包封修飾的環糊精復合物的脂質體組合物及其應用的制作方法

本申請要求2014年1月14日提交的美國臨時申請號61/927,233的優先權益，其內容通過引用結合到本文中。

權利聲明

本發明是在政府支持下，在由美國國立衛生研究院(NIH)授予的資助CA 043460、CA 057345和CA 0062924下進行的。美國政府具有本發明的某些權利。本聲明包括在內僅為遵守37 C.F.R. § 401.14(a)(f)(4)且不應視為本申請公開和/或要求僅僅一個發明的主張或認可。

發明背景

目前對開發用于藥物傳遞的納米顆粒有廣泛的興趣(Heidel和Davis (2011) Pharm. Res. 28:187-199; Davis等(2010) Nature 464:1067-1070; Choi等(2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:1235-1240; Chertok等(2013) Mol. Pharm. 10:3531-3543; Hubbell和Langer (2013) Nat. Mater. 12:963-966; Mura等(2013) Nat. Mater. 12:991-1003; 和Kanasty等(2013) Nat. Mater. 12:967-977)。本研究領域特別涉及癌癥藥物，其中治療比率(對有效性所需的劑量與造成毒性的劑量比)通常是低的。與用游離藥物通過多種機制實現的治療比率相比，攜帶藥物的納米顆粒可增加這種治療比率。特別是，由納米顆粒傳遞的藥物由于增強滲透和滯留(EPR)效應，被認為選擇性地提高藥物在腫瘤中的濃度(Peer等(2007) Nat. Nanotech. 2:751-760; Gubernator (2011) Exp. Opin. Drug Deliv. 8:565-580; Huwyler等(2008) Int. J. Nanomed. 3:21-29; Maruyama等(2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63:161-169; Musacchio和Torchilin (2011) Front. Biosci. 16:1388-1412; Baryshnikov (2012) Vest. Ross. Akad. Med. Nauk. 23-31; Torchilin (2005) Nat. Rev. Drug Disc. 4:145-160; Matsumura和Maeda (1986) Cancer Res. 46:6387-6392; Maeda等(2013) Adv. Drug Deliv. Rev. 65:71-79; Fang等(2003) Adv. Exp. Med. Biol. 519:29-49; 和Fang等(2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63:136-151)。提高的滲透性由泄漏的腫瘤血管系統產生，而提高的滯留性由特征為惡性腫瘤的紊亂淋巴系統產生。

目前在這一領域的大量工作是致力于設計用于納米顆粒生成的新材料。這種新一代的納米顆粒可攜帶藥物，特別是那些不溶于水性介質的藥物，它們難以結合到傳統的納米顆粒如脂質體中。然而，老一代的納米顆粒有一個重大的實際優勢，即它們已在人類進行了廣泛的測試并受到監管機構如美國食品和藥品管理局和歐洲的歐洲藥品署的批準。不幸的是，許多藥物不能容易地或有效地加載到脂質體中，從而影響它們的一般應用。

一般來說，脂質體藥物加載通過被動或者主動的方法實現(Gubernator (2011) Exp. Opin. Drug Deliv. 8:565-580; Kita和Dittrich (2011) Exp. Opin. Drug Deliv. 8: 329-342; Schwendener和Schott (2010) Method. Mol. Biol. 605:129-138; Fahr和Liu (2007) Exp. Opin. Drug Deliv. 4:403-416; Chandran等(1997) Ind. J. Exp. Biol. 35:801-809)。被動加載涉及干燥的脂質薄膜在含有感興趣藥物的水性溶液中的溶解。這種方法只能用于水溶性藥物，且加載的效率往往是低的。相比之下，主動加載可以是極其有效的，導致高的脂質體內濃度和貴重化療劑的最小的浪費(Gubernator (2011) Exp. Opin. Drug Deliv. 8:565-580; Fenske和Cullis (2008) Liposome Nanomed. 5:25-44；和Barenholz (2003) J. Liposome Res. 13:1-8)。在主動加載中，藥物內化到預先形成的脂質體中通常是由跨膜pH梯度驅動的。脂質體外的pH允許一些藥物以非離子化形式存在，能夠跨脂質雙層遷移。一旦在脂質體內，藥物因不同的pH而被電離，就被截留在那里(圖1A)。許多報告已強調脂質體負載對跨膜pH梯度的性質、膜-水分配、內部緩沖能力、藥物的水溶性、脂質組成及其它因素的依賴性(Abraham等(2004) J. Control. Rel. 96:449-461; Haran等(1993) Biochim. Biophys. Acta 1151:201-215; Madden等(1990) Chem. Phys. Lipids 53:37-46; 和Zucker等(2009) J. Control. Rel. 139:73-80)。如在最近的模型中所述的(Zucker等(2009) J. Control. Rel. 139:73-80)，藥物的水溶性是有效的主動加載的必要條件之一。遠程加載成功的另一個關鍵因素是小分子上弱堿性官能團的存在。

只有一小部分的化療劑具有用已建立的技術主動加載所需的特征。這樣的不可電離的藥物主動加載到預形成的脂質體內的嘗試導致差的加載效率(圖1B)。這個問題的一個潛在的解決方案是添加弱堿性官能團至其它未能加載的藥物，這種添加將提供必要的電荷以驅動這些藥物越過pH梯度。然而，藥物的共價修飾常常改變它們的生物學和化學特性，并且在許多情況下是不可取的。

因此，本領域存在對鑒定以高效率和大濃度包封治療劑的脂質體組合物的很大的需求，所述治療劑具有各種化學特性(例如，非離子性和/或疏水性)。

發明概述

本發明部分地基于這樣的發現，即攜帶可電離的官能團(例如，在其溶劑-暴露的表面，例如脂質體內相表面上的弱堿性和/或弱酸性官能團)的環糊精能夠有效地以高濃度包封治療劑(例如，不可電離的和/或疏水的組合物)，以及含有治療劑的官能化的環糊精本身可被有效地以高濃度遠程載入脂質體中，以生成脂質體組合物，其在體內給予時表現出意外地降低的毒性和增強的功效特性(見，例如圖1C)。環糊精是一個通常被用來溶解疏水性藥物的環狀糖的家族(Albers和Muller (1995) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst.12:311-337; Zhang和Ma (2013) Adv. Drug Delivery Rev. 65:1215-1233; Laza-Knoerr等(2010) J. Drug Targ. 18:645-656; Challa等(2005) AAPS PharmSci. Tech.6:E329-E357; Uekama等(1998) Chem. Rev. 98:2045-2076; Szejtli (1998) Chem. Rev. 98:1743-1754; Stella和He (2008) Toxicol. Pathol. 36:30-42; Rajewski和Stella (1996) J. Pharm. Sci. 85:1142-1169; Thompson (1997) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 14:1-104; 和Irie和Uekama (1997) J. Pharm. Sci. 86:147-162)。

在一方面，提供一種包含環糊精、治療劑和脂質體的脂質體組合物，其中脂質體包封具有至少一個面向脂質體內相的、用可電離的化學基團替代的羥基化學基團的環糊精并且其中環糊精包封治療劑。在一個實施方案中，環糊精的至少一個α-D-吡喃葡糖苷單元具有至少一個選自用可電離的化學基團替代的C2、C3和C6羥基化學基團的羥基化學基團。在另一個實施方案中，環糊精的至少一個α-D-吡喃葡糖苷單元具有至少2個選自用可電離的化學基團替代的C2、C3和C6羥基化學基團的羥基化學基團。在又一個實施方案中，環糊精的至少一個α-D-吡喃葡糖苷單元的C2、C3和C6羥基化學基團用可電離的化學基團替代。在還一個實施方案中，環糊精的至少一個α-D-吡喃葡糖苷單元選自環糊精的2、3、4、5、6、7、8個和所有的α-D-吡喃葡糖苷單元。在另一個實施方案中，可電離的化學基團在所有替代的位置是相同的。在又一個實施方案中，可電離的化學基團是弱堿性官能團(例如，具有依據CH₃-X的在6.5和8.5之間的pK_a的基團X)或弱酸性官能團(例如，具有依據CH₃-Y的在4.0和6.5之間的pK_a的基團Y)。在還一個實施方案中，弱堿性或弱酸性官能團選自氨基、乙二氨基、二甲基乙二氨基、二甲基苯氨基、二甲基萘氨基、琥珀酰基、羧基、磺酰基和硫酸官能團。在另一個實施方案中，環糊精具有在4.0和8.5之間的pK_a1。在又一個實施方案中，組合物是液體或固體藥物制劑。在還一個實施方案中，治療劑是不帶電荷的或疏水的。在另一個實施方案中，治療劑是化療劑。在又一個實施方案中，治療劑是小分子。在還一個實施方案中，環糊精選自β-環糊精、α-環糊精，和γ-環糊精。在另一個實施方案中，環糊精是β-環糊精、α-環糊精。

在另一方面，提供一種包含本文描述的脂質體組合物和使用說明書的藥劑盒。

在又一方面，提供一種治療患有癌癥的受試者的方法，其包括給予受試者治療有效量的本文描述的脂質體組合物。在一個實施方案中，治療劑是化療劑。在另一個實施方案中，脂質體組合物通過皮下或靜脈內注射給予。在又一個實施方案中，受試者是哺乳動物。在還一個實施方案中，哺乳動物是人。

附圖簡述

圖1A-1C顯示脂質體主動加載的圖示的實施方案。圖1A顯示使用跨膜pH梯度遠程加載可電離的親水性藥物導致有效的結合。圖1B顯示在圖1A中所示的條件下，難溶性疏水藥物導致極少結合到預形成的脂質體中。圖1C顯示，難溶性藥物包封到可電離的環糊精(R = H，可電離的烷基或芳基基團)中提高其水溶性并允許通過pH梯度的有效的脂質體加載。

圖2A-2C顯示合成的可電離環糊精的實施方案。圖2A顯示形成一些本發明公開的合成可電離環糊精的化學反應的實施方案。圖2B顯示一些本發明公開的合成在其6’-位攜帶可電離基團的可電離環糊精的實施方案。圖2C描述環狀形狀的環糊精。

圖3A-3D顯示修飾的β-環糊精使用跨膜pH梯度的主動加載。圖3A顯示在加載到具有pH梯度的脂質體(檸檬酸脂質體)中的β-環糊精V的熒光(相對熒光單位(RLU))，在pH梯度的不存在下加載到脂質體(PBS脂質體)中的相同化合物的熒光的比較。圖3B顯示動態光散射測量顯示流體動力學半徑的邊際增加，但用環糊精V遠程加載的脂質體的多分散性指數(PDI)沒有變化。圖3C-3D顯示用pH梯度(檸檬酸脂質體; 圖3C)或不用pH梯度(PBS脂質體; 圖3D)加載的丹酰化(dansylated) β-環糊精V的cryoTEM圖像。

圖4通過分析在檸檬酸脂質體對比對照(PBS)脂質體中丹酰化I和環糊精IV的相對熒光單位(RLU)的熒光，顯示結合到檸檬酸脂質體中的丹酰化環糊精。

圖5A-5D顯示使用修飾的β-環糊精，遠程加載不溶性疏水的染料到脂質體中，如通過遠程加載的香豆素102 (圖5A)、香豆素314 (圖5B)、香豆素334 (圖5C)和環己基DNP (圖5D)的熒光強度所示的。插圖顯示含有與環糊精-包封的染料(頂部)或游離染料(底部)孵育的脂質體的小瓶的照片。

圖6顯示各種環糊精轉移香豆素314進入檸檬酸脂質體中的能力。顯示未復合的香豆素314和與III (可電離的單-6-乙二氨基-6’脫氧-環糊精)和I (不可電離的β-環糊精)復合的香豆素314在經遠程加載到檸檬酸脂質體后的相對熒光單位(RLU)的熒光。

圖7顯示BI-2536和PD-0325901的結構和物理特性。

圖8A-8C顯示PLK1抑制劑，BI-2536L的加載和活性。圖8A顯示用BI-2536和CYCL-BI-2536注射的動物的生存數據。所有治療的動物(n = 5)接受單一iv劑量(125 mg/kg)的其游離形式的BI-2536過夜，而單一i.v.劑量的CYCL-BI-2536在類似的劑量(125 mg/kg; n = 5)或更高的劑量(500 mg/kg; n = 5)不引起任何急性毒性的體征。圖8B顯示用2個i.v.劑量(由箭頭指示的那些天)的(i) 空脂質體、(ii) 游離BI-2536 (100 mg/kg)、(iii) CYCL-BI-2536 (100 mg/kg)和(iv) CYCL-BI-2536 (400 mg/kg)治療攜帶HCT 116異種移植物的裸鼠(每組n = 4)的結果。圖8C顯示用單一i.v.劑量的(i) 空脂質體、(ii) BI-2536 (100 mg/kg)或(iii) CYCL-BI-2536 (100 mg/kg)治療攜帶HCT 116異種移植物的裸鼠的結果。在任何藥物治療前和此后每24小時對中性粒細胞計數。每個治療組中5只小鼠的中性粒細胞計數的均值和標準偏差(SD)被顯示。

圖9顯示CYCL-香豆素334在2、24和48小時時間點的組織生物分布，如分別從左到右對每個組織的直方圖所指示的。數據表示為均值和標準偏差。

圖10A-10B顯示MEK1抑制劑，PD-0325901的加載和活性。圖10A顯示用單一劑量的PD-0325901和CYCL-PD-0325901治療的動物的生存曲線。攜帶RKO異種移植物的裸鼠用單一劑量(200 mg/kg)的其游離形式的PD-0325901，以低劑量(200 mg/kg; n = 5)或較高劑量(500 mg/kg; n = 5)的單一i.v.劑量的CYCL- PD-0325901治療。圖10B顯示用2個i.v.劑量(由箭頭指示的那些天)的(i) 空白脂質體、(ii) 游離PD-0325901 (150 mg/kg)或(iii) CYCL-PD-325901 (250 mg/kg)治療攜帶RKO異種移植物的裸鼠的結果。脂質體制劑已被報道為游離藥物的等價物。各個實驗組的相對腫瘤體積和標準偏差被顯示。

圖11A-11C顯示CYCL-BI-2536和CYCL-PD0325901在第二個異種移植物模型中的抗-腫瘤活性。脂質體制劑已被報道為游離藥物的等價物。各個實驗組的相對腫瘤體積和標準偏差被顯示。

發明詳述

本文已確定，攜帶可電離的官能團(例如，在它們的溶劑-暴露的表面，例如脂質體內相表面上的弱堿性和/或弱酸性官能團)的環糊精能夠有效地以高濃度包封治療劑(例如，不可電離的和/或疏水的組合物)并且含有治療劑的官能化環糊精以高濃度被有效地遠程加載到脂質體中，以生成脂質體組合物，其在體內給予時表現出意外地降低的毒性和增強的功效特性。因此，本發明提供(至少部分地)包含這樣的修飾環糊精和治療劑的脂質體組合物和藥劑盒，以及制備和使用這樣的組合物和藥劑盒的方法。

A. 環糊精

術語“環糊精”指由6個或更多個α-D-吡喃葡糖苷單位組成的一個環狀寡糖家族，所述糖苷單位通過具有環狀拓撲結構的C1-C4鍵連接在一起，其中環狀結構的較大和較小開口使α-D-吡喃葡糖苷單元的某些羥基暴露于周圍的環境(例如，溶劑)。術語“惰性環糊精”指含有具有基本式C₆H₁₂O₆的α-D-吡喃葡糖苷單元和沒有任何另外的化學取代的葡萄糖結構的環糊精(例如，具有6個葡萄糖單體的α-環糊精、具有7個葡萄糖單體的β-環糊精，和具有8個葡萄糖單體的γ-環糊精)。術語“環糊精內相”指包含在(即，被包封在)環糊精結構的環狀拓撲布局內的相對較少親水性的區域。術語“環糊精外相”指不被環糊精結構的環狀拓撲布局環繞的區域并當環糊精被包封在脂質體內時，可包括，例如脂質體內相。環糊精被用來溶解疏水性組分(見，例如Albers和Muller (1995) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. 12:311-337; Zhang和Ma (2013) Adv. Drug Delivery Rev. 65:1215-1233; Laza-Knoerr等(2010) J. Drug Targ. 18:645-656; Challa等(2005) AAPS PharmSci. Tech. 6:E329-357; Uekama等(1998) Chem. Rev. 98:2045-2076; Szejtli (1998) Chem. Rev. 98: 1743-1754; Stella和He (2008) Toxicol. Pathol. 36:30-42; Rajewski和Stella (1996) J. Pharm. Sci. 85:1142-1169; Thompson (1997) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 14: 1-104; 和Irie和Uekama (1997) J. Pharm. Sci. 86:147-162)。位于環糊精內相內的任何物質被認為是“包封的”。

如本文所用的，對環糊精沒有特別的限制，只要環糊精(a)可包封所需的治療劑和(b) 攜帶可電離的(例如，弱堿性和/或弱酸性)官能團以促進被脂質體包封。

為了包封所需的治療劑，環糊精可根據所需的治療劑的特征和有效的、高-濃度加載于其中的參數進行選擇和/或被化學修飾。例如，優選環糊精本身具有在水中的高溶解性，以促進較大量的環糊精在脂質體內相中的截留。在一些實施方案中，環糊精的水溶性是至少10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL、100 mg/mL或更高。實現這樣的提高的水溶性的方法是本領域熟知的。

在一些實施方案中，一個大的與治療劑的締合常數是優選的并可通過基于治療劑的尺寸選擇環糊精中的葡萄糖單元的數目而獲得(見，例如，Albers和Muller (1995) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. 12:311-337; Stella和He (2008) Toxicol. Pathol. 36:30-42; 和Rajewski和Stella (1996) J. Pharm. Sci. 85:1142-1169)。當締合常數取決于pH時，可選擇環糊精以使締合常數在脂質體內相的pH時變大。結果，在環糊精的存在下，治療劑的溶解性(名義溶解度)可得到進一步提高。例如，環糊精與治療劑的締合常數可以是100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000，或更高。

通過與環糊精羥基(例如，襯在惰性環糊精環面的上下脊的那些羥基)反應所形成的衍生物可被容易地制備并提供一種修飾母體(惰性)環糊精的物理化學性質的方法。本文已確定修飾羥基，例如面向遠離環糊精內相的那些羥基，可用可電離的化學基團替代以促進加載到脂質體中以及治療劑，例如難溶性或疏水性藥物在修飾環糊精內的加載。在一個實施方案中，具有至少一個用可電離的化學基團取代的羥基的修飾環糊精將導致在某些溶劑(例如，pH)條件下的荷電部分。術語“荷電的環糊精”指具有被荷電部分取代的一個或多個其羥基和攜帶電荷的部分的環糊精。這樣的部分本身可以是荷電的基團或它可包含用一個或多個荷電部分取代的有機部分(例如，C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷基醚部分)。

在一個實施方案中，“可電離的”或“荷電的”部分是弱可電離的。弱可電離的部分是那些為或者弱堿性或者弱酸性的部分。弱堿性官能團(X)具有依據CH₃-X的在約6.0-9.0、6.5-8.5、7.0-8.0、7.5-8.0之間和其中任何范圍的pK_a。類似地，弱酸性官能團(Y)具有依據CH₃-Y的在約3.0-7.0、4.0-6.5、4.5-6.5、5.0-6.0、5.0-5.5之間和其中任何范圍的log解離常數(pK_a)。pKa參數是一種物質的酸/堿性質的熟知的量度，pKa測定的方法在本領域是傳統的和常規的。例如，許多弱酸的pKa值被列表于化學和藥理學的參考書中。見，例如，藥用鹽的IUPAC手冊(IUPAC Handbook of Pharmaceutical Salts)，由P. H. Stahl和C. G Wermuth編輯, Wiley-VCH, 2002；化學和物理的CRC手冊，第82版，由D. R. Lide編輯, CRC Press, Florida, 2001, p. 8-44至8-56。因為帶有超過一個可電離的基團的環糊精具有各自用下標表示的第二個和隨后的基團的pKa。

代表性的陰離子部分包括，而無任何限制，羧酸根、羧甲基、琥珀酰基、磺酰基、磷酸根、磺基烷基醚、硫酸根、碳酸根、硫代碳酸根、二硫代碳酸根、磷酸根、膦酸根、磺酸根、硝酸根和硼酸根基團。

代表性的陽離子部分包括，但不限于，氨基、胍，和季銨基團。

在另一個實施方案中，修飾的環糊精是“聚陰離子”或“聚陽離子”。聚陰離子是具有一個以上的帶負電荷基團、導致超過兩個單位的凈負離子電荷的修飾環糊精。聚陽離子是具有一個以上的帶正電荷基團、導致超過兩個單位的凈正離子電荷的修飾環糊精。

在另一個實施方案中，修飾的環糊精是“可荷電的兩親物”。所謂"可荷電的"意指兩親物具有在pH 4-pH 8或8.5范圍內的pK。因此可荷電的兩親物可以是一種弱酸或弱堿。所謂"兩性的"在這里指的是一種具有陰離子性質和陽離子性質兩者的可電離基團的修飾環糊精，其中：1) 陽離子和陰離子兩親物的至少一個，且任選兩個都是可荷電的，具有至少一個具有在4和8至8.5之間的pK的荷電的基團，2) 陽離子電荷最好在pH 4，和3) 陰離子電荷最好在pH 8-8.5。

在一些實施方案中，“可電離的”或“荷電的”環糊精作為一個整體，無論聚離子、兩性分子的，或者另外的，都是弱可電離的(即，具有在約4.0-8.5、4.5-8.0、5.0-7.5、5.5-7.0、6.0-6.5之間和包含在其中的任何范圍的pKa₁)。

環糊精的任何一個、一些或全部α-D-吡喃葡糖苷單元的任何一個、一些或全部羥基可如本文所述被修飾為可電離的化學基團。由于各個環糊精羥基在化學反應性方面不同，與修飾部分的反應可產生一種位置和光學異構體的無定形混合物。作為選擇，某些化學可允許預-修飾的α-D-吡喃葡糖苷單元反應以形成均勻的產物。

發生的總取代由稱為取代度的術語描述。例如，具有取代度為7的6-乙二氨基-β-環糊精將由6-乙二氨基-β-環糊精的異構體的分布組成，其中每個6-乙二氨基-β-環糊精分子的乙二氨基的平均數是7。取代度可通過質譜或核磁共振波譜確定。理論上，對于α-環糊精，最大取代度是18，對于β-環糊精是21，而對于γ-環糊精是24，然而，具有羥基的取代基本身存在對另外的羥基烷基化的可能性。取代度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，或更多并可包括完全取代。

另一個參數是給定的羥基取代的立體化學定位。在一個實施方案中，至少一個面向遠離環糊精內部的羥基被可電離的化學基團取代。例如，至少一個α-D-吡喃葡糖苷單元的C2-C3-C6羥基的C2、C3、C6、C2和C3、C2和C6、C3和C6，和所有3個被可電離的化學基團取代。羥基的任何這樣的組合可類似地與修飾環糊精的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，直至全部的α-D-吡喃葡糖苷單元組合以及與本文描述的任何取代度組合。

組合一個或多個本文描述的環糊精也是可接受的。

B. 脂質體

術語“脂質體”指具有由脂質雙層環繞的內相的微觀封閉的囊泡。脂質體可以是一個小單層-膜脂質體如小單層囊泡(SUV)、大單層-膜脂質體如大單層囊泡(LUV)、一個更大的單層-膜脂質體如一個巨大的單層囊泡(GUV)、一個具有多個同心膜的多層脂質體如多層囊泡(MLV)，或一個具有為不規則和不同心的多層膜的脂質體如多泡性囊泡(MVV)。對于熟知的脂質體形式的另外的描述，見U.S. Pat. Publ. 2012-0128757; U.S. Pat. No. 4,235,871; U.S. Pat. No. 4,737,323; WO 96/14057；New (1990) 脂質體：一種實用方法(Liposomes: A practical approach), IRL Press, Oxford, 33-104頁；和Lasic (1993) 從物理到應用的脂質體(Liposomes from physics to applications), Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam。

術語“脂質體內相”指包含在(即，被包封在)脂質體的脂質雙層內的水性區域。比較起來，術語“脂質體外相”指未由脂質體的脂質雙層環繞的區域，例如在其中脂質體分散于液體中的情況下遠離內相和脂質雙層的區域。

如本文所用的，對脂質體沒有特別的限制，只要它能包封含有治療劑的修飾的環糊精即可。在一些實施方案中，一旦包封在脂質體內相內，脂質體具有防止修飾的環糊精/治療劑復合物從脂質體內相不需要地泄漏到外相的屏障功能。在其中它用作藥物的情況下，當脂質體在體內給予時，優選脂質體表現出在體內的穩定性并具有防止所有的修飾環糊精/治療劑復合物在血液中泄漏到脂質體外相的屏障功能。

在一些實施方案中，脂質體的膜成分包括磷脂和/或磷脂衍生物。這樣的磷脂和磷脂衍生物的代表性實例包括，但不限于，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、鞘磷脂、神經酰胺磷酸乙醇胺、神經酰胺磷酸甘油，神經酰胺磷酸甘油磷酸酯、1,2-二肉豆蔻酰-1,2-脫氧磷脂酰膽堿、縮醛磷脂，和磷脂酸。合并這些磷脂和磷脂衍生物的一個或多個也是可接受的。

對磷脂和磷脂衍生物中的脂肪-酸殘基沒有特別的限制并可包括具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更長的碳鏈長度的飽和的或不飽和的脂肪-酸殘基。代表性的非限制性實例包括源自脂肪-酸如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸，和亞油酸的酰基基團。從天然物質衍生的磷脂如蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂、部分氫化的蛋黃卵磷脂、(完全地)氫化的蛋黃卵磷脂、部分氫化的大豆卵磷脂，和(完全地)氫化的大豆卵磷脂(其不飽和的脂肪-酸殘基被部分地或完全地氫化)等也可采用。

當制備脂質體時，對所用的磷脂和/或磷脂衍生物的混合量(摩爾分數)沒有特別的限制。在一個實施方案中，可使用相對于整個脂質體膜組成的10-80%。在另一個實施方案中，可采用30-60%之間的范圍。

除了磷脂和/或磷脂衍生物外，脂質體還可包含作為膜穩定劑的甾醇，例如膽甾醇和膽甾烷醇和具有飽和的或不飽和的酰基的脂肪酸，例如具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更長的碳原子數的那些。

當制備脂質體時，對所用的這些甾醇的混合量(摩爾分數)沒有特別的限制，但相對于整個脂質體膜組成的1-60%是優選的，10-50%是更優選的，且30-50%是甚至更優選的。類似地，對脂肪酸的混合量(摩爾分數)沒有特別的限制，但相對于整個脂質體膜組成的0-30%是優選的，0-20%是更優選的，和0-10%是甚至更優選的。至于抗氧化劑的混合量(摩爾分數)，如果加入的量可獲得抗氧化作用，則它是足夠的，但整個脂質體膜組成的0-15%是優選的，0-10%是更優選的，和0-5%是甚至更優選的。

脂質體也可含有功能性脂質和修飾的脂質作為膜成分。功能性脂質的代表性的非限制性實例包括在血液中保留的脂質衍生物(例如，血型糖蛋白、神經節苷脂GM1、神經節苷脂GM3、葡萄糖醛酸衍生物、谷氨酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物、聚乙二醇衍生物(甲氧基聚乙二醇縮合物等)如N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-750]-1,2-二硬脂酰-sn甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (MPEG 2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，和N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，其是磷酸乙醇胺和甲氧基聚乙二醇的縮合物)，溫敏性脂質衍生物(例如，二棕櫚酰基磷脂酰膽堿)、pH-敏感性脂質衍生物(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺)等。在血液中保留的含有脂質衍生物的脂質體被用來改善脂質體的血液滯留，因為脂質體作為外來雜質變得難以在肝中捕獲。類似地，含有溫敏性脂質衍生物的脂質體被用來引起脂質體在特定溫度下的破壞和/或引起脂質體表面特性的改變。此外，通過將此與靶位點的溫度增加結合，有可能在靶位點破壞脂質體，并且在靶位點釋放治療劑。當由于內吞作用脂質體被結合到細胞中時，含有pH-敏感性脂質衍生物的脂質體被用來促進脂質體和內體的膜融合，從而改進治療劑向細胞質的傳輸。

修飾脂質的代表性非限制性實例包括PEG脂質、糖脂、抗體-修飾的脂質、肽-修飾的脂質等。含有這樣的修飾脂質的脂質體可靶向所需的靶細胞或靶組織。同樣，當制備脂質體時，對所用的功能性脂質和修飾的脂質的混合量(摩爾分數)沒有特別的限制。在一些實施方案中，這樣的脂質組成整個脂質體膜成分脂質的0-50%、0-40%、0-30%、0-20%、0-15%、0-10%、0-5%、0-1%或更少。

基于以上描述和本領域熟知的方法，具有這樣的膜滲透性的脂質體膜成分的組成可由本領域技術人員根據治療劑、靶組織等以允許實際應用的水平適當地選擇。

當用作藥物時，優選治療劑/環糊精復合物在脂質體抵達靶組織、細胞，或細胞內細胞器后從脂質體釋放。相信在此描述的脂質體組合物含有膜成分，其本身通常是可生物降解的，并最終在靶組織等分解，并且包封的治療劑/環糊精復合物由此通過稀釋、化學平衡，和/或酶促環糊精降解作用而釋放。

取決于所需的應用，脂質體的粒徑可被調整。例如，當其作為注射產品等，目的是通過提高滲透性和滯留(EPR)效應，向癌組織或發炎的組織傳送脂質體時，脂質體粒徑為30-400 nm、50-200 nm、75-150 nm，和之間的任何范圍是優選的。在意圖是向巨噬細胞傳送脂質體的情況下，優選脂質體粒徑是30-1000 nm，和更優選粒徑是100-400 nm。在脂質體組合物要用作口服制劑或經皮制劑的情況下，脂質體的粒徑可以設置在幾微米。應該注意到，在正常組織中，血管壁用作屏障(因為血管壁是由血管內皮細胞致密構成的)，而微粒如特定大小的超分子和脂質體不能分布在該組織內。然而，在發病的組織中，血管壁是稀松的(因為血管內皮細胞之間存在縫隙)，增加了血管滲透性，因而超分子和微粒可分布到血管外組織(提高了滲透性)。而且，淋巴系統在正常組織中有很好的發展，但已知淋巴系統在發病的組織中沒有發展，并且超分子或微粒，一旦結合，不能通過一般系統回收，而是保留在發病的組織中(提高滯留性)，其形成EPR作用的基礎(Wang等(2012) Annu. Rev. Med. 63:185-198; Peer等(2007) Nat. Nanotech. 2:751-760; Gubernator (2011) Exp. Opin. Drug Deliv. 8:565-580; Huwyler等(2008) Int. J. Nanomed. 3:21-29; Maruyama等(2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63:161-169; Musacchio和Torchilin (2011) Front. Biosci. 16:1388-1412; Baryshnikov (2012) Vest. Ross. Akad. Med. Nauk. 23-31；和Torchilin (2005) Nat. Rev. Drug Disc. 4:145-160)。因此，有可能通過調整脂質體粒徑控制脂質體的藥代動力學。

術語“脂質體粒徑”指根據動態光散射法(例如，準彈性光散射法(quasi-elastic light scattering method))的重均粒徑。例如，脂質體粒徑可使用動態光散射儀(例如，由Malvern Instruments Ltd.生產的Zetasizer Nano ZS型和由Otsuka Electronics Co., Ltd.生成的ELS-8000)測量。儀器測量粒子的Brownian運動，而粒徑基于已建立的動態光散射方法學理論測定。

此外，對脂質體內相的溶劑沒有特別的限制。示例性緩沖溶液包括，但不限于，如磷酸鹽緩沖溶液、檸檬酸緩沖溶液，和磷酸鹽-緩沖生理鹽水溶液、生理鹽水、用于細胞培養的培養基等。在緩沖溶液用作溶劑的情況下，優選緩沖劑的濃度是5-300 mM、10-100 mM，或之間的任何范圍。對脂質體內相的pH也沒有特別的限制。在一些實施方案中，脂質體內相具有在2和11、3和9、4和7、4和5之間，以及包含其中任何范圍的pH。

C. 治療劑

對本發明的治療劑沒有特別的限制，只要治療劑被修飾的環糊精包封即可。例如，已知α-環糊精具有0.45-0.6的內相孔徑大小，β-環糊精具有0.6-0.8 nm的內相孔徑大小，和γ-環糊精具有0.8-0.95 nm的內相孔徑大小。可選擇與治療劑的大小相匹配的環糊精以允許包封。如上所述，可選擇對非-碳環糊精基團(例如，羥基基團)的修飾以調節環糊精和治療劑之間的分子間相互作用，從而調節治療劑被環糊精的包封。

作為治療劑，可使用任何所需的藥物，例如可用于藥品(包括診斷藥物)、化妝品、食品等領域的那些。例如，治療劑可從各種已知類型的有用的藥物中選擇，包括，例如，蛋白質、肽、核苷酸、抗-肥胖藥、營養藥、糖皮質激素、彈性蛋白酶抑制劑、止痛藥、抗真菌劑、腫瘤治療劑、止吐藥、鎮痛劑、心血管藥物、抗炎劑、驅蟲藥、抗心律失常藥、抗生素(包括青霉素)、抗凝藥、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、抗癲癇藥、抗組胺藥、抗高血壓藥、抗毒蕈堿劑、抗分支桿菌藥、抗腫瘤藥、免疫抑制劑、抗甲狀腺藥、抗病毒藥、焦慮鎮靜劑(催眠藥和神經松弛劑)、收斂劑、β-腎上腺素受體阻斷劑、血液制品和替代品，心臟正性肌力藥物、造影劑、糖皮質激素，止咳藥(祛痰劑和粘液溶解劑)、診斷劑、診斷成像劑、利尿劑、多巴胺類(抗帕金森病藥)、止血劑、免疫劑、脂質調節劑、肌肉松弛劑、擬副交感神經藥、甲狀旁腺降鈣素和雙膦酸鹽、前列腺素、放射性藥物、性激素(包括類固醇)、抗過敏藥、興奮劑和減食欲劑、擬交感神經藥、甲狀腺藥物、血管擴張劑和黃嘌呤類。至于治療劑，合并一個或多個藥物是可接受的。

在一個實施方案中，治療劑可以是低分子化合物，例如小分子。在這些中，用作抗腫瘤劑、抗菌劑、抗炎劑、抗心肌梗死劑和造影劑的化合物是合適的。

至于治療劑的分子量，100-2,000道爾頓的范圍是優選的，200-1,500道爾頓的范圍是更優選的，和300-1,000道爾頓的范圍是甚至更優選的。在這些范圍內，依據本文描述的組合物，治療劑的脂質體膜滲透性通常是滿意的。

本發明對抗-瘤形成劑或抗-腫瘤劑沒有特別的限制。代表性實例包括，但不限于，BI-2536、PD-0325901、喜樹堿；紫杉烷；異環磷酰胺、尼莫司汀鹽酸鹽(nimstine hydrochloride)、新制癌菌素、紫杉醇、carvocon、環磷酰胺、達卡巴嗪、噻替派、白消安、melfaran、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸鈉、6-巰基嘌呤核苷、依諾他濱、鹽酸吉西他濱、carmfur、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八碳磷酸鹽(cytarabine ocfosfate)、替加氟、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巰基嘌呤、磷酸氟達拉濱、放線菌素D、鹽酸阿柔比星、鹽酸伊達比星、鹽酸吡柔比星、鹽酸表柔比星、鹽酸柔紅霉素、鹽酸多柔比星、表柔比星、吡柔比星、柔紅霉素、多柔比星、鹽酸吡柔比星、鹽酸博來霉素、凈司他丁斯酯、新制癌菌素、絲裂霉素C、硫酸博來霉素、硫酸培洛霉素、依托泊苷、酒石酸長春瑞濱、硫酸長春新堿(vincrestine sulfate)、硫酸長春地辛、硫酸長春堿、鹽酸氨柔比星、吉非替尼、依西美坦、卡培他濱、艾日布林(eribulin)、甲磺酸艾日布林等。至于在上述藥物中記錄為鹽的化合物，任何鹽是可接受的和游離實體也是可接受的。至于作為游離實體記錄的化合物，任何鹽是可接受的。

類似地，對抗菌劑沒有特別的限制。代表性實例包括，但不限于，amfotericine B、己基頭孢替安(cefotiam hexyl)、頭孢菌素、氯霉素、雙氯芬酸等。至于前述抗菌劑的化合物，任何鹽是可接受的。

同樣，對抗炎劑沒有特別的限制。代表性實例包括，但不限于，前列腺素(PGE1和PGE2)、地塞米松、氫化可的松、匹洛西卡(pyroxicam)、吲哚美辛、潑尼松龍，等。至于前述抗炎劑的化合物，任何鹽是可接受的。

對于抗-心肌梗死劑也沒有特別的限制。代表性實例包括，但不限于，腺苷、阿替洛爾、吡西卡尼等。至于前述抗-心肌梗死劑的化合物，任何鹽是可接受的。

對造影劑也沒有特別的限制。代表性實例包括，但不限于，碘帕醇(iopamidol)、碘克沙酸、碘海醇、碘美普爾(iomeprol)等。至于造影劑，任何鹽都是可接受的。

在一些實施方案中，治療劑是“水溶性差的”或“疏水的”，這些術語可互換使用以包括微溶于水的治療劑，如通過少于約10 mg/mL、9 mg/mL、8 mg/mL、7 mg/mL、6 mg/mL、5 mg/mL、4 mg/mL、3 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、900 μg/mL、800 μg/mL、700 μg/mL、600 μg/mL、500 μg/mL、400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、95 μg/mL、90 μg/mL、85 μg/mL、80 μg/mL、75 μg/mL、70 μg/mL、65 μg/mL、60 μg/mL、55 μg/mL，和在一些情況下少于約50 μg/mL，或包含在其中的任何范圍的室溫水溶性所證實的。在一個實施方案中，當1份藥物可被100-1000份溶劑(例如，水)溶解時，則適用于術語“微溶性”。應該理解，對于任何給定的化合物，室溫水溶性可使用容易獲得的化學技術和工具，例如高效液相色譜或分光光度法而容易地測定。

D. 脂質體組合物

術語“脂質體組合物”指含有脂質體并且還含有從其惰性形式經化學修飾的環糊精和脂質體內相的治療劑。脂質體組合物可包括固體和液體形式。在脂質體組合物呈固體形式的情況下，通過將其溶解或懸浮于規定的溶劑中，可將其制備為液體形式。在脂質體組合物為冷凍固體的情況下，通過使其于室溫下放置融化，可將其制備為一種液體形式。

脂質體組合物中的脂質體的濃度和治療劑的濃度可根據脂質體組合物的目標、配方，和技術人員熟知的其它考慮而適當地設定。在脂質體組合物是液體制劑的情況下，脂質體的濃度作為構成脂質體的所有脂質的濃度可被設定在0.2-100 mM，并且優選地在1-30 mM。在脂質體組合物被用作藥物的情況下，治療劑的濃度(劑量)在下文描述。至于在脂質體組合物中的環糊精的量，優選其為相對于治療劑的0.1-1000 mol當量，且更優選其為相對于治療劑的1-100 mol當量。

在脂質體組合物是液體制劑的情況下，對脂質體組合物的溶劑沒有特別的限制。代表性實例包括，但不限于，緩沖溶液如磷酸鹽緩沖溶液、檸檬酸緩沖溶液，和磷酸鹽-緩沖生理鹽水溶液、生理鹽水，和用于細胞培養的培養基。對脂質體組合物的脂質體外相的pH也沒有特別的限制。在一些實施方案中，例如pH是在2和11、3和10、4和9之間、7.4、7.0，或高于脂質體內相的pH的任何pH。

在一些實施方案中，可加入藥用賦形劑，例如糖，例如單糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖，和木糖；二糖如乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖，和麥芽糖；三糖如棉子糖和松三糖；多糖如環糊精；和糖醇如赤藻糖醇、木糖醇、山梨醇(sortibol)、甘露醇和麥芽糖醇; 多元醇如甘油、雙甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇單烷基醚、二乙二醇單烷基醚、1,3-丁二醇。糖和醇的組合也可采用。

為了分散于溶劑中的脂質體的長期穩定貯存的目的，從物理穩定性(包括凝固等)的角度來看，盡可能地多的消除溶劑中的電解質是優選的。而且，從脂質的化學穩定性的角度來看，將溶劑的pH從酸性設置接近中性(pH 3.0-8.0)，并且通過鼓泡通入氮以除去溶解的氧是優選的。液體穩定劑的代表性實例包括，但不限于，正常鹽水、等滲右旋糖、等滲蔗糖、林格氏溶液，和漢克斯(Hanks')溶液。可加入緩沖物質以提供為了貯存穩定性的最適pH。例如，在約6.0和約7.5之間的pH，更優選約6.5的pH對于脂質體膜脂質的穩定性是最適的，并提供截留實體的優良的滯留性。組氨酸、羥基乙基哌嗪-乙磺酸鹽(HEPES)、嗎啉代-乙磺酸鹽(MES)、琥珀酸鹽、酒石酸鹽，和檸檬酸，通常以2-20 mM濃度存在，是示例性緩沖物質。其它合適的載體包括，例如，水、緩沖水性溶液、0.4% NaCl、0.3%甘氨酸等。可加入蛋白質、碳水化合物，或聚合物穩定劑和張力調節劑，例如，明膠、白蛋白，葡聚糖，或聚乙烯吡咯烷酮。組合物的張力可用葡萄糖或較惰性的化合物如乳糖、蔗糖、甘露醇，或糊精調節至0.25-0.35 mol/kg的生理水平。這些組合物可通過常規的、熟知的滅菌技術，例如，通過過濾滅菌。生成的水性溶液可為了使用而包裝或在滅菌條件下過濾并凍干，凍干的制劑在給予前與無菌水性介質合并。

對脂質體組合物中含有的糖的濃度沒有特別的限制，但在脂質體分散于溶劑的狀態下，例如，優選糖的濃度是2-20% (W/V)，而5-10% (W/V)是更優選的。至于多元醇的濃度1-5% (W/V)是優選的，和2-2.5% (W/V)是更優選的。

脂質體組合物的固體制劑也可包含藥用賦形劑。這樣的組分可包括，例如，糖，例如單糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖，和木糖；二糖如乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖，和麥芽糖；三糖如棉子糖和松三糖；多糖如環糊精；和糖醇如赤藻糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇，和麥芽糖醇。更優選葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖，和山梨醇的共混物。甚至更優選乳糖、蔗糖，和海藻糖的共混物。這是指，固體制劑可穩定地存放長時間。當冷凍時，優選固體制劑含有多元醇(水性溶液)如甘油、雙甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇單烷基醚、二乙二醇單烷基醚和1,3-丁二醇。至于多元醇(水性溶液)、甘油、丙二醇，和聚乙二醇是優選的，和甘油和丙二醇是更優選的。這是指，固體制劑穩定地存放長時間是可能的。糖和多元醇可組合使用。

在此描述的脂質體組合物可進一步按照實體與脂質的比值(entity-to-lipid ratio)進行表征。一般來說，實體-脂質比值，例如，在加載藥物時獲得的治療劑負載比取決于脂質體內截獲的藥物量，主動加載過程中的離子濃度，和離子的理化性質和所用的相反離子的類型。由于在組合物中和/或由本發明的方法獲得的高加載效率，脂質體中捕獲的實體的實體-脂質比值是基于吸收進入加載過程的實體和脂質體脂質的量("輸入"比)計算的超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%，或更高。實現100% (定量的)包封也是可能的。

脂質體中的實體-脂質比值可根據重量比(每重量或摩爾單位的脂質體脂質的實體重量)或摩爾比(每重量或摩爾單位的脂質體脂質的實體的摩爾數)進行特征表述。實體-脂質比值的1個單位可通過如下例舉的常規計算轉化為其它單位。在此描述的脂質體組合物中的實體重量比通常是每mg脂質至少0.05、0.1、0.2、0.35、0.5，或至少0.65 mg實體。就摩爾比而言，依據本發明的實體-脂質比值是至少從約0.02至約5，優選至少0.1-約2，和更優選從約0.15至約1.5摩爾的藥物/摩爾脂質體脂質。

在一個實施方案中，實體-脂質比值比是每摩爾脂質體脂質至少0.1摩爾的治療劑，且優選至少0.2、0.3、0.4、0.5，或更多。

本發明的脂質體組合物還可以它們的高效截留的治療劑和低毒性的意外組合為特征。一般來說，依據本發明經脂質體包封的治療劑的活性，例如，抗-癌治療劑在哺乳動物中的抗-腫瘤活性是至少等于治療劑實體(如果其以相同的量經由其常規的非-脂質體制劑，例如，不使用本發明的脂質體組合物給予)的活性，是其活性的至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或更多倍，或比其高至少這樣的倍數，同時脂質體包封的實體的毒性不超過以相同的劑量和進度表，但以游離的非-包封形式給予的相同治療劑實體的毒性，是其毒性的至多1/2、至多1/3，或至多1/4。

E. 制備脂質體組合物的方法

許多方法是制備脂質體的領域熟知的。代表性實例包括，但不限于，脂質膜法(渦流法(Vortex method)、反相蒸發法、超聲波法、預泡法(pre-vesicle method)、乙醇注入法、French press法、膽酸排除方法、Triton X-100批處理法、Ca²⁺融合法、乙醚注入法、退火法，凍融法等。

在脂質體制備中的各種條件(膜成分的量、溫度等)可根據脂質體制備方法、靶脂質體組成、粒徑等適當地選擇。然而，已知環糊精具有從脂質體除去脂質(特別是膽甾醇等)的作用。因此優選的是用于脂質體制備的脂質的量在考慮了這種作用后設定。

治療劑/環糊精復合物可通過在滴加治療劑(例如，含有治療劑的溶液)時攪動和混合環糊精(例如，含有環糊精的溶液)或者反過來而獲得。依據治療劑的物理特性，使用溶于溶劑的物質或固體物質作為治療劑是可能的。對溶劑沒有特別的限制，并且人們可使用，例如，與脂質體外相相同的物質。與環糊精混合的治療劑的量可以是等摩爾量或不同的比例，這取決于組合所需的水平。在一些實施方案中，治療劑的絕對量可在相對于環糊精的量的0.001-10 mol當量，0.01-1 mol當量范圍內，或包含在任何范圍之間。同樣，對加熱溫度沒有特別的限制。例如，5℃或更高、室溫或更高(例如，20℃或更高也是優選的)或脂質體的脂質雙層膜的相變溫度或更高，都是可接受的。

必要時可任選地調節脂質體粒徑。粒徑可例如，通過在高壓下使用規則孔徑的膜過濾器進行擠出(擠出過濾)來調節。粒徑調節可在制備脂質體組合物期間，在任何時間選擇上進行。例如，粒徑調節可在將治療劑/環糊精復合物引入脂質體內相之前或在治療劑/環糊精復合物已經遠程加載到脂質體內相之后進行。

存在除去任何不需要的或未結合的復合物或組合物，例如不被環糊精包封的治療劑或不被脂質體包封的治療劑環糊精復合物的熟知的方法。代表性實例包括，但不限于，透析、離心分離，和凝膠過濾。

透析可例如使用透析膜進行。作為透析膜，人們可引用具有分子量截止的膜如纖維素管或Spectra/Por。至于離心分離，離心加速可優選地以100,000 g或更高，且更優選以300,000 g或更高來進行。凝膠過濾可，例如，通過基于分子量使用柱如Sephadex或Sepharose進行分餾來進行。

在一些實施方案中，可使用主動遠程加載方法以將治療劑/環糊精復合物包封在脂質體內。一般地，在脂質體的內部空間存在的離子梯度(例如，可滴定的銨，例如未取代的銨離子)可例如，經由"主動"、"遠程"，或"跨膜梯度-驅動"加載，提供提高的弱兩性分子的堿的包封(Haran等, Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1152, p. 253-258; Maurer-Spurej等, Biochim. Biophys. Acta, 1999, v. 1416, p. 1-10)。

例如，主動遠程加載可通過使用跨膜pH梯度實現。脂質體內相和外相的pH相差1-5 pH單位、2-4 pH單位、0.5 pH單位、1 pH單位、2 pH單位、3 pH單位、3.4 pH單位、4 pH單位、5 pH單位、6 pH單位、7 pH單位，或包括的任何范圍的pH單位。或者脂質體內相或者外相依據治療劑的類型和修飾環糊精上可電離的基團，可具有較高的pH。在其它方面，如果脂質體內相和外相的pH沒有顯著的差別(即，脂質體外相和內相具有基本上相同的pH)，則也是可接受的。

pH梯度可通過使用用于pH梯度方法的領域通常已知的化合物調節。代表性實例包括，但不限于，氨基酸如精氨酸、組氨酸，和甘氨酸；酸如抗壞血酸、苯甲酸、檸檬酸、谷氨酸、磷酸、乙酸、丙酸、酒石酸、碳酸、乳酸、硼酸、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、己二酸、鹽酸，和硫酸；前述酸的鹽如鈉鹽、鉀鹽，和銨鹽；和堿性化合物如三羥甲基氨基甲烷、氨水、氫化鈉、氫化鉀等。

許多不同的離子可用于離子梯度方法。代表性的實例包括，但不限于，硫酸銨、氯化銨、硼酸銨、甲酸銨、乙酸銨、檸檬酸銨、酒石酸銨、琥珀酸銨、磷酸銨等。此外，至于離子梯度方法，脂質體內相的離子濃度可根據治療劑的類型適當地選擇。較高的離子濃度是更優選的并且優選地為10 mM或更高，更優選20 mM或更高，甚至更優選50 mM或更高。根據治療劑的類型，或者脂質體內相或者外相可具有較高的離子濃度。在其它方面，如果脂質體內相和外相的離子濃度沒有顯著的差別，即脂質體外相和內相具有基本上相同的離子濃度，則也是可接受的。離子梯度也可通過取代或稀釋脂質體外相來調節。

在一個實施方案中，可使用熟知的方法，增加其中脂質體的膜滲透性被提高的一個步驟。代表性實例包括，但不限于，加熱含有脂質體的組合物，加入膜流化劑至含有脂質體的組合物中，等等。

在加熱含有脂質體的組合物，例如溶液的情況下，通過加熱至較高的溫度，治療劑/環糊精復合物可一般地更有效地被引入脂質體內相。特別地，考慮到治療劑/環糊精復合物的熱穩定性和使用的脂質體膜成分，設定加熱的溫度是優選的。特別是，優選將加熱的溫度設定在脂質體的脂質雙層膜的相變溫度或更高。

術語脂質體的脂質雙層膜的“相變溫度”指在升高的溫度條件下的差熱分析時吸熱開始的溫度(當吸熱反應開始時的溫度)。差熱分析是一種通過測量作為時間或溫度函數的樣品和參照物質之間的溫度差，同時改變樣品和參照物質的溫度，而能夠分析樣品的熱性能的技術。在對脂質體膜成分進行差熱分析的情況下，脂質體膜組分隨著溫度的升高而液態化，并且觀察到吸熱反應。其中觀察到吸熱反應的溫度范圍根據脂質體膜組分而有很大的變化。例如，在脂質體膜組分由純脂質組成的情況下，其中觀察到吸熱反應的溫度范圍是極其窄的，且吸熱反應常常在相對于吸熱峰溫度的±1℃的范圍內觀察到。在其它方面，在脂質體膜組分由多種脂質組成的情況下，且特別是在脂質體膜組分由源自天然材料的脂質組成的情況下，其中觀察到吸熱反應的溫度范圍傾向于放寬，并且觀察到吸熱反應，例如，在相對于吸熱峰溫度±5℃的范圍內(即是說，觀察到寬峰)。隨著脂質體膜液態化增加，通過升高溫度高于脂質體脂質雙層膜的相變溫度，增加治療劑/環糊精復合物的膜滲透性。

例如，雖然取決于治療劑/環糊精復合物的熱穩定性和使用的脂質體膜成分，在一些實施方案中，溫度范圍可以是從脂質體脂質雙層膜的相變溫度至+20℃、+10℃、+5℃，或更低，或在例如這樣的相變溫度的+5℃至+10℃之間的任何范圍。一般來說，加熱溫度的范圍通常可在20-100℃、40-80℃、45-65℃之間，和其中的任何范圍。優選加熱溫度高于或等于相變溫度。

在加熱步驟中，對溫度維持在相變溫度或相變溫度以上的時間沒有特別的限制，并且這可恰當地設置在例如，幾秒鐘至30分鐘的范圍內。考慮到治療劑和脂質的熱穩定性以及有效的大批量生產，在短時間內進行處理是理想的。即是說，優選升高的溫度維持期為1-30分鐘，而2分鐘-5分鐘是更優選的。然而，這些溫度維持時間決不限制本發明。

此外，如上所述，通過加入膜流化劑至獲得的混合溶液(即是說，將其加入到脂質體的外相側)中，提高脂質體膜滲透性也是可能的。代表性實例包括，但不限于，水性溶劑中是可溶的有機溶劑、表面活性劑、酶等。代表性的有機溶劑包括，但不限于，一元醇如乙醇和芐醇；多元醇如甘油和丙二醇；非質子極性溶劑如二甲亞砜(DMSO)。代表性的表面活性劑包括，但不限于，陰離子表面活性劑如脂肪酸鈉、一烷基硫酸鹽，和一烷基磷酸鹽；陽離子表面活性劑如烷基三甲基銨鹽；兩性表面活性劑如烷基二甲胺氧化物；和非-離子表面活性劑如聚氧乙烯烷基醚、烷基單甘油醚，和脂肪酸失水山梨醇酯。代表性的酶包括，但不限于，膽堿酯酶和膽固醇氧化酶。本領域技術人員在考慮了由于加入膜流化劑截留治療劑的效率度，脂質體的穩定性等后，可根據脂質體膜成分的組成、膜流化劑等，設定膜流化劑的量。

制備在此描述的脂質體組合物的方法還可包括調節獲得的脂質體組合物的脂質體外相的步驟和/或在包封治療劑/環糊精復合物之前和/或之后干燥獲得的脂質體組合物的步驟。

例如，在液體脂質體組合物中的脂質體外相可被調節(替代等)以制備最終的脂質體組合物，如果它被用作液體制劑的話。當脂質體組合物要被制備為固體制劑時，在上述引入步驟獲得的液體脂質體組合物可被干燥以制備最終的固體脂質體組合物。冷凍干燥和噴霧干燥是干燥脂質體組合物的方法的代表性的、非限制性實例。在脂質體組合物是固體制劑的情況下，它可被溶于或懸浮于合適的溶劑中并用作液體制劑。使用溶劑可根據脂質體組合物的使用目的適當地設置。例如，在使用脂質體組合物作為一種注射產品的情況下，溶劑可以是無菌蒸餾水或其它與注射劑適配的溶劑。在使用脂質體組合物作為藥物的情況下，臨床醫師或患者可將溶劑注入固體制劑已被封裝入其中的小瓶中，例如，以在使用時制備制劑。在液體脂質體組合物是冷凍固體制劑的情況下，其可以冷凍狀態貯存，并通過使其放置于室溫下融化或通過在使用時加熱快速地融化，使其回到液體狀態而作為液體制劑使用。

F. 藥物組合物和給藥方法

在此描述的脂質體組合物可在醫學領域用作藥物組合物如治療組合物或診斷組合物。例如，脂質體組合物可通過結合作為治療劑的抗腫瘤劑被用作治療組合物并可通過結合作為治療劑的造影劑被用作診斷組合物。脂質體組合物也可用于任何數目的其它目的，例如化妝品或作為一種食品添加劑。

通常，本發明的脂質體藥物組合物被制備為局部的或可注射的、或者作為液體溶液劑或者混懸劑。然而，也可制備為適合于在注射前在液體溶媒中的溶液或懸浮液的固體形式。組合物也可根據本領域已知的方法被配制為腸溶衣片劑或凝膠膠囊劑。

在本發明的脂質體組合物被用作藥物組合物的情況下，脂質體組合物可通過注射(靜脈內、動脈內，或局部注射)、口服、經鼻、皮下、肺，或通過滴眼液給予，除了靜脈內注射、皮下注射、皮內注射外，優選動脈內注射，特別是局部注射至靶細胞群或器官或其它這樣的注射。在口服給予的情況下，片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、膠囊劑、液體劑等可作為脂質體組合物的制劑的實例給予。在非-口服給藥的情況下，注射產品、滴注輸液劑、滴眼液、軟膏劑、栓劑、混懸劑、泥敷劑(cataplasm)、洗劑、氣霧劑、膏藥劑等可作為脂質體組合物的制劑的實例給予，而注射產品和滴注輸液劑是特別優選的。

當脂質體組合物用作化妝品時，作為化妝品的一種形式，人們可采用，例如，洗劑、霜劑、爽膚水、保濕劑、泡沫劑、粉底霜、唇膏、面膜、皮膚洗劑、香波、漂洗劑、調理劑、護發素、洗發液、發膏等。

術語“給予”物質，例如治療實體至動物或細胞，意欲指分散、傳遞或應用物質指預定的靶。至于治療劑，術語“給予”意欲指通過用于傳遞治療劑至動物的所需位置的任何合適的途徑，包括以醫學上可接受的任何方式，接觸或分散、傳遞或應用治療劑至動物，這可取決于待治療的病癥或損傷。可能的給藥途徑包括注射、經胃腸外途徑如肌內、皮下、靜脈內、動脈內、腹膜內、關節腔內、硬膜內、鞘內注射等，以及口、鼻、眼、直腸、陰道、局部，或肺，例如，通過吸入。為了傳遞根據本發明配制的脂質體藥物至中樞神經系統的腫瘤，脂質體的緩慢，持續的顱內輸注直接進入腫瘤(一種對流提高的傳遞，或CED)具有特別的優點(Saito等(2004) Cancer Res. 64:2572-2579；Mamot等(2004) J. Neuro-Oncology 68:1-9)。組合物也可直接應用于組織表面。緩慢釋放、依賴pH的釋放，或其它特定的化學或環境條件介導的釋放給藥也例如，通過這樣的方式如貯庫注射，或侵蝕的植入物特別地包括在本發明中。

藥物組合物在給予時的劑量可以不同，取決于靶疾病的類型，治療劑的類型，以及患者的年齡、性別和體重，癥狀的嚴重性，以及其它因素。要理解對于包封在脂質體內的任何給定治療劑和對于給定的患者的適當劑量方案的測定完全在主治臨床醫師的技能范圍內。例如，傳遞治療有效劑量所必需的脂質體藥物組合物的量可通過藥物測試領域常見的常規體外和體內方法測定(例如，D. B. Budman, A. H. Calvert, E. K. Rowinsky (編輯). 抗癌藥物開發手冊(Handbook of Anticancer Drug Development), LWW, 2003)。

作為選擇，對于給定的藥物在以游離形式給予時，主治臨床醫師可依賴于推薦的劑量。一般地，對于各種治療實體的治療有效劑量是本領域技術人員熟知的。通常地，對于本發明的脂質體藥物組合物的劑量范圍在約0.005和約500 mg治療實體每千克體重之間，最常見在約0.1和約100 mg治療實體/kg體重之間。

G. 藥劑盒

依據本發明，提供一種用于制備脂質體組合物的藥劑盒。藥劑盒可被用來制備作為一種治療劑或診斷劑的脂質體組合物，其可由臨床醫師或或技術人員在臨床環境或患者中使用。

藥劑盒包括脂質體試劑。脂質體試劑可或者以固體或者以液體形式存在。如果脂質體試劑以固體形式存在，脂質體試劑可溶于或懸浮于適當的溶劑中以獲得脂質體，而上述脂質體分散液可被干燥以獲得脂質體試劑。干燥可以類似于上述對脂質體組合物的干燥進行。當使用藥劑盒時，如果脂質體試劑以固體形式存在，脂質體試劑可溶于或懸浮于適當的溶劑中以制備脂質體分散液。當這樣進行時，溶劑類似于上述脂質體分散液中的脂質體外相。

本發明的藥劑盒優選地還含有治療劑。治療劑可呈現為或者固體或者液體形式(一種溶于或懸浮于溶劑的狀態)。當使用藥劑盒時，如果治療劑以固體形式存在時，優選使其溶于或懸浮于適當的溶劑以制備液體形式。溶劑可適當地依據治療劑的物理特性等設置，并可例如類似于上述脂質體分散液中的脂質體外相進行制備。

在藥劑盒中，脂質體試劑和治療劑可分開包裝，或它們可呈現為固體形式并混合在一起。

在脂質體試劑和治療劑二者均以固體形式存在并被包裝在一起的情況下，使脂質體試劑和治療劑的混合物適當地溶于或懸浮于溶劑中。當這樣進行時，溶劑類似于上述脂質體分散液中的脂質體外相。從而可能形成一種其中脂質體分散液和治療劑被混合的狀態，此后其在制備上述脂質體組合物的方法中，通過進行在將治療劑引入脂質體分散液的脂質體內相中的其它步驟，有可能被使用。

在另一個實施方案中，藥劑盒可包含本文描述的脂質體組合物，包括用法說明書。

范例

以下實施例已被包括以提供給本領域普通技術人員實踐本公開主題的代表性實施方案的指導。按照本公開內容和本領域技術人員的一般水平，技術人員可意識到，以下實施例僅意味著是示例性的，并且可采用許多改變、修飾和變更而不背離目前公開的主題的范圍。以下實施例通過舉例說明的方式提供而不作為限制。

實施例1：實施例2-4的材料和方法

A. 合成可電離的β-環糊精的通用方法

用在吡啶中的0.9摩爾當量的甲苯磺酰氯對β-環糊精(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的6’伯羥基進行單甲苯磺酰化，以提供相應的甲苯磺酸鹽，通過用碘化鈉在丙酮中處理，將其轉化為碘代-衍生物。碘代衍生物與適當的胺經于80℃加熱8-12 h，被轉化為所需的氨基化環糊精(Tang和Ng (2008) Nat. Protocol. 3:691-697)。通過用0.9當量的琥珀酸酐在DMF中處理母體β-環糊精，合成6’-單琥珀酰基-β-環糊精(Cucinotta等(2005) J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 37: 1009-1014)。產物在丙酮中沉淀并在使用前經HPLC純化。通過用過量的琥珀酸酐在DMF中處理并用丙酮沉淀，從β-環糊精合成6’,6’,6’,6’,6’,6’,6’-七-琥珀酰基-β-環糊精。分級結晶以~85%純度提供所需的化合物。

通過用0.9摩爾當量的丹酰氯在吡啶中分別處理，從可市售獲得的β-環糊精和化合物II和III合成丹酰化環糊精I、IV和V。

各中間體和最終的產物通過HPLC，使用制備型C18柱和0-95%溶劑B (乙腈)/溶劑A (水)的線性梯度純化。所有環糊精通過¹H NMR和電噴霧電離(ESI) MS進行特征鑒定并與以前發表的參考文獻相匹配。

6’,6’,6’,6’,6’,6’,6’-七-氨基-β-環糊精購自CTD holdings并無需進一步純化而使用。

BI-2536 (Hoffmann等(2004) WO Published Patent Appl. 2004-076454)和PD-0325901 (Warmus等(2008) Bioorga. Med. Chem. Lett. 18:6171-617)如前所述合成。

B. 用于脂質體制備的通用程序

使氫化卵磷脂酰膽堿(Avanti Polar Lipids)、膽甾醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000 (DSPE-PEG 2000) (Avanti Polar Lipids) (摩爾比，50:45:5)溶于氯仿(20 ml)。真空除去溶劑，得到一個薄的脂質膜，其通過在適當的緩沖液(PBS, pH 7.4；200 mM檸檬酸鹽, pH4.0；或80 mM Arg-HEPES, pH 9.0)中，于50℃震搖2小時被水合。將囊泡懸浮液超聲處理30分鐘，然后于50℃通過0.4-、0.2-和0.1-μm聚碳酸酯膜(Whatman, Nucleopore Track-Etch Membrane)連續擠出，獲得最終的脂質體。然后通過脂質體針對300 mM蔗糖或磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)的平衡透析過夜創建跨膜梯度。平均尺寸和多分散性指數然后通過動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments)以633 nm的波長和90°的檢測角測定。

C. 被動加載脂質體的方案

方法1：BI-2536在脂質層中的包封。使氫化的卵磷脂酰膽堿(Avanti Polar Lipids)、膽甾醇，和DSPE-PEG2000 (Avanti Polar Lipids) (摩爾比50:45:5)溶于氯仿(20 mL)。加入10毫克的BI-2536 (在1 mL氯仿中)并蒸發溶劑以生成薄膜。加入1毫克的PBS (pH 7.4)以水合脂質層，并如上所述于50℃震搖該混合物2小時。超聲處理囊泡懸浮液30 min，然后于50℃通過0.4-、0.2-和0.1-μm聚碳酸酯膜(Whatman；Nuclepore Track-Etched Membrane)連續擠出，以獲得具有所需尺寸的低多分散性的最終脂質體。然后使脂質體在PBS中透析過夜以除去未截留藥物。然后通過動態光散射實驗在Malvern Z90上測量平均尺寸和多分散性指數。藥物含量通過用等體積的甲醇裂解脂質體并在NanoDrop 1000上測量UV-vis吸光度來計算。

方法2：脂質層與BI-2536的水性制劑的水合作用。使氫化的卵磷脂酰膽堿(Avanti Polar Lipids)、膽甾醇，和DSPE-PEG2000 (Avanti Polar Lipids) (摩爾比50:45:5)溶于氯仿(20 mL)，并真空蒸發溶劑以生成薄膜。加入1毫克的水性BI-2536 (4 mg；pH 5.5)以水合脂質層，并如上所述于50℃震搖該混合物2小時。超聲處理囊泡懸浮液30分鐘，然后于50℃通過0.4-、0.2-和0.1-μm聚碳酸酯膜(Whatman；Nuclepore Track-Etched Membrane)連續擠出，以獲得具有所需尺寸的低多分散性的最終脂質體。然后使脂質體針對PBS透析過夜以除去未截留藥物。然后通過動態光散射實驗在Malvern Z90上測量平均尺寸和多分散性指數。藥物含量通過用等體積的甲醇裂解脂質體并在NanoDrop 1000上測量UV-vis吸光度來計算。

D. 包封的復合物制備的通用程序

使等摩爾量的藥物(0.1 mmol；30-50 mg)和適當的環糊精(0.11 mmol；110-185 mg)分別溶于甲醇(幾乎飽和；~1-2 mL)和去離子水(~10-20 mg/mL)。然后將藥物的甲醇溶液在攪拌下滴加入環糊精溶液中，確保一種均勻的懸浮液。然后使用Eppendorf Thermomixer R，將該懸浮液于55℃震搖36-48小時。過濾該溶液以除去顆粒物質并在干冰/丙酮浴中快速冷凍，接著冷凍干燥。將凍干的復合物于-20℃貯存直至進一步使用。

E. 遠程加載脂質體的通用方案

上述凍干粉末復合物被粉碎并于65℃與適當的脂質體溶液(30-40 mg藥物等價物在6 mL脂質體溶液中，以獲得5-8 mg./mL濃度的加載比)孵育1小時。將它們以1,000 x g離心3分鐘以除去顆粒物質，然后針對300 mM蔗糖或市售的PBS溶液(pH 7.4)透析過夜，以除去未加載到脂質體中的材料。脂質體制劑的尺寸分布使用上述的Malvern ZS90儀器鑒定。在用等體積的甲醇于367 nm對BI-2536和于277 nm對PD-0325901破壞脂質體溶液后，使用Nanodrop 100按一式三份測量BI-2536和PD-0325901在脂質體中的濃度。

F. 組織生物分布研究

香豆素334被用作藥物代用品以評價環糊精-包封的脂質體的生物分布和藥代動力學。使香豆素334 (3 mg)溶于甲醇(6 mL)并滴加入環糊精VI的水性溶液(14 mg在20 mL水中)。于55℃震搖該溶液48小時并凍干。使凍干粉末與檸檬酸脂質體(內部pH 4.0)于65℃孵育1小時。將脂質體溶液對PBS透析過夜。為評價加載效率，用100 μL甲醇破壞100 μL脂質體并分析熒光。加載效率被發現是90%。按照在Macdiarmid等(2007) Cancer Cell 11:431-445中描述的修改方案，將攜帶HCT116皮下異種移植物的雌性無胸腺nu/nu小鼠用于該研究。當腫瘤體積達到400-600 mm³時，12只小鼠用200 μL環糊精-包封的脂質體(CYCL-)香豆素334 (0.5 mg/mL)經靜脈內(i.v.)治療。治療后，在時間點2、24和48小時對4只小鼠施行安樂死，切除腫瘤、脾、肝、腎、心，和肺并稱重。也收集血液，并分離血漿并于4℃貯存。除了血漿，勻化各冷凍組織并在0.9%鹽水[3 x 體積(μL)的組織質量(mg)]中超聲處理。在渦流下將甲醇加入至最終體積33% (vol/vol)。將樣品離心(6,000 x g持續10分鐘)，上清液中的熒光通過CytoFluor II熒光多層板閱讀儀(Applied Biosystems)，使用激發485 nm/發射530 nm測量。作為一種對組織自體熒光的對照，將用等效體積的空脂質體治療的攜帶腫瘤的動物實施安樂死并收獲它們的組織和血漿。

G. 小鼠體內治療

將5百萬HCT116 (p53^-/-)、HCT116 (p53+/+)，或RKO細胞皮下(s.c.)注入雌性無胸腺nu/nu小鼠的腹側并允許生長3周，達到體積300-400 mm³。在CYCL-BI-2536的情況下，然后將動物隨機分成4組。在所有的情況下，脂質體制劑(CYCL-藥物)已被報道為游離藥物的等價物。在2周的過程中，第一組接受空脂質體；第二組接受單一劑量100 mg/kg制劑的游離藥物兩次，使用在文獻中報告的制劑(在0天和7天)；第三和第四組在相同的時間點分別接受100 mg/kg和400 mg/kg的CYCL-BI-2536脂質體制劑。每48小時記錄腫瘤體積。各個組的平均腫瘤尺寸被歸一化為在治療的第一天的腫瘤體積。在CYCL-PD-0325901的情況下，第一組用空脂質體在0天和8天處理兩次，而其它兩組在相同的時間點分別接受2個劑量的游離PD-0325901和CYCL-PD-0325901。為了清晰的實驗結果，數據表示為各組歸一化為在0天的腫瘤體積的平均腫瘤尺寸。終止在各種情況下的腫瘤消退實驗并在對照動物的腫瘤達到2,000 mm³時對動物實施安樂死。

實施例2：遠程加載化學修飾的β-環糊精至脂質體中

設計和合成一組在其6’-位攜帶可電離基團的修飾的β-環糊精(圖2)。在類似物II-V中，6’伯羥基部分被修飾為氨基、乙二氨基，或二者中任一個的熒光形式，而類似物VIII涉及在該位引入琥珀酰基。其它的類似物(VI、VII和IX)具有全部7個被氨基、乙二氨基，或琥珀酰基部分替代的伯羥基。所有類似物經HPLC純化并用MS和NMR譜特征鑒定。適當的陰性對照物通過引入不含可電離基團的類似大小的化學修飾合成。

對兩個熒光(丹酰化)環糊精(化合物IV和V)測試其加載到脂質體的能力。脂質體通過脂質薄膜與200 mM檸檬酸鹽緩沖液水合而生成，以致它們的內部pH是4.0。然后將這些脂質體在PBS (pH 7.4)中透析以從脂質體外側除去檸檬酸鹽，然后于65℃與已溶于PBS中的環糊精一起孵育1小時。作為對照，PBS-加載的脂質體通過脂質薄膜與代替檸檬酸鹽的PBS再水合而生成。在相對高的溫度(65℃)的孵育提高脂質雙層的流動性，因此允許環糊精穿過它。然后使懸浮液在PBS中透析過夜以除去未結合到脂質體中的環糊精并分析丹酰基熒光。這些實驗顯示這些環糊精的每一種的>90%被截留在脂質體中(見，例如，圖3A和4)。在pH梯度的不存在下，幾乎沒有相同的化合物結合到脂質體中(圖3A)。光散射顯示，預形成的“空”脂質體具有伴有窄的多分散性指數(<0.10)的98 nm的平均直徑(圖3B)。環糊精的結合僅稍稍增加平均直徑至105 nm，而不改變多分散性指數(圖3C)。冷凍透射電子顯微鏡觀察發現，環糊精結合后的脂質體結構沒有改變，除了增加脂質體內的密度外，大概反映在它們內部的高濃度環糊精(圖3C)。相反，環糊精與對照品，無跨膜pH梯度的含PBS的脂質體一起孵育，導致不規則形狀的大泡，沒有證據表明，在它們內的環糊精結合(圖3D)。用對照脂質體觀察到的形狀的變化大概是由于環糊精與脂質雙層的締合，導致脂質體結構的不穩定和“腫脹”。

實施例3：包封在化學修飾的β-環糊精內并輸送到脂質體中的小的疏水化合物

使用有機染料(香豆素)以測定修飾的環糊精是否可包封和轉運疏水性化合物越過脂質體雙層。香豆素是非常疏水的并在它們被包封到6’-單乙二氨基-6’-脫氧-環糊精(化合物III)中后觀察到水溶性的極大改善。已確定包封香豆素的最有效和便利的方法是通過冷凍干燥(Cao等(2005) Drug Dev. Industr. Pharm. 31:747-756；Badr-Eldin等(2008) Eur. J. Pharm. Biopharm. 70:819-827)。通過這種步驟，香豆素的溶解性增加至少10-至20-倍(從100 μg/mL至1-2 mg/mL)。一旦溶解，環糊精-香豆素復合物與預形成的完全如上所述的脂質體一起孵育，使用pH梯度以驅動化合物越過雙層。在過夜透析以除去未結合的復合物后，接著用甲醇破壞脂質體并測量香豆素熒光。如通過熒光光譜法所示的，所有的環糊精-染料復合物被高效地結合到脂質體中(>95%；圖5)。為確定這種高效加載確實是由于復合物越過脂質膜的主動轉運，而不是僅僅由于提高的水溶性，評價了香豆素314在環糊精的不存在下的加載效率，發現其在相同條件下幾乎不能結合到脂質體中(圖6)。重要的是，包封在不可電離的天然β-環糊精中的香豆素314僅僅稍微提高了加載效率，盡管染料的水溶性大大增加。香豆素染料結合到脂質體中可容易地被肉眼辨別，因為香豆素-環糊精脂質體是亮黃色的，而對照脂質體(例如，不用環糊精制得)是無色的(圖5A-5C)。

實施例4：包封在化學修飾的β-環糊精內并輸送到脂質體中的化療劑

氨基-官能化的環糊精產生BI-2536的脂質體制劑的能力被測定(圖7)。由Boehringer Ingelheim開發的BI-2536是polo-樣激酶(PLK1)的高度選擇性抑制劑，所述激酶為一種適當執行有絲分裂所需的酶(Steegmaier等(2007) Curr. Biol. 17:316-322；Lenart等(2007) Curr. Biol. 17:304-315；和Stewart等(2011) Exp. Hematol. 39:330-338)。已顯示BI-2536具有有效的對抗癌細胞，特別是那些在TP53中攜帶突變的癌細胞的殺滅腫瘤活性(Sur等(2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:3964-3969；Sanhaji等(2013) Cell Cycle 12:1340-1351；Meng等(2013) Gynecol. Oncol. 128:461-469；和Nappi等(2009) Canc. Res. 69:1916-1923)。BI-2536是在患有肺、乳腺、卵巢和子宮癌癥的患者中幾個臨床試驗的主題(Mross等(2012) Br. J. Canc. 107:280-286；Ellis等(2013) Clin. Lung Canc. 14:19-27；Hofheinz等(2010) Clin. Canc. Res. 16:4666-4674；Sebastian等(2010) J. Thorac. Oncol. 5: 1060-1067；Schoffski等(2010) Eur. J. Canc. 46:2206-2215；和Mross等(2008) J. Clin. Oncol. 26:5511-5517)。雖然它已顯示在癌癥患者中有效的證據，其開發在II期試驗顯示在亞-治療劑量的不可接受的毒性(4級中性粒細胞減少癥)后被放棄。

本文已確定，氨基化環糊精V和VI極大地改善BI-2536的水溶性。至于香豆素，BI-2536復合物已被確定可使用化合物VI重復加載到脂質體中，獲得穩定的含有10 mg/mL藥物的水性溶液。比較起來，游離BI-2536的最大水溶性被測定為0.5 mg/mL。為評價環糊精-包封的、BI-2536的脂質體(CYCL)形式的活性，它們的作用在攜帶人HCT116結腸直腸癌細胞的皮下異種移植物的裸鼠中評價。在HCT116細胞皮下注入小鼠后3周，用空脂質體、游離BI-2536，或CYCL-BI-2536治療它們。在治療開始時，腫瘤已經是相對大的，平均~300 mm³并比小腫瘤更接近地模擬臨床情況。當游離藥物以125 mg/kg經靜脈內(iv)給予時，幾種急性毒性是明顯的：小鼠在數分鐘內變得昏睡，它們的眼睛變成玻璃狀，它們表現出毛發豎起，并在數小時后死亡(圖8A)。用稍稍較低劑量的游離BI-2536 (100 mg/kg)治療的小鼠在藥物給予之后即刻表現出有些遲鈍，但仍存活。然而，遲發性毒性，表現為外周WBC的急劇下降，在游離藥物給予后24-36小時內是明顯的。這種類型的毒性與在人臨床試驗中觀察到的毒性是相同的(Mross等(2008) J. Clin. Oncol. 26:5511-5517；Frost等(2012) Current Oncol. 19:e28-35；和Vose等(2013) Leuk. Lymphom. 54: 708-713)。雖然對骨髓有毒性，游離BI-2536能夠誘導顯著的抗-腫瘤反應，在以其最大耐受劑量(MTD)給予兩個劑量后延緩腫瘤生長達~30% (圖7B)。這樣的效率以前在其它鼠科動物模型中觀察到(Steegmaier等(2007) Curr. Biol. 17:316-322；Nappi等(2009) Canc. Res. 69:1916-1923；Ackermann等(2011) Clin. Canc. Res. 17:731-741；Grinshtein等(2011) Canc. Res. 71:1385-1395；Liu等(2011) Anti-Canc. Drugs 22:444-453；和Ding等(2011) Canc. Res. 71:5225-5234)并為臨床試驗提供了理論基礎。

CYCL-BI-2536被證明在毒性和療效兩方面遠遠優于游離形式。CYCL-BI-2536，甚至在500 mg/kg的劑量，也不引起任何顯著的不良反應；該劑量是殺死每一只動物的游離藥物劑量的4-倍(圖8A)。在100 mg/kg的劑量(等同于游離藥物的MTD)，CYCL-BI-2536誘導了顯著改善的腫瘤反應，在僅僅兩個劑量后延緩腫瘤生長幾近80% (圖8B)。在400 mg/kg的劑量，CYCL-BI-2536不僅導致腫瘤較慢的生長，而且還導致腫瘤的部分消退(圖8B)。不能給予游離CYCL-BI-2536的等效劑量，因為小鼠在甚至接近于該量的劑量時不能存活(圖8B)。而且，用CYCL-BI-2536治療，導致相對很少的骨髓毒性，因為WBC降低非常少，因而沒有對動物造成危險(圖8C)。最后，已確定CYCL-BI-2536具有比游離藥物對抗第二個人類結腸直腸癌模型(具有基因失活的TP53等位基因的HCT116細胞)大得多的效果。在兩種情況下，用CYCL-形式的藥物觀察到明顯的消退，但用游離藥物未觀察到消退。

為建立CYCL脂質體的生物分布和藥代動力學，用包封在環糊精VI中的香豆素334加載的脂質體被用來經靜脈內(i.v.)注射治療攜帶HCT116的小鼠。對得自在治療后2、24和48小時收獲的主要組織的樣品分析它們的熒光。如所期望的，香豆素334從治療后48小時檢查的大多數組織中清除。重要的是，包封在脂質體中的藥物持續存在于血和腫瘤中，其與PEG化脂質體的典型的藥代動力學一致(圖9)。

基于環糊精的加載方法也與在脂質體中截留疏水的和不溶性藥物的最常見的方法比較。首先，試圖在脂質雙層直接截留BI-2536。使BI-2536與氫化的卵磷脂酰膽堿-膽甾醇-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000 (DSPE-PEG 2000)共蒸發以制備薄膜，其隨后與1 mL PBS水合，并以700 psi通過100-nm聚碳酸酯膜擠出，以制備小單層囊泡(平均粒徑(Z_avg) 126 nm；PDI 0.09)。在針對PBS透析過夜以除去未截留藥物后，含有藥物的脂質體迅速腫脹(Z_avg 539 nm；PDI 0.49)并釋放幾乎90%的截留藥物。其次，脂質薄膜與BI-2536的水性制劑水合(被動加載)。脂質薄膜的水合，接著擠出和透析，導致穩定的脂質體。然而，包封效率是<10%，是用本文描述的修飾的環糊精獲得的效率的1/20。

為了進一步證明這種方法的一般性，評價了PD-0325901，一種由Pfizer開發的有絲分裂原-激活的蛋白質激酶激酶1 (MEK1)抑制劑，其因為在2期試驗引起視網膜靜脈阻塞(RVO)而被放棄(Brown等(2007) Canc. Chemo. Pharmacol. 59:671-679；LoRusso等(2010) Clin. Canc. Res. 16:1924-1937；Haura等(2010) Clin. Canc. Res. 16:2450-2457；和Huang等(2009) J. Ocul. Pharmacol. Therap. 25:519-530)。對氨基化環糊精(圖2，化合物VI和VII)，以及琥珀酰基化環糊精(圖2，化合物VIII和IX)測試了它們包封PD-0325901并將它們分別加載到酸性或堿性脂質體的能力。游離藥物是極不溶性的(0.1 mg/mL在水中)，而其溶解性在包封進入環糊精之后增加幾乎40-倍。最好的脂質體加載用琥珀酰基化環糊精IX實現，并如上對BI-2536所述，在攜帶人腫瘤異種移植物的動物中，測試了這種制劑。與BI-2536一樣，PD-0325901復合物被重復加載到脂質體中，獲得穩定的含有5 mg/mL藥物的溶液。

為了評價環糊精-復合的、PD-0325901的脂質體(CYCL)形式的活性，分析了它們在RKO異種移植物模型中的作用。以游離藥物，嚴重的急性毒性是明顯的。在先前的研究中，游離藥物經口管飼給予，因為其溶解性不足以用于靜脈內給藥。以200 mg/kg經口管飼后，治療的動物在數分鐘內昏睡，并在接下來的幾小時內它們出現聳肩(hunched)且總是在24小時內死亡(圖10A)。用稍稍較低劑量的游離PD-0325901 (150 mg/kg)治療的小鼠在給藥后即刻表現出類似的癥狀，但經24小時恢復。然而，單一劑量的游離PD-0325901不能誘導顯著的抗-腫瘤反應，僅延緩腫瘤生長達~5% (圖10B)。這個結果與那些先前在其它鼠科動物模型中報告的結果一致；游離藥物的較高效率需要多個劑量。

相比之下，CYCL-PD-0325901證明遠遠優于游離藥物。甚至在500 mg/kg的劑量，CYCL-PD-0325901未引起任何顯著的不良反應；該劑量是殺死每一只動物的游離藥物劑量的2.5-倍(圖10A)。在單一劑量250 mg/kg，CYCL-PD-0325901不僅導致腫瘤較慢的生長，而且還導致腫瘤的部分消退(圖10B)。最后，針對兩個其它的人類結腸直腸癌癥模型(HCT116及其與基因失活的TP53等位基因的同基因的配對物)對CYCL-PD-0325901進行了評價并類似地觀察到與游離藥物比較的較高的效力和較低的毒性(圖11)。

上述結果證實基于使用在它們的外表面上具有可電離基團的修飾的環糊精，將疏水的藥物加載到脂質體中的一般策略(圖2)。這些環糊精的“口袋”可包封疏水性藥物并使用簡單的pH梯度輸送它們越過常規脂質體的雙層膜。在此已證實，許多類型的化合物可成功地被包封進入修飾的環糊精中，包括香豆素染料和潛在臨床意義的藥物(圖3、5、8和10)。這種結合不僅極大地增加所有這些化合物的水溶性，而且還允許它們被遠程加載到脂質體中。而且，當在小鼠的癌癥模型中試驗時，加載的脂質體表現出基本上更少的毒性(圖8)和更大的活性(圖8和10)。

先前的使環糊精包合物與脂質體結合的嘗試僅限于不溶性藥物的被動加載(Zhu等(2013) J. Pharm. Pharmacol. 65(8):1107-1117；Malaekeh-Nikouei和Davies (2009) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 63:139-148；Rahman等(2012) Drug Deliv. 19: 346-353；Ascenso等(2013) J. Liposome Res. 23:211-219；Dhule等(2012) Nanomedicine 8:440-451；Lapenda等(2013) J. Biomed. Nanotechnol. 9:499-510；和Mendon?a等(2012) AAPS PharmSciTech. 13:1355-1366)或可溶性藥物的主動加載(Modi等(2012) J. Control Release 162:330-339)。被動加載常常導致不希望的膜結合，降低脂質體穩定性，并且比主動加載的效率低得多。例如，通過本文描述的方法實現的藥物與脂質比的范圍為從0.4至0.6，其是通過被動加載通常獲得的藥物與脂質比的超過1,000-倍(Zhu等(2013) J. Pharm. Pharmacol. 65(8):1107-1117；Malaekeh-Nikouei和Davies (2009) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 63:139-148；Rahman等(2012) Drug Deliv. 19:346-353；Ascenso等(2013) J. Liposome Res. 23:211-219；Dhule等(2012) Nanomedicine 8:440-451；和Modi等(2012) J. Control Release 162:330-339)。

因為現今和過去開發的許多最有前景的藥物是相對不溶的，本文描述的方法可以是廣泛適用的。所述方法不僅增加水溶性，而且還通過提高的滲透性和滯留(EPR)效應，提高藥物傳遞至腫瘤的選擇性(Wang等(2012) Annu. Rev. Med. 63:185-198；Peer等(2007) Nat. Nanotech. 2:751-760；Gubernator (2011) Exp. Opin. Drug Deliv. 8:565-580；Huwyler等(2008) Int. J. Nanomed. 3:21-29；Maruyama等(2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63:161-169；Musacchio和Torchilin (2011) Front. Biosci. 16:1388-1412；Baryshnikov (2012) Vest. Ross. Akad. Med. Nauk. 23-31；和Torchilin (2005) Nat. Rev. Drug Disc. 4:145-160)。使用BI-2536的結果提供這些屬性的好處的一個突出的例子——同時增加溶解性和選擇性腫瘤傳遞，這導致更少得多的毒性和增加的效力。因此這些策略具有“拯救”在艱苦和昂貴的藥物開發過程中的最后步驟之一失敗的藥物的能力，允許以較高的劑量給予并具有比其它可獲得的藥物更少的毒性。

通過引用結合

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等同方案

本領域技術人員將認識到，或使用不超過常規實驗能夠確定，對本文所述的本發明的具體實施方案的許多等同方案。這樣的等同方案意欲包括在隨附的權利要求中。