性中的8位)。在157位男性患者中，93位(57％)具有除不明原因或男性原因的不孕。此外，93為具有該診斷中的23名(27％)患者也發現為M2攜帶者。不明原因的卵巢儲備差/排卵失敗經常與年齡相關，加之PCOS是在兩組不孕中最常引用的原因。然而，男性不育在非攜帶者組的21％中被引為主要的不孕原因，但是在攜帶M2單倍體型的37名攜帶者中僅1名被標記為不孕原因。17個PCOS實例(35％)中的6個也是攜帶者。實施例6、不明原因不孕和M2攜帶頻率104名患有(33％)顯示為不明原因的不孕。其中，38位患者(37％)鑒定為M2攜帶者；25為男性(24％)和13位女性(13％)。有9個女性純合型(所有女性中的6％)。也有一位49歲的男性純合型，盡管其女性配偶具有2次導致流產的IVF周期，但是該對夫妻沒有其他已知的確診。實施例7、主要結果在這組患者中，單倍體型M2/ANXA5的攜帶率為44％，代表非常高的發病率。此外，單倍體型M2/ANXA5的攜帶率在男性不育患者中為27％，在女性不育患者中為27％，在以及過往不明原因不育患者中為37％。在本研究攜帶M2單倍體型的患者中，沒有檢測到APS陽性。在RPL組中為未見、在對照組中幾乎未見M1/M1基因型。在習慣性流產組中未見M1/M2基因型，對照組中總共僅8例見此基因型，在該IVF組中僅見4例此基因型。然而，M2純合型女性患者的發病率在該組中提供了6％，記錄到一位男性M2純合型。女性純合型頻率比其它對照組高3倍，是習慣性流產女性組的兩倍(Rogenhofer等2012)。我們證實了PopGen和明斯特對照組的應用，如Nelis等(2009)所總結，即可以鑒定四個地區1)中、西歐，2)波羅的海國家、波蘭及西俄，3)芬蘭，以及4)意大利，如果不糾正群體間差異，則將影響疾病基因相關的顯著性。來自德國、意大利南部和保加利亞的——三個地區的代表——公開研究的對照組發病率都已顯示M2單倍體型頻率的一致性。大多數IVF患者為白種英國人(77％男性，75％女性)。起相應于中、西歐地區。我們沒有芬蘭患者，并且利用或未利用印度/巴基斯坦或其它亞組的分析在女性中顯示顯著的HWE偏離，但是由于豐富的M2純合型，在男性患者中未顯示偏離。在種族方面，我們在除印度和巴基斯坦患者以外的包括猶太、土耳其和中東患者的廣泛種族中發現M2攜帶者。因為發病率和病理方面可能存在顯著差異，從而攜帶率的可能差異和在這些種族中的臨床影響進一步證明了調研。歐洲高加索人群的發病率已確定(Markoffetal,2011)，并且Myamura等(2011)報道，單倍體型的攜帶在日本人群中導致與中歐人群所觀察相似的習慣性流產風險；但是，人群發病率較低(5.5VS15％)。因此，除了白種歐洲人及日本人以外的不同種族的進一步研究被證實。因為重點往往是管理及提供健康的配子和胚胎，選擇最優胚胎存活率，以及確保能夠維持妊娠的健康子宮，因此在IVF實踐中，任何對胚胎凝聚的損失都是非常重要的。然而，盡管流產最大的單因被認為是非整倍體胚胎，但是其它因素也是非常顯著的，尤其對于RPL，其中，甚至在IVF后的整體胚胎轉移后，其仍然是個問題。相對最近發現的遺傳因子M2/ANXA5正在通過對胚胎抗凝血的副作用單獨影響胎盤功能，并且，如果未檢測到，則否定了用于通過IVF建立健康妊娠的相當多的工作和導致的花費。在我們的研究中，男性和女性之間等量分布了相當多的患者，其中，M2攜帶或者是已確定的附加因素，或者在許多未有其它不孕診斷的患者中出現。有越來越多的攜帶M2/ANXA5單倍體型對母親健康有風險的證據(RPL,VTE,PE,GHAPS:Tisciaetal,2009；Grandoneetal,2010；Bogdanovaetal,2012)。Bogdanova等(2012)推測攜帶M2/ANXA5單倍體型導致暴露的磷脂酰絲氨酸表面的ANXA5覆蓋減小，這種減小的防護將使凝聚因子競爭磷脂結合。其次，磷脂抗原因子將會更大的暴露，這會導致aPA形成，反過來進一步干擾ANXA5防護。Sifakis等(2010)證明mRNA表達在標準和FGR妊娠之間的顯著差異，但是在ANXA5蛋白水平沒有差異。然而，作者沒有確定其樣品的M2/ANXA5基因型。此外，在IVF治療前，ANXA5攜帶患者的亞組鑒定是重要的，因為本研究可知這些攜帶者的IVF周期失敗率高于非攜帶者。我們在此報道了單一男性純合型患者，其沒有其他不孕診斷，其女性配偶以前已有2次失敗的IVF周期。因此，鑒定或治療自身為M2攜帶者、或其男性配偶為攜帶者的女性患者可以有助于通過減輕對胚胎抗凝聚的副作用而減少小于胎齡(SGA)的發病率。由于缺陷是胚胎傳遞的，并且影響胚胎抗凝血，并且風險與任何特定父母傳輸無關，即，如果傳輸是父親或母親的(或兩者)，則可能胚胎誘導，因此，篩查患IVF的雙方是否攜帶M2/ANXA5單倍體型對于以其自己的配子進行治療的夫婦應被認為是常規、早期的診斷工作。M2單倍體型似乎是導致妊娠失敗的附加獨立因子。實施例8、以LMWH治療的M2單倍體型患者的初始結果數據檢測患者的M2單倍體型，并且分為兩組。一組為“治療組”，包括63名患者。這些患者都檢測了M2單倍體攜帶者，并且在胚胎轉移的同時進行LMWH治療。第二組為“未治療組”，包括62名患者，都檢測了M2單倍體攜帶者，但未進行LMWH治療。對比治療組和未治療組，未治療組(35歲)比治療組(36.1歲)年輕一整歲，并且未治療組(4.24)患不孕比治療組(5.24)也少一整年。參見表5，此外，治療組中的15名患者具有已知為“胚胎發育觀察(embryoscope)”的時間推移胚胎培養，同時僅1名治療組的患者具有“胚胎發育觀察”。治療組的15名患者中的7名也有時間推移胚胎培養過程至臨床妊娠和活產。然而兩組表現兩種特征。首先，未治療組具有0.38的過往流產平均值，治療組具有0.52的過往流產平均值。其次，未治療組的過往IVF周期均值為2.7，治療組的過往IVF周期均值為2.6。甚至對于前述的最小差異和密切相似性，與全球30～35％平均值相比，治療組具有38％的提高的活產率，同時未治療組沒有患者實現活產。表5主要結果數據因此，認為以抗凝血劑(有選LMWH)治療的母親，其中母親或父親為M2單倍體型攜帶者，將具有改進的臨床妊娠率和/或改進的活產率。在優選實施例中，母親在胚胎專一的同時、或轉以后立即或及時被治療。給予LMWH至少4周、8周、12周或16周。以如LMWH的抗凝血劑治療能夠增加臨床妊娠的可能性，和/或降低流產率，因而增加活產的幾率。我們的結果與Rodgers的結果直接對比。使用如LMWH的抗凝血劑的進一步治療可以用于提高正進行體外受精的母親的成功妊娠率，和/或活產率。預計雙方都是M2單倍體型攜帶者的患者在懷孕之前、同時和/或數周內最受益于如LMWH的抗凝血劑治療。表6實施例9、以LMWH治療的M2單倍體型患者的結果數據的統計分析統計分析125名胚胎轉移患者的最終結果數據，將這些患者分為2組；測試/治療組63名患者(50.4％)，參照(或對照)組62人(49.6％)。最終的數據延伸上述結果用于期中分析。數據組不僅包括妊娠結果的信息，也記錄總結患者的人口統計和治療史的附加變量。這些數據組的分析集中在3種特定終點：活產；臨床流產；以及成功的植入。3種特定終點的限定如下。活產終點為說明胚胎移植是否導致活產的雙變量。活產終點的分析包括所有胚胎轉移的患者。臨床流產為說明胚胎轉移是否導致臨床流產或活產的雙變量。臨床流產的分析僅包括那些到達臨床妊娠階段(即，超聲波掃描檢查到胎心率的情況)的患者。對于每個胚胎轉移的患者，一個、兩個或三個胚胎移入患者體內。然后，植入發生率限定為檢測到胎心率的數目除以轉移的胚胎數目。在分析前，植入發生率轉化為成功的植入終點。成功的植入終點為說明每個轉移胚胎的植入是成功或失敗(即，是否檢測到胎心率)的雙變量。在成功植入的分析中包括每個轉移的胚胎。除研究組(治療/對照)外，也研究以下獨立變量(患者地理分布和治療史)，以確定獨立變量之間，以及與上述限定的三種終點是否相關。患者年齡M2單倍體型結果(男性和女性)。獲得患者(男性)及其配偶(女性)的M2單倍體型結果。以下分組標注由Fishel等(2014)應用，這些患者被劃分為：雙方攜帶者；僅男性攜帶者；僅女性攜帶者；一個純合型，一個攜帶者；以及僅一個純合型。發現在“一個純合型，一個攜帶者”(8個觀測值)和“僅一個純合型”(4個觀測值)類別中患者很少，因此將這些患者再分組為單一純合型類別(“僅一方純合型，或者一個純合型/一個攜帶者”)。轉移胚胎的數目。這些變量被分為2類：一類是那些具有1個轉移胚胎的胚胎轉移患者；一類是那些具有2個或3個轉移胚胎的胚胎轉移患者。孵育器類型不孕時間(年數)過往IVF周期數目：根據患者是否具有0、1、2、3或4或更多的過往IVF周期將該變量分為5類。過往流產的數目：根據患者是否具有0、1、2或更多的過往流產將該變量分為3類。胚胎轉移：對于每個轉移的胚胎，記錄胚胎類型。這些胚胎記錄為：桑葚胚、胚囊或轉移細胞的數目。如果觀察許多類別，則產生單一變量，將胚胎轉移分為胚囊轉移的胚胎轉移，和非胚囊轉移。由于在轉移之內分屬胚胎的胚囊轉移是一直的，因此需要單一變量(無論轉移的胚胎的數目)。使用脂肪乳劑：在治療組中國，33個胚胎轉移與接受脂肪乳劑的患者相關。確定大多數情況，這些患者由于具有免疫問題而被給予脂肪乳劑，以及其更可能與妊娠結果相關。因此，將這些患者按照是否因免疫問題而以脂肪乳劑治療分為兩類。兩名患者被鑒定因非臨床原因接受脂肪乳劑，因而不包含在“因免疫問題以脂肪乳劑治療”的類別。捐贈卵子使用對于每個終點，利用獨立變量進行相關性的個體測試(經單變量回歸模型)，以評估其作為結果的單獨預測因子的統計學顯著性。所有分析的三個終點為雙變量。此時，適合邏輯回歸模型，其使用邏輯變換以獨立變量的線性函數表達結果(即活產)的可能性。在單因素試驗后，使用多重邏輯回歸模型評估結果的獨立變量的收集預測準確性。這可以實現研究組對具有每一結果的可能性的潛在影響的調查，并且也解釋了(并預測影響)其它獨立變量。僅那些在單一變量分析中發現為統計學顯著的變量(至少10％顯著水平的讓步比，即，要求觀察到的影響是由于不到10％的唯一可能的概率)被考慮用于該多重變量模式的總結。對于多重邏輯回歸模型，使用反向逐步回歸算法，其以包括所有從單一變量測試中鑒定為顯著的獨立變量的模型開始，然后將其從模型中連續移除，以確定提供最佳擬合的模型。使用可能性比率測試(具有5％顯著水平，即，要求觀察到的影響是由于不到5％的單一可能性的概率)確定模型擬合，確保僅對最終模型的性能有主要影響的變量被包含。在125名具有胚胎轉移記錄的患者中，有34位在兩個研究組都都被觀察到。這意味著在研究中有的患者經歷兩次IVF，一次沒有研究治療，一次治療。這些患者的多個妊娠結果并不是獨立的，因而不能在統計模型中當作獨立結果對待。為了解釋數據的重復性特質(每個患者的多個觀察值)，使用線性混合效應模型，包括對每個患者的隨機影響，以模型化在其多重應答中的關聯。在許多實例中也鑒定到了分離。當可以通過獨立變量分離二重結果時，在邏輯回歸中發生分離。當分離正確時，發生完全分離，反之，當結果被分離到一定程度，例如，當對分類變量的一個因素的所有應答都具有相同結果時，發生擬完全分離(Heinze&Schemper,2002)。如以下所述，在該研究中，活產僅發生在治療組的患者，并非是發生在對照組。因此，通過獨立變量“研究組”分離雙重結果“活產”。類似地，對照組中所有達到臨床妊娠階段的患者具有臨床流產，因此通過獨立變量“研究組”也分離了“臨床流產”當分離時，通過最大可能性擬合的標準邏輯回歸模型能夠產生無限的或偏見的預估。分離是邏輯回歸的常見問題，并且樣品大小越小、越多二分類變量、及越多極端的讓步比，在其分布中有更大的不平衡則更可能發生。有很多處理分析中的分離觀點。首先，這些導致分離的情況可以從分析中被忽略。然而，此時，因為這意味著關于該重要獨立變量的作用的信息本不存在，因此這樣是不恰當的，并且由于該變量的影響無法調節其他獨立變量的影響。此外，這意味著扔掉數據、減少模型的預測能力。因此，兩個其他的可選擇方案是，Firth’s偏離減少，最大程度懲罰了邏輯回歸(Fisher,1992,1993)，或Bayesian邏輯混合效應模型(Fong等2010；Zhao,等2006)。在該實例中，選擇后者，因為，如上所述，Bayesian方法提供了更靈活的框架，不僅處理分離，而且包括模型中的隨機效應，從而解釋了一些患者的重復觀測值。Firth’s邏輯回歸模型不能包含隨機效應。使用Bayesian邏輯混合效應模型確實要求指定固定和隨機效應的先驗分布。此時，由于沒有其他可用信息，因此選擇標準分布用于固定效應和隨機效應的默認的扁平先驗(FlatPriors)。成功的植入終點并未顯示任何被考慮的獨立變量的分離。然而，出于與其他結果一致，Bayesian邏輯混合效應模型也用于該終點。此時，更標準的方法應是標準邏輯混合效應分析。使用該方法再次運行分析，并發現產生了與Bayesian模型一致的結果。在統計軟件包R版本3.1.1((RCoreTeam,2013)進行所有分析。blme包的bglmer功能用于執行Bayesian邏輯混合效應模型(Dorie,2014)。活產率如表7所示，在本研究中，125名記錄的胚胎轉移患者的妊娠結果劃分為研究組。在125名記錄的胚胎轉移患者中，令人吃驚的是，在治療組中25/63(39.7％)導致活產，而對照組(62人中)沒有活產。數據顯示，對對照組相比，估計治療組患者的成功活產幾率約高56倍(OR＝56.08；95％CI:4.95,635.64)(p＝0.0012)。表7研究組中胚胎轉移患者的妊娠結果此外，與轉移一個胚胎的胚胎轉移患者相比，估計轉移兩個或多個胚胎的胚胎轉移患者的活產可能性高2.7倍(OR＝2.69；95％CI:1.00,7.23)(p＝0.050)。表8活產與轉移的胚胎數目的交叉表，n(column％)轉移的胚胎數目12/3活產患者6(11.3)19(26.4)非活產患者47(88.7)53(73.6)總數54(100)72(100)此外，過往IVF周期的數目與成功活產的幾率正相關。與沒有相比，估算具有兩個過往周期的患者的幾率高四倍(OR＝4.04；95％CI:0.89,18.37)(p＝0.0711)；與沒有相比，估算具有兩個過往周期的患者的幾率高7.5倍(OR＝7.46,95％confidenceinterval:1.66,33.55)(p＝0.0088)。表9活產比過往IVF周期的交叉表，n(column％)此外，與沒有相比，估計具有一個過往流產的患者的成功活產的幾率高2.4倍(OR＝2.37,95％CI:0.91,6.15)(p＝0.0773)。表10活產比過往流產的交叉表n(column％)與未使用脂肪乳劑的患者相比，脂肪乳劑的使用(由于免疫問題)與3倍的成功活產幾率相關(OR＝3.02,95％CI:1.19,7.64)(p＝0.0199)。如表11所示，與沒有使用脂肪乳劑的患者的14.9％，使用脂肪乳劑(由于免疫問題)的患者的活產比例是35.5％。然而，所有這些使用脂肪乳劑的患者在治療組中。如表11所示，僅看在治療組中的患者，這些比例分別為35.5％，對43.8％。表11與未使用捐贈卵子的患者相比，捐贈卵子使用患者與4倍的成功活產幾率相關(OR＝4.03,95％CI:0.93,17.46)(p＝0.0622)。表12：活產對捐贈卵子使用的交叉表n(column％)捐贈卵子使用YesNo活產患者4(50.0)21(17.9)非活產患者4(50.0)96(82.1)總數8(100)117(100)與未使用捐贈卵子的患者相比，捐贈卵子使用患者與4倍的成功活產幾率相關(OR＝4.03,95％CI:0.93,17.46)(p＝0.0622)。因此，數據表明，研究組(例如，在胚胎移植/植入時給予低分子量肝素治療)對于活產是統計學顯著的預測因子，與對照組的患者相比，預計研究組的活產幾率高56倍(OR＝56.08；95％CI:4.95,635.64；p＝0.0012)。如果對照組的活產幾率為1-89(即，p＝l/90＝l.ll％并且l-p＝89/90＝98.89％；給予模塊統計的幾率),OR＝56，則治療組的活產幾率為56倍，或接近1.59(即，p＝34.7/90＝38.6％，l-p＝55.3/90＝61.4％)。因此，對于導致成功妊娠的對照組中的每一妊娠，平均89個不活產，但是，對于導致成功妊娠的治療組的每一妊娠，僅平均1.59不活產。臨床流產在40個具有胚胎轉移的達到立場妊娠階段的患者(即通過超聲波掃描檢測到胎心跳)之中，12/12(100％)的對照組的患者導致臨床流產，治療組的比例為3/28(10.7％)。與對照組相比，估計治療組患者的臨床流產幾率低0.01倍(即，99％)(OR＝0.010；95％CI:0.001,0.135)(p＝0.0005)。表13與研究組相對的臨床流產的交叉表n(column％)研究組治療對照活產患者25(89.3)0(0)非活產患者3(10.7)12(100)總數28(100)12(100)因此，數據表明，研究組(例如，給予低分子量肝素治療)對于臨床流產是統計學顯著的預測因子，與對照組的患者相比，預計研究組的臨床幾率低0.01倍(即，99％)(OR＝0.010；95％CI:0.00079,0.135；p＝0.0005)。成功植入在199名胚胎轉移患者中，36/104(34.6％)的治療組的患者導致成功植入(檢測到胎心率)，12/95(12.6％)的對照組的患者導致成功植入。因此，與對照組的患者相比，預計治療組的胚胎移植患者的成功植入幾率高4.1倍(OR＝4.08；95％CI:1.85,8.97；p＝0.0005)。表14相對于研究組的成功植入的交叉表n(column％)研究組治療對照檢測到胎心率的轉移胚胎36(34.6)12(12.6)未檢測到胎心率的轉移胚胎68(65.4)83(87.4)總數104(100)95(100)因此，數據表明，研究組對于成功植入(即如果胚胎植入，檢測到胎心率)是統計學顯著的預測因子，與對照組的患者相比，預計研究組的成功植入幾率約高4倍(OR＝4.08；95％CI:1.85,8.97；p＝0.0005)。參考文獻：Bick,R.L.,2000.DRWMetroplexRe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