用于修飾抗體以制備免疫綴合物的特定位點的制作方法

            文檔序號:11159350閱讀:2214來源:國知局
            歸因于抗體對于多種治療性應用的重要性,需要選擇性修飾抗體的穩健的方法以引入改善的特性或額外的功能。本申請公開了特定位點用于部分與抗體接合以產生修飾的抗體,如用于制備抗體-藥物綴合物(ADC)。選擇性綴合位點位于抗體的恒定區上并且因此可用于多種抗體。背景用于修飾抗體的方法的價值是熟知的,并且已經開發了用于綴合抗體以接合多種“有效載荷(payload)”部分的許多方法。這些方法中許多依賴于抗體上天然存在的可以用來接合有效載荷的特定反應性氨基酸殘基,如賴氨酸和半胱氨酸。然而,依賴于天然氨基酸并不總是合乎需要,因為連接的有效載荷的位置和量取決于那些反應性氨基酸的數目和位置:過多或過少的這類殘基導致難以有效控制有效載荷負載到抗體上。此外,反應性氨基酸的安置可能使其難以獲得完整綴合,在綴合期間導致不均一產物。例如,藥物有效成分的不均一性一般是不利的,因為它加重了向異質的受試者群體施用藥物的不可預測性:十分優選施用均質產物,并且充分表征及預測不均一產品的行為是非常困難的。細胞毒藥物通過例如工程化的半胱氨酸殘基與抗體的位點特異性綴合導致顯示出改善治療指數的均一免疫綴合物(Junutula等人,(2008)NatBiotechnol.26(8):925-932))。已經工程化抗體以在特定位置中添加某些殘基如半胱氨酸,其中這些殘基可以用于綴合(Lyons等人,(1990)ProteinEng.,3:703-708),但是特定置換的值可能隨某些抗體而變動,因為工程化的半胱氨酸可能干擾抗體的折疊及正確分子內二硫鍵的氧化(Voynov等人,(2010)Bioconjug.Chem.21(2):385-392)。因為抗體生物合成期間通過二硫鍵用谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修飾哺乳動物細胞中表達的抗體中的工程化半胱氨酸(Chen等人(2009)mAbs1:6,563-571),如初始表達的抗體藥物綴合物產物中的修飾半胱氨酸對巰基反應性試劑無反應。工程化半胱氨酸的激活需要還原GSH和/或半胱氨酸加合物(其一般導致抗體的全部鏈間二硫鍵還原),隨后在綴合之前天然鏈間二硫鍵的再氧化和重新形成(Junutula等人,(2008)Nat.Biotechnol.26(8):925-32)。一些其中已經插入半胱氨酸的位點干擾了再氧化過程并隨后產生不利的、非均質的綴合產物。因此重要的是鑒定抗體上引入半胱氨酸的位點不干擾在與硫醇反應性試劑如馬來酰亞胺或溴乙酰胺、氯乙酰胺或碘乙酰胺基團綴合之前的再次氧化過程。半胱氨酸殘基與溴乙酰胺、碘乙酰胺或氯乙酰胺的綴合導致穩定硫醚鍵的形成。(Alley等人,(2008)BioconjugChem.19(3):759-65)。然而,這種化學比馬來酰亞胺綴合化學更低效。由于形成這類巰基-馬來酰亞胺鍵是在接合有效載荷或接頭至半胱氨酸時使用的流行和高度有效的方法,所以需要鑒定在抗體上可以使用馬來酰亞胺鍵的半胱氨酸置換位點。更重要地,位點特異性綴合的免疫綴合物可以顯示改善的治療指數,因此依舊需要鑒定抗體中用于半胱氨酸置換的專用位點,所述專用位點能夠使有效載荷到抗體上的綴合過程高效地形成,并且提供具有高穩定性的綴合物。本申請為綴合目的提供產生改善的抗體的這類專用半胱氨酸置換位點以及包含這類改善的抗體的免疫綴合物。發明概述本申請提供在抗體或抗體片段的恒定區中的特定位點,在所述位點,可以進行半胱氨酸(“Cys”)替換親本抗體或抗體片段上的天然氨基酸,旨在提供Cys殘基用于接合化學部分(例如,有效載荷/藥物部分)以形成具有良好效率和穩定性的免疫綴合物。本申請進一步提供在一個或多個這些特定位點中具有一個或多個Cys殘基的工程化抗體或抗體片段,以及由這類工程化抗體或抗體片段制成的免疫綴合物。在抗體的特定位置處插入Cys的方法是本領域已知的,參見,例如,WO2011/005481。但是,本申請公開了在抗體或抗體片段的恒定區中的特定位點,其中用Cys替換親本抗體或抗體片段的一個或多個天然氨基酸提供了以下一個或多個優點:促進高效免疫綴合的良好反應性;當使用Cys-馬來酰亞胺綴合接頭時有效載荷丟失的傾向降低;形成不利二硫鍵如抗體之間交聯或形成非天然分子內二硫鍵的傾向降低;和所產生的ADC的疏水性低。選擇特定專用位點以便Cys替換親本抗體或抗體片段恒定區中的天然氨基酸,以提供有效綴合,同時使不利影響最小化。首先,選擇用于修飾的特定位點,從而在一個或多個選擇的位置中用Cys替換親本抗體或抗體片段的天然氨基酸提供了在新半胱氨酸上輕易綴合的抗體或抗體片段。選擇表面充分可及的特定位置以允許半胱氨酸殘基的硫氫基對水溶液中的親電體有反應性。鑒定合適位點用于Cys替換親本抗體或抗體片段的天然氨基酸涉及基于晶體結構數據分析天然氨基酸的表面暴露。因為本文所述的位點是充分可及和反應的,所以借助本領域熟知用于修飾天然存在的半胱氨酸殘基的化學,它們可以用來形成免疫綴合物。Cys替換殘基的綴合因此使用常規方法。當綴合中使用巰基-馬來酰亞胺部分時,選擇的修飾位點可以顯示低的綴合逆轉傾向性。巰基-馬來酰亞胺綴合反應經常具有高度選擇性并且極端有效的,并且可以用來接合有效載荷至蛋白質的半胱氨酸殘基的巰基或作為蛋白質和有效載荷之間的鍵接中的其他地方的接頭。例如,馬來酰亞胺可以與蛋白質(例如,抗體或抗體片段)接合,并且可以添加具有接合的巰基的有效載荷至馬來酰亞胺以形成綴合物。因此,在這個綴合步驟中,蛋白質(例如,抗體或抗體片段)可以是單圈或雙圈;另一個代表有效載荷。免疫綴合物穩定性信息在此特別地涉及通過與馬來酰亞胺基反應而綴合置換的半胱氨酸。在一些實施方案中,巰基來自蛋白質(例如,抗體或抗體片段)上的半胱氨酸,因而雙圈代表蛋白質并且單圈代表有效載荷。盡管巰基-馬來酰亞胺反應經常用于產生綴合物,但是如下文所述的綴合步驟逆轉可能導致有效載荷丟失或其他含巰基的種類弄亂了有效載荷。已經報道,一些半胱氨酸置換位點比其他位點提供更穩定的馬來酰亞胺綴合物,假定地認為是因為抗體表面上新半胱氨酸周圍的某些點處的局部化學環境可以促進琥珀酰亞胺環水解并因此防止免疫綴合物中的巰基-馬來酰亞胺鍵逆轉(Shen等人,(2012),Nat.Biotechnol.30(2):184-9)。鑒定有利位點以符合這種標準涉及插入Cys替換許多具有合適表面暴露的天然氨基酸,產生含有巰基-馬來酰亞胺鍵的免疫綴合物,并且評估免疫綴合物的穩定性,以消除其中綴合物的穩定性因去穩定化位點周圍的局部微環境而降低的位點。因此,可以用來接合接頭和有效載荷至Cys替換殘基的化學不受與上文討論的巰基-馬來酰亞胺綴合物可逆性相關的穩定性問題限制。眾多方法可以用來在半胱氨酸處形成綴合物,包括馬來酰亞胺綴合法。當使用最常見的綴合方法之一時,本文所述的用于半胱氨酸置換的位點促進抗體綴合物產物的穩定性,使得這些位點有利于抗體工程化,因為修飾的抗體可以隨熟知和高度有效的馬來酰亞胺綴合法一起使用。選擇的位點可以如此安置,從而最大限度減少可能干擾均勻綴合物形成的不利二硫鍵形成。當含有工程化半胱氨酸的抗體或抗體片段在哺乳動物細胞中產生時,Cys殘基一般相對于游離Cys氨基酸或谷胱甘肽作為二硫鍵存在(Chen等人,(2009)mAbs16,353-571)。為了釋放Cys殘基用于具巰基反應基團的綴合,抗體或抗體片段需要被還原,破壞全部二硫鍵。抗體或抗體片段隨后在促進抗體或抗體片段穩定化的天然二硫鍵形成的條件下再氧化。一旦再氧化,在抗體或抗體片段的表面上過于明顯暴露的半胱氨酸殘基可以通過與另一抗體或抗體片段上的Cys反應形成二硫鍵(“抗體間二硫鍵”),或可以通過形成不利的抗體內二硫鍵來形成二硫鍵。已經發現置于本文所述特定位點中的半胱氨酸殘基是可用于高效綴合而適當可及的,但是得到充分防護或適當安置以減少或消除形成抗體間和抗體內二硫鍵,所述抗體間和抗體內二硫鍵否則將在表達Cys修飾的抗體時通常需要的還原/再氧化過程期間出現。類似地,在再氧化后,發現一些位點產生似乎因工程化到蛋白質中的新Cys殘基的位置所致的不均一綴合產物,并且本文中確定的特定位點是最大限度減少這類不均一性的那些位點。優選在使藥物有效載荷與溶劑相互作用隔絕并且接合有效載荷時接合可以增加抗體疏水性的位點綴合藥物有效載荷,因為通常認為減少蛋白質治療藥的疏水性有益的,原因在于它可能減少聚集和從循環清除。當每個抗體接合4、6或8個有效載荷時或當特別地使用疏水性有效載荷時,選擇導致疏水性變化最小的接合位點可能是特別有益的。使用這些方法和本文實施例中描述的額外方法評價用于并入Cys的位點,這導致選出用于并入Cys的優選位點,用于工程化抗體或抗體片段以引入Cys作為綴合的位點,特別用于產生ADC。本文中提供了關于選擇特定位點以將抗體的天然氨基酸替換為Cys的額外細節。半胱氨酸置換位點位于抗體或抗體片段的恒定區,并且本文中使用標準編號習慣進行確定。然而,熟知的是,可以出于多個目的使用抗體的部分或片段,代替完整全長抗體,并且還熟知的是,抗體可以按照影響恒定區中位點編號的多種方式修飾,盡管如此,它們基本上不影響恒定區發揮作用。例如,已經顯示向抗體的環區域插入S6標簽(短肽)允許保留抗體的活性,盡管它將改變抗體中許多位點的編號。因此,盡管通過基于完整抗體編號的標準編號體系確定本文所述的優選半胱氨酸置換位點,但是本申請包括在抗體片段中或在含有其他修飾(如肽標簽插入)的抗體中的相應位點。在這些片段或修飾的抗體中的相應位點因此是用于片段或修飾的抗體中半胱氨酸置換的優選位點,并且通過數字對半胱氨酸置換位點的提及包括在修飾的抗體或抗體片段中保留全長抗體的有關部分的功能的相應位點。可以通過以下方式輕易鑒定在抗體片段或修飾的抗體中的相應位點:將抗體片段或修飾抗體的區段與全長抗體比對以確定在抗體片段或修飾的抗體中匹配本發明的優選半胱氨酸置換位點之一的位點。比對可以基于這樣的區段,所述區段長到足以確保該區段匹配全長抗體的合適部分,如至少20個氨基酸殘基、或至少50個殘基、或至少100個殘基、或至少150個殘基的區段。比對還可以考慮可能已經工程化到抗體片段或修飾的抗體中的其他修飾,因此將允許因用于比對的區段中的工程化點突變(尤其對于保守性置換)所致的序列差異。因此,例如,Fc結構域可以從抗體切除,并且將含有對應于本文所述的半胱氨酸置換位點的氨基酸殘基,盡管存在編號差異:Fc結構域中與本公開的半胱氨酸置換位點相對應的位點也將預計是Fc結構域中用于半胱氨酸置換的有利位點,并且納入本申請的范圍。在一個實施方案中,本申請提供式(I)的免疫綴合物:其中Ab代表抗體或抗體片段,所述抗體或抗體片段包含至少一個在本文所述的優選半胱氨酸置換位點之一處的半胱氨酸殘基;LU是如本文所述的接頭單元;X是有效載荷或藥物部分;并且n是從1至16的整數。一般在式(I)的化合物中,LU在本文所述的半胱氨酸置換位點之一處與半胱氨酸接合,X是藥物部分如抗癌藥物,并且當Ab是抗體時,n是2-8,或當Ab是抗體片段時,n可以是1-8。在一個實施方案中,本申請提供一種包含修飾的抗體或其抗體片段和藥物部分的免疫綴合物,其中所述修飾的抗體或抗體片段包含在其恒定區上半胱氨酸對一個或多個氨基酸的置換,所述恒定區選自所述抗體或抗體片段的重鏈的位置121、124、152、171、174、258、292、333、360和375,其中所述位置根據EU系統編號。在一個實施方案中,本申請提供一種包含修飾的抗體或其抗體片段和藥物部分的免疫綴合物,其中所述修飾的抗體或抗體片段包含在其恒定區上半胱氨酸對一個或多個氨基酸的置換,所述恒定區選自所述抗體或抗體片段的輕鏈的位置107、108、142、145、159、161和165,其中所述位置根據EU系統編號,并且其中所述輕鏈是人κ輕鏈。在一個實施方案中,本申請提供一種包含修飾的抗體或其抗體片段和藥物部分的免疫綴合物,其中所述修飾的抗體或抗體片段包含在其恒定區上半胱氨酸對一個或多個氨基酸的置換,所述恒定區選自所述抗體或抗體片段的輕鏈的位置143、147、159、163和168,其中所述位置根據Kabat系統編號,并且其中所述輕鏈是人λ輕鏈。在一個實施方案中,本申請提供了包含在本文所述的位置處半胱氨酸對一種或多種氨基酸的置換的修飾抗體或其抗體片段。半胱氨酸置換位點位于抗體的恒定區中并因此適用于多種抗體,并且選擇位點以提供穩定和均一的綴合物。修飾的抗體或片段可以具有兩個或更多個半胱氨酸置換,并且這些置換可以與如本文所述的其他抗體修飾和綴合方法組合使用。在一個實施方案中,本申請提供了包含上文公開的免疫綴合物的藥物組合物,和使用免疫綴合物的方法。在一個實施方案中,本申請提供編碼本文所述的修飾的抗體或抗體片段的核酸,所述修飾的抗體或抗體片段在本文所述的位點處具有至少一個半胱氨酸置換。本申請還提供包含這些核酸的宿主細胞和使用核酸或宿主細胞表達并產生本文所述的抗體或片段的方法。在一個實施方案中,本申請提供選擇抗體的氨基酸的方法,所述氨基酸適于被半胱氨酸替換以提供良好的綴合位點,所述方法包括:(1)確定抗體恒定區中具有合適的表面暴露的氨基酸,以提供一組初始候選位點;(2)對于每個初始候選位點,表達該位點處的天然氨基酸被半胱氨酸替換的抗體;(3)對于每種表達的抗體,確定表達的蛋白質是否在還原和再氧化后基本上均一,以提供在初始候選位點處具有游離半胱氨酸的抗體,(4)對于基本上均一和有功能的每種表達的蛋白質,使初始候選位點處的半胱氨酸與馬來酰亞胺部分綴合并且確定巰基-馬來酰亞胺鍵是否在該位點處穩定;(5)從一組初始候選位點移除表達的抗體基本上不均一及無功能的那些位點,和移除巰基-馬來酰亞胺鍵去穩定化的那些位點,以提供一組用于半胱氨酸置換的優勢位點。任選地,該方法還包括以下步驟:確定具有每個優勢半胱氨酸置換位點的綴合物的熔化溫度,并且從該組消除其中半胱氨酸置換和綴合造成熔化溫度與天然抗體的熔化溫度相差5℃或更多的任何位點。在一個實施方案中,本申請提供產生免疫綴合物的方法,所述方法包括將接頭單元(LU)或接頭單元-有效載荷組合(-LU-X)接合至抗體或抗體片段中的半胱氨酸殘基,其中半胱氨酸位于選自所述抗體或抗體片段的重鏈位置121、124、152、171、174、258、292、333、360和375以及所述抗體或抗體片段的輕鏈位置107、108、142、145、159、161和165的半胱氨酸置換位點,其中所述位置根據EU系統編號。本文中更詳細地描述本申請的其他方面和實施方案。以下是本申請的實施方案。1.包含修飾的抗體或其抗體片段的免疫綴合物,其中所述修飾的抗體或抗體片段包含在其恒定區上用半胱氨酸置換兩個或多個氨基酸的組合,其中組合包含選自抗體重鏈的位置360和抗體κ輕鏈的位置107的置換,其中所述位置根據EU系統編號。2.包含修飾的抗體或其抗體片段的免疫綴合物,其中所述修飾的抗體或抗體片段包含在其恒定區上用半胱氨酸置換兩個或多個氨基酸的組合,其中組合包含選自抗體重鏈的位置152和375的置換,其中所述位置根據EU系統編號。3.包含修飾的抗體或其抗體片段的免疫綴合物,包含SEQIDNO:48的重鏈恒定區和包含SEQIDNO:61的κ輕鏈恒定區。4.包含修飾的抗體或其抗體片段的免疫綴合物,包含SEQIDNO:131的重鏈恒定區。5.實施方案1-4中任一項的免疫綴合物,其中免疫綴合物還包含藥物部分。6.實施方案1-5中任一項的免疫綴合物,其中藥物/抗體比是約4。7.實施方案1-6中任一項的免疫綴合物,其中所述藥物部分通過所述半胱氨酸的硫和任選的接頭與修飾的抗體或抗體片段連接。8.實施方案1-7的免疫綴合物,其中所述藥物部分通過可切割或不可切割的接頭與所述半胱氨酸的所述硫連接。9.實施方案8的免疫綴合物,其中所述藥物部分通過不可切割的接頭與所述半胱氨酸的所述硫連接。10.實施方案7-9的免疫綴合物,其中所述免疫綴合物包含巰基-馬來酰亞胺鍵。11.實施方案10的免疫綴合物,其中所述免疫綴合物包含–S-CH2-C(=O)-鍵或二硫鍵。12.實施方案11的免疫綴合物,其中所述藥物部分是細胞毒性劑。13.實施方案12的免疫綴合物,其中所述藥物部分選自紫杉烷類(taxanes)、DNA烷化劑(例如,CC-1065類似物)、蒽環類、微管溶素(tubulysin)類似物、倍癌霉素(duocarmycin)類似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、類美登素(maytansinoid)和Eg5抑制劑。14.實施方案1-13中任一項的免疫綴合物,其中所述抗體是單克隆抗體。15.實施方案1-13中任一項的免疫綴合物,其中所述抗體是嵌合抗體。16.實施方案1-13的免疫綴合物,其中所述抗體是人源化或全人抗體。17.實施方案14-16中任一項的免疫綴合物,其中所述抗體是雙特異性或多特異性抗體。18.實施方案1-17中任一項的免疫綴合物,其中所述抗體或抗體片段與腫瘤上的細胞表面標志物特異性結合。19.藥物組合物,包含實施方案1-18中任一項的免疫綴合物。20.實施方案1-19中任一項的修飾的抗體或抗體片段,還包含至少一個用于酶介導綴合的Pcl或非天然氨基酸置換或肽標簽和/或它們的組合。21.核酸,編碼實施方案1-4中任一項的修飾的抗體或抗體片段。22.宿主細胞,包含實施方案21的核酸。23.產生修飾的抗體或抗體片段的方法,包括在表達抗體或抗體片段的合適條件下溫育實施方案22的宿主細胞,并且分離所述抗體或抗體片段。24.產生免疫綴合物的方法,包括將接頭單元(LU)或接頭單元-有效載荷組合(-LU-X)接合至實施方案1-4中任一項的抗體或抗體片段中的半胱氨酸殘基。25.實施方案24的方法,其中免疫綴合物具有式(I):其中Ab代表抗體或抗體片段,所述抗體或抗體片段包含至少一個在本文所述的優選半胱氨酸置換位點之一處的半胱氨酸殘基;LU是如本文所述的接頭單元;X是有效載荷或藥物部分;并且n是從1至16的整數。26.修飾的抗體或其抗體片段,其中所述修飾的抗體或抗體片段包含在其恒定區上用半胱氨酸置換兩個或多個氨基酸的組合,其中組合包含選自抗體重鏈的位置360和抗體κ輕鏈的位置107的置換,其中所述位置根據EU系統編號。27.修飾的抗體或其抗體片段,其中所述修飾的抗體或抗體片段包含在其恒定區上用半胱氨酸置換兩個或多個氨基酸的組合,其中組合包含選自抗體重鏈的位置152和375的置換,其中所述位置根據EU系統編號。28.修飾的抗體或其抗體片段,包含SEQIDNO:48的重鏈恒定區和包含SEQIDNO:61的κ輕鏈恒定區。29.修飾的抗體或其抗體片段,包含SEQIDNO:131的重鏈恒定區。定義術語“氨基酸”指規范的、合成的和非天然的氨基酸,以及以類似于規范氨基酸的方式發揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。規范氨基酸是由遺傳密碼編碼的蛋白質氨基酸并且包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸和其類似物吡咯啉-羧基-賴氨酸。氨基酸類似物指具有與規范氨基酸相同的基本化學結構(即,與氫、羧基、氨基和R基團結合的α-碳)的化合物,例如,瓜氨酸、高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基硫這些類似物具有修飾的R基團(例如,正亮氨酸)或修飾的肽主鏈,但是保留與規范氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的一般化學結構不同的結構,但是以類似于規范氨基酸的方式發揮作用的化學化合物。如本文所用,術語“非天然氨基酸”意在代表不能在任何生物中使用來自(相同或不同的)任何生物的未修飾基因或修飾基因以生物合成方式生成的氨基酸結構。此外,這類“非天然氨基酸”一般需要修飾的tRNA和修飾的tRNA合成酶(RS)以并入蛋白質中。相對于規范氨基酸,這種tRNA/RS對偏好地并入非天然氨基酸。通過如Schultz等人(參見,例如,Liu等人,(2010)Annu.Rev.Biochem.79:413-444)開發的選擇方法或相似程序產生這類正交tRNA/RS對。術語“非天然氨基酸”不包括天然存在的第22個蛋白質性氨基酸吡咯賴氨酸(pyrrolysine)(Pyl)以及它的去甲基化類似物:吡咯啉-羧基-賴氨酸(pyrroline-carboxy-lysine)(Pcl),因為未修飾的天然存在的吡咯賴氨酰-tRNA/tRNA合成酶對介導這兩種殘基并入蛋白質中并且因為Pyl和Pcl以生物合成方式生成(參見,例如,Ou等人,(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:10437-10442;Cellitti等人,(2011)Nat.Chem.Biol.27;7(8):528-30)。還參見通過引用方式并入的美國臨時申請61/76236,其定位抗體輕鏈和重鏈中可以置換為Pcl的特定氨基酸殘基。如本文所用的術語“抗體”指免疫球蛋白家族的多肽,所述多肽能夠非共價、可逆并以特異性方式結合相應的抗原。例如,天然存在的IgG抗體是包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)(也稱作“抗體重鏈”)和兩條輕鏈(L)(也稱作“抗體輕鏈”)的四聚體。每條重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區。重鏈恒定區包含3個結構域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區。輕鏈恒定結構域包含一個結構域CL。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區,名為互補決定區(CDR),其間插有較保守的區域,名為構架區(FR)。每個VH和VL包含三個CDR和4個FR,從氨基端到羧基端以如下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如,效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q))結合。術語“抗體”包括但不限于單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝樣抗體、嵌合抗體和抗獨特型(抗Id)抗體(包括例如,針對本發明公開抗體的抗Id抗體)。抗體可以屬于任何同種型/類別(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亞類(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。輕鏈和重鏈均分成具有結構同源性和功能同源性的區域。術語“恒定”和“可變”以功能方式使用。在這個方面,將可以理解輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分的可變結構域決定抗原識別和特異性。相反地,輕鏈的恒定結構域(CL)和重鏈的恒定結構域(CH1、CH2或CH3)賦予重要的生物學特性如分泌、跨胎盤移動、Fc受體結合、補體結合作用等。按常規,恒定區結構域的編號隨著它們變得距抗體的抗原結合位點或氨基端更遠而增加。N端是可變區并且在C端是恒定區;CH3和CL結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基端。如本文所用的術語“抗體片段”指抗體的抗原結合片段或抗體的非抗原結合片段(例如,Fc)。如本文所用,術語“抗原結合片段”,指抗體的一個或多個部分,所述部分保留與抗原的表位特異性相互作用的能力(例如,通過結合、空間位阻、穩定化/去穩定化、空間分布)。結合片段的例子包括但不限于單鏈Fvs(scFv)、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段,一種由VL結構域、VH結構域、CL結構域和CH1結構域組成的單價片段;F(ab)2片段,一種包含由二硫鍵在鉸鏈區連接的兩個Fab片段的雙價片段;由VH結構域和CH1結構域組成的Fd片段;由抗體單臂的VL結構域和VH結構域組成的Fv片段;由VH結構域組成的dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989);和分離的互補決定區(CDR)、或抗體的其他表位結合片段。另外,雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立基因編碼,但是使用重組方法,可以將它們通過能夠使這兩個結構域作為單條蛋白鏈產生的合成性接頭連接,在所述單條蛋白鏈中VL區和VH區配對以形成單價分子(稱作單鏈Fv(“scFv”);參見例如Bird等人,Science242:423-426,1988;和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988。術語抗體的“抗原結合片段”也意在涵蓋這類單鏈抗體。使用本領域技術人員已知的常規技術,獲得這些抗原結合片段,并且按照與完整抗體相同的方式篩選所述片段的用途。也可以將抗原結合片段并入單結構域抗體、大抗體(maxibody)、微型抗體、納米體、胞內抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、v-NAR和雙-scFv(參見,例如,Hollinger和Hudson,2005,NatureBiotechnology,23:1126-1136,2005)。可以將抗原結合片段移植至基于多肽的支架如纖連蛋白III型(Fn3)中(參見美國專利號6,703,199,其描述纖連蛋白多肽單體抗體)。可以將抗原結合片段并入單鏈分子中,其中所述單鏈分子包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1),它們與互補性輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人,ProteinEng.8:1057-1062,1995;和美國專利號5,641,870)。如本文所用的術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指具有基本上同一的氨基酸序列或從相同遺傳源衍生的多肽,包括抗體和抗體片段。這個術語還包括具有單一分子組成的抗體分子的制備物。一種單克隆抗體組合物對特定表位顯示單一結合特異性和親和力。如本文所用,術語“人抗體”包括具有其中構架和CDR區均從人源序列衍生的可變區的抗體。另外,如果該抗體含有恒定區,則恒定區也衍生自這類人序列,例如,人種系序列、或者突變形式的人種系序列或含有從人構架序列分析導出的共有構架序列的抗體,例如,如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述。本申請的人抗體可包括不由人序列編碼的氨基酸殘基(例如,通過體外的隨機或定點誘變或通過體內的體細胞突變而引入的突變、或保守替換,以促進穩定性或生產)。如本文所用,術語“人源化抗體”指一種保留非人類抗體的反應性,同時在人類中免疫原性較低的抗體。這可以例如通過保留非人類CDR區并且抗體的剩余部分替換成它們的人類對應物來實現。參見,例如,Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984);MorrisonandOi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988);Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。如本文所用的術語“識別”指發現表位并與之相互作用(例如,結合)的抗體或其抗原結合片段,無論該表位是否為線性或構象的。術語“表位”指抗原上與本公開的抗體或抗原結合片段特異性結合的位點。表位可以從連續氨基酸或因蛋白質的立體折疊而靠近的非連續氨基酸中形成。從連續氨基酸形成的表位一般在暴露于變性溶劑時保留,而因立體折疊形成的表位通一般用變性溶劑處理時喪失。表位一般包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,14或15個處于獨特空間構象的氨基酸。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術,例如,X射線結晶學和2-二維核磁共振(參見,例如EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷,G.E.Morris編著(1996))。本文所用的術語“親和力”(affinity)指,抗體與抗原在單個抗原部位上相互作用的強度。在每個抗原位點內部、抗體“臂”的可變區通過弱非共價力在許多位點處與抗原相互作用;相互作用越多,親和力越強。術語“分離的抗體”指一種抗體,其基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體。然而,與一種抗原特異性結合的分離抗體可以對其他抗原具有交叉反應性。另外,分離的抗體可以基本上不含其他細胞物質和/或化學品。術語“保守性修飾的變體”適用于氨基酸序列和核酸序列。就特定的核酸序列而言,保守性修飾的變體指編碼相同或基本上同一的氨基酸序列的那些核酸,或在核酸不編碼氨基酸序列的情況下,指基本上同一的序列。因為遺傳密碼的簡并性,大量功能上相同的核酸編碼任何給出的蛋白質。例如,密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因而,在丙氨酸由某個密碼子指定的每個位置,可以將該密碼子變成任一個所述的相應密碼子,而不改變編碼的多肽。這類核酸變異是“沉默性變異”,它們是一個種類的保守性修飾變異。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了該核酸的每種可能沉默變異。技術人員會認識到,可以修飾核酸中的每個密碼子(例外是AUG,它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子,和TGG,它通常是色氨酸的唯一密碼子)以產生功能上相同的分子。因此,編碼多肽的核酸的每種沉默性變異內含于每個描述的序列中。對于多肽序列,“保守性修飾的變體”包括對多肽序列的各個置換、缺失或添加,它們導致某個氨基酸置換為化學上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置換表是本領域熟知的。這類保守性修飾的變體相對于本公開的多態性變體、物種間同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它們。以下8組含有互為保守替換的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參閱例如,Creighton,Proteins(1984))。在一些實施方案中,術語“保守序列修飾”用于指不顯著影響或改變含有氨基酸序列的抗體的結合特征的氨基酸修飾。如本文所用的術語“優化的”指已經改變核苷酸序列以使用在生產性細胞或生物(通常是真核細胞,例如酵母細胞、畢赤酵母屬(Pichia)細胞、真菌細胞、木霉屬(Trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人細胞)中為優選的密碼子編碼氨基酸序列。優化的核苷酸序列經工程化以完全或盡可能保留由起始核苷酸序列最初編碼的起始氨基酸序列,也稱作“親本”序列。在兩個或更多個核酸序列或多肽序列的情境下,術語“百分數同一的”或“同一性百分數”指相同的兩個或更多個序列或子序列。如果在比較窗口或指定區域范圍內為最大對應性而進行比較和比對時,如使用以下序列比較算法之一或通過手工比對和目視檢查所測量,兩個序列具有指定百分數的相同氨基酸殘基或核苷酸(即,在指定區域范圍內或當未指定時在整個序列范圍內60%同一性,任選地65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性),則這兩個序列是“基本上同一的”。任選地,同一性存在于具有至少約30個核苷酸(或10個氨基酸)長度的區域內,或更多優選地存在于具有100個至500個或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個氨基酸)長度的區域內。對于序列比較,一般地一個序列充當檢驗序列與之比較的參考序列。當使用序列比較算法時,將檢驗序列和參考序列輸入計算機,如果需要,指定子序列坐標,并指定序列算法程序參數。可以使用默認程序參數或可以指定備選參數。基于程序參數,序列比較算法隨后相對于參考序列計算檢驗序列的序列同一性百分數。如本文所用,“比較窗口”包括針對具有任一連續位置數的節段的參考,所述的連續位置數選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150,其中一個序列可以與具有相同連續位置數的參考序列在最佳比對這兩個序列后進行比較。用于比對序列以比較的方法是本領域熟知的。用于比較的最佳序列比對可以按如下方式進行,例如通過Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c(1970)的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法、通過Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法、通過這些算法的計算機化執行(WisconsinGenetics軟件包,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通過手工比對和目視審查(見,例如,Brent等人,(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology,2003)。適用于確定序列同一性百分數和序列相似性百分數的兩個算法例子是BLAST算法和BLAST2.0算法,它們分別在Altschul等人,Nuc.AcidsRes.25:3389-3402,1977;和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述。用于進行BLAST分析的軟件是通過國家生物技術信息中心可公開獲得的。這種算法涉及首先通過確定查詢序列中長度為W的短字,鑒定高評分序列對(HSP),其中與數據庫序列中具有相同長度的字比對時,所述短字匹配或滿足某些正值閾評分T。將T稱作相鄰字評分閾值(Altschul等人,上文)。這些初始相鄰字命中充當種子,所述種子用于啟動檢索以找到含有這些種子的更長HSP。所述字命中在兩個方向沿每個序列盡可能遠地延伸,只要可以提高累積比對評分。對于核苷酸序列,使用參數M(一對匹配殘基的報酬評分;總是>0)和N(錯配殘基的懲罰評分;總是<0)計算累積評分。對于氨基酸序列,使用評分矩陣計算累積評分。字命中在每個方向上的延伸在以下情況時停止:累積比對評分從其最大實現值跌落達量X;累積評分因積累一個或更多負評分殘基比對結果而達到或低于零;或抵達兩個序列中任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字長度(W)11、期望(E)10、M=5、N=-4和兩條鏈比較作為默認。對于氨基酸序列,BLASTP程序使用字長度3和期望(E)10,以及BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915)、比對結果(B)50、M=5、N=-4和兩條鏈的比較作為默認。BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統計分析(見,例如,Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小總和概率(P(N)),其提供兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間的匹配會因偶然發生的概率指示。例如,如果最小總和概率在測試核酸與參考核酸的比較中小于約0.2、更優選小于約0.01并且最優選小于約0.001,則將認為核酸相似于參考核酸。還可以使用PAM120權重余數表、空位長度罰分12,空位罰分4),利用已經并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,1988)確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分數。此外,可以使用已經集成至GCG軟件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法(在www.gcg.com可獲得),使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6,確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分數。除上文所示的序列同一性的百分數之外,兩個核酸序列或多肽基本上同一的另一個指標是由第一核酸編碼的多肽與針對第二核酸編碼的多肽所產生的抗體發生免疫雜交反應,如下文描述。因此,在兩種肽僅因保守性置換而不同的情況下,一個多肽一般與第二多肽基本上同一。兩個核酸序列基本上同一的另一個指標是這兩個分子或它們的互補物在嚴格條件下彼此雜交,如下文描述。兩個核酸序列基本上同一的又一個指標是相同的引物可以用來擴增該序列。術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用并且指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈形式或雙鏈形式的聚合物。本術語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或已修飾的主鏈殘基或鍵的核酸,所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的,具有與參考核酸相似的結合特性,并且以類似參考核苷酸的方式代謝。這類類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另外說明,特定核酸序列也內在包括其沉默變體(例如簡并密碼子置換)和互補序列,以及明確指出的序列。具體而言,如下文詳述,可以通過產生其中一個或多個選擇的(或全部)密碼子的第三位置用混合型堿基和/或脫氧肌苷殘基置換的序列,實現簡并密碼子置換(Batzer等人,(1991)NucleicAcidRes.19:5081;Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608;和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。術語“有效連接”在核酸的語境下指兩個或更多個多核苷酸(例如,DNA)區段之間的功能性關系。一般,它指轉錄調節序列與已轉錄序列的功能性關系。例如,如果啟動子或增強子序列在適宜的宿主細胞或其他表達系統中刺激或調節編碼序列的轉錄,則該啟動子或增強子序列與編碼序列有效連接。通常,與已轉錄的序列有效連接的啟動子轉錄調節序列物理地與已轉錄的序列連續,即,它們是順式作用的。然而,一些轉錄調節序列(如增強子)不需要物理上與它們增強的編碼序列連續或與之緊鄰。術語“多肽轉錄”和“蛋白質”在此互換地使用來指氨基酸殘基的聚合物。本術語適用于規范氨基酸聚合物以及非規范氨基酸聚合物。除非另有指出,特定的多肽序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變體。如本文所用的術語“免疫綴合物”或“抗體綴合物”指抗體或其抗體片段與另一種藥物如化療藥、毒素、免疫治療劑、成像探針、光譜探針等連接。連接可以借助一個或多個共價鍵,或非共價相互作用,并且可以包括螯合作用。可以使用多種接頭(多數是本領域已知的)以形成免疫綴合物。額外地,可以將免疫綴合物以可以是從編碼免疫綴合物的多核苷酸表達的融合蛋白的形式提供。如本文所用,“融合蛋白”指通過連接最初編碼分離的蛋白質(包括肽和多肽)的兩個或更多個基因或基因片段產生的蛋白質。可以通過在N末端或C末端連接或通過將基因或基因片段插入配偶體蛋白之一的容許區域中,產生融合蛋白。融合基因的翻譯產生具有從每種原始蛋白質衍生的功能特性的單一蛋白。術語“受試者”包括人類和非人類動物。術語“非人其動物”包括全部脊椎動物,例如,哺乳動物和非哺乳動物,如非人的靈長類、綿羊、犬、奶牛、雞、兩棲類和爬行類。除非另外指出,否則術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所用,術語“細胞毒素”或“細胞毒藥物”指對細胞的生長和增殖有害并可以發揮作用以減少、抑制或摧毀細胞或惡性腫瘤的任何物質。如本文所用,術語“抗癌藥”指可以用來治療細胞增殖性疾病如癌癥的任何藥劑,包括但不限于細胞毒藥物、化療藥、放療法和放療藥、靶向抗癌藥和免疫治療劑。術語“藥物部分”或“有效載荷”互換使用并且指與本公開的抗體或抗體片段綴合的化學部分,并且可以包括可用于結合至抗體或抗體片段的任何部分。例如,藥物部分或有效載荷可以是抗癌藥、抗炎藥、抗真菌劑、抗細菌藥、抗寄生蟲藥、抗病毒藥、麻醉藥。在某些實施方案中,藥物部分選自V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTOR抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、澳瑞司他汀、海兔毒素(dolastatin)、類美登素、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白質CRM1核輸出的抑制劑、DPPIV抑制劑、線粒體中磷酰基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、蛋白酶體抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、Eg5抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合物和DHFR抑制劑。合適的例子包括澳瑞司他汀如MMAE和MMAF;刺孢霉素如γ-刺孢霉素;和類美登素(maytansinoid)如DM1和DM4。用于將這些藥物中每種藥物接合至與本公開抗體和方法相容的接頭的方法是本領域已知的。參見,例如,Singh等人,(2009)TherapeuticAntibodies:MethodsandProtocols,第525卷,445-457。此外,有效載荷可以是生物物理探針、熒光團、自旋標記物、紅外探針、親和力探針、螯合劑、光譜探針、放射性探針、脂質分子、聚乙二醇、聚合物、自旋標記物,DNA、RNA、蛋白質、肽、表面、抗體、抗體片段、納米粒子、量子點、脂質體、PLGA粒子、糖或多糖、反應性官能團,或可以將綴合物與另一個部分、表面等連接的結合劑。術語“藥物/抗體比”(也稱作“DAR”)指免疫綴合物中與抗體連接的有效載荷或藥物部分的數目。例如藥物/抗體比2意指在免疫綴合物的樣品中平均兩個藥物部分與一個抗體結合。在藥物/抗體比為2的樣品中個別免疫綴合物將會可能沒有藥物部分連接或僅具有一個藥物部分連接;這份樣品中的其他免疫綴合物將在單個抗體上具有兩個、三個、四個或甚至更多個部分。但是樣品中的平均數將是兩。存在本領域已知的測量免疫綴合物的藥物/抗體比的不同方法。在本申請的一個實施方案中,免疫綴合物的樣品中的DAR可以是“均一”的。“均一的綴合樣品”是具有DAR窄分布的樣品。作為說明性實施方案,在DAR為2的均一綴合樣品中,在這份樣品內部可以含有未綴合的抗體,并且一些抗體具有按DAR約2綴合的超過兩個部分。“大部分樣本”意指樣品中至少超過70%、或至少超過80%或至少超過90%的抗體將會與兩個部分綴合。作為說明性實施方案,在DAR為4的均一綴合樣品中,在這份樣品內部可以含有這樣的抗體,所述抗體具有按DAR約4綴合的超過4個部分或少于4個部分。“大部分樣本”意指樣品中至少超過70%、或至少超過80%或至少超過90%的抗體將會與四個部分綴合。作為說明性實施方案,在DAR為6的均一綴合樣品中,在這份樣品內部可以含有這樣的抗體,所述抗體具有按DAR約6綴合的超過6個部分或少于6個部分。“大部分樣本”意指樣品中至少超過70%、或至少超過80%或至少超過90%的抗體將會與六個部分綴合。作為說明性實施方案,在DAR為8的均一綴合樣品中,在這份樣品內部可以含有這樣的抗體,所述抗體具有按DAR約8綴合的超過8個部分或少于8個部分。“大部分樣本”意指樣品中至少超過70%、或至少超過80%或至少超過90%的抗體將會與8個部分綴合。具有“藥物/抗體比約2”的免疫綴合物指其中藥物/抗體比可以是約1.6-2.4個部分/抗體、1.8-2.3個部分/抗體或1.9-2.1個部分/抗體的免疫綴合物樣品。具有“藥物/抗體比約4”的免疫綴合物指其中藥物/抗體比可以是約3.4-4.4個部分/抗體、3.8-4.3個部分/抗體或3.9-4.1個部分/抗體的免疫綴合物樣品。具有“藥物/抗體比約6”的免疫綴合物指其中藥物/抗體比可以是約5.1-6.4個部分/抗體、5.8-6.3個部分/抗體或5.9-6.1個部分/抗體的免疫綴合物樣品。具有“藥物/抗體比約8”的免疫綴合物指其中藥物/抗體比可以是約7.6-8.4個部分/抗體、7.8-8.3個部分/抗體或7.9-8.1個部分/抗體的免疫綴合物樣品。“腫瘤”指無論是惡性還是良性的贅生性細胞生長和增殖,及所有癌變前和癌變的細胞和組織。“抗腫瘤活性”意指腫瘤細胞的增殖速率、存活力或轉移活性的降低。顯示抗腫瘤活性的一種可能方式是顯示治療期間出現的異常細胞的生長速率下降或者腫瘤尺寸穩定或縮減。這種活性可使用被接受的體外或體內腫瘤模型評估,包括但不限于異種移植模型、同種異體移植模型、MMTV模型和本領域公知的用于研究抗腫瘤活性的其他已知模型。術語“惡性腫瘤”指非良性腫瘤或癌癥。如本文所用,術語“癌癥”包括以失調節或失控的細胞生長為特征的惡性腫瘤。示例性癌癥包括癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。術語“癌癥”包括原發性惡性腫瘤(例如,其細胞沒移行至受試者身體中除原始腫瘤部位之外的部位的那些)和繼發性惡性腫瘤(例如,因轉移、腫瘤細胞移行至與原始腫瘤部位不同的繼發部位而產生的那些)。如本文所用,術語“光學異構體”或“立體異構體”指對本申請的給定化合物而言可以存在多種立體異構構型的任一者并且包括幾何異構體。可以理解,取代基可以在碳原子的手性中心接合。術語“手性”指具有在其鏡像配偶體上不可疊加特性的分子,而術語“非手性”指可疊加在其鏡像配偶體上的分子。因此,本公開包括化合物的對映異構體、非對映異構體或消旋物。“對映異構體”是彼此為不可疊加鏡像的一對立體異構體。對映異構體的1:1混合物是“消旋”混合物。根據需要,該術語用來指外消旋混合物。“非對映異構體”是具有至少兩個非對稱原子,但彼此不是鏡像的立體異構體。絕對立體化學根據Cahn-lngold-PrelogR-S體系規定。當化合物是純對映異構體時,每個手性碳處的立體化學可以由R或S指定。其絕對構型未知的拆分化合物可以根據它們在鈉D線波長處轉動平面偏振光的方向(右旋或左旋),命名為(+)或(-)。本文所述的某些化合物含有一個或多個非對稱中心或軸并且因此可以產生可以根據絕對立體化學定義為(R)-或(S)-的對映異構體、非對映異構體及其他立體異構形式。取決于原料和程序的選擇,化合物可以按可能異構體之一的形式存在或作為其混合物存在,例如作為純的光學異構體,或作為異構體混合物,如消旋物和非對映異構體混合物,這取決于非對稱碳原子的數目。本申請意在包括全部這類可能的異構體,包括外消旋混合物、非對映異構混合物和光學純形式。光學活性的(R)-異構體和(S)-異構體可以使用手性合成子或手性試劑制備或可以使用常規技術拆分。如果化合物含有雙鍵,則取代基可以是E構型或Z構型。如果化合物含有雙取代的環烷基,則環烷基取代基可以具有順-構型或反-構型。還意在包括全部互變異構形式。如本文所用,術語“一種鹽”或“多種鹽”指本申請化合物的酸加成鹽或堿加成鹽。“鹽”包括尤其“可藥用鹽”。術語“可藥用鹽”指保留本申請化合物的生物學作用和特性并且一般不是生物學不利或不良的鹽。在許多情況下,本申請的化合物能夠因存在氨基和/或羧基或與之類似的基團而形成酸鹽和/或堿鹽。可以與無機酸和有機酸形成可藥用的酸加成鹽,例如,乙酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、重碳酸鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶堿鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽(ethandisulfonate)、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘甲酸鹽、萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽(octadecanoate)、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽和三氟乙酸鹽。可以從其衍生鹽的無機酸例如包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以從其衍生鹽的有機酸例如包括乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸等。可以與無機堿和有機堿形成可藥用的堿加成鹽。可以從其衍生鹽的無機堿例如包括銨鹽和來自周期表I族至XII族的金屬。在某些實施方案中,鹽衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅和銅;特別合適的鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽。可以從其衍生鹽的有機堿例如包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、環狀胺、堿性離子交換樹脂等。某些有機胺包括異丙胺、苯乍生(benzathine)、膽酸鹽、二乙醇胺、二乙胺、賴氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇(tromethamine)。可以通過常規化學方法從堿性部分或酸性部分合成本申請的可藥用鹽。通常,這類鹽可以通過這些化合物的游離酸形式與化學計量數量的適宜堿(如氫氧化鈉、鈣、鎂或鉀、碳酸鈉、鈣、鎂或鉀、重碳酸鈉、鈣、鎂或鉀等)反應,或通過這些化合物的游離堿形式與化學計量數量的適宜酸反應來制備。這類反應一般在水中或在有機溶劑中或在二者的混合物中實施。通常,在可行的情況下,使用非水介質如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是合乎需要的。額外的合適鹽的名單可以例如存在于以下文獻中:“Remington'sPharmaceuticalSciences”,第20版,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,(1985);和Stahl與Wermuth的“HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse”(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002。本文中給出的任何式還意在代表化合物的未標記形式以及同位素標記形式。同位素標記的化合物具有由本文中給出的式描述的結構,除了一個或多個原子由具有選定原子質量或質量數的原子替換之外。可以摻入本申請化合物的同位素的例子分別包括氫、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素,如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本公開包括同位素標記的多種如本文定義的化合物,例如其中存在放射性同位素(如3H和14C)的那些或其中存在非放射性同位素(如2H和13C)的那些。同位素標記的這類化合物可用于代謝研究(采用14C)、反應動力學研究(采用例如2H或3H)、檢測或成像技術,如正電子發射斷層攝影術(PET)或單光子發射計算機斷層成像(SPECT),包括藥物或底物組織分布測定法,或用于患者的放射性治療中。尤其對于PET或SPECT研究,18F或標記的化合物可以是特別地合乎需要的。通常可以通過本領域技術人員已知的常規技術或通過與后附實施例和制備法中所述的那些方法類似的方法,使用適宜的同位素標記試劑而非先前所用的非標記試劑,制備同位素標記的式(I)化合物。另外,用更重的同位素(尤其氘(即,2H或D))取代可以因代謝穩定性更大而提供某些治療優勢,例如體內半壽期增加或劑量需求減少或治療指數改善。可以理解在這種情況下,氘視作式(I)化合物的取代基。這種更重同位素(尤其氘)的濃度可以由同位素富集系數限定。如本文所用的術語“同位素富集系數”意指指定同位素的同位素豐度和天然豐度之間的比率。如果本申請化合物中的取代基指定為氘,則這類化合物對于每個指定的氘原子具有至少3500(在每個指定的氘原子處52.5%氘摻入)、至少4000(60%氘摻入)、至少4500(67.5%氘摻入)、至少5000(75%氘摻入)、至少5500(82.5%氘摻入)、至少6000(90%氘摻入)、至少6333.3(95%氘摻入)、至少6466.7(97%氘摻入)、至少6600(99%氘摻入)或至少6633.3(99.5%氘摻入)的同位素富集系數。如本文所用,術語“可藥用載體”包括任何和全部溶劑、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如,抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物穩定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料等及其組合,這為本領域普通技術人員已知(參見,例如,Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990,第1289-1329頁)。除了任何常規載體與有效成分不相容的情況之外,構思了所述載體在治療組合物或藥物組合物中的用途。術語本申請化合物的“治療有效量”指本申請化合物的量,所述量將激發患者的生物學反應或醫學反應,例如減少或抑制酶或蛋白質活性、或改善癥狀、減輕病狀、減慢或延遲病情進展或預防疾病等。在一個非限制性實施方案中,術語“治療有效量”指本申請化合物的量,當施用至受試者時,所述量有效地至少部分減輕、抑制、預防和/或改善病狀、或病癥或疾病,或至少部分抑制所靶向的酶或受體的活性。如本文所用,術語“抑制了”、“抑制”或“抑制著”指減少或抑制給定的病狀、癥狀、或病癥、或疾病,或顯著減少生物學活動或過程的基線活性。如本文所用,術語對任何疾病或病癥的“治療了”、“治療著”或“治療”在一個實施方案中指改善該疾病或病癥(即,延緩或停滯或減少疾病或其至少一個臨床癥狀的形成)。在另一個實施方案中,“治療了”、“治療著”或“治療”指緩和或緩解至少一個身體參數,包括患者可能不可察覺的那些身體參數。在又一個實施方案中,“治療了”、“治療著”或“治療”指在身體上(例如,穩定可察覺癥狀)、生理上(例如,穩定身體參數)或這兩方面或生理上調節疾病或病癥。在又一個實施方案中,“治療了”、“治療著”或“治療”指防止或延遲疾病或病癥的發作或形成或進展。如本文所用,如果受試者將在生物學上、醫學上或在生活質量方面從這類治療獲益,則這名受試者“需要”治療。如本文所用,在本申請的上下文(尤其在權利要求的上下文中)所用的術語“一個”、“一種”和“該”應解釋為涵蓋單數和復數,除非本文另外說明或與上下文明顯矛盾。如本文所用的術語“巰基-馬來酰亞胺”描述由巰基與馬來酰亞胺反應形成的基團,其具有這個通式其中Y和Z是借助巰基-馬來酰亞胺鍵連接的基團并且可以是接頭單位,并且可以與抗體或有效載荷接合。在一些情況下,Y是本申請的工程化抗體,并且該式中所示的硫原子來自本文所述的取代位點之一處的半胱氨酸;而Z代表與有效載荷連接的接頭單元。如本文所用的“接頭單元”(LU)指在兩個部分如抗體和有效載荷之間的共價化學連接。每個LU可以包含本文所述的一種或多種組分如L1、L2、L3、L4、L5和L6。可以選擇接頭單元以提供所連接的各部分之間的合適間距,或以提供某些物理化學特性,或以允許在某些條件下切割接頭單元。如本文所用的“可切割”指通過共價連接連接兩個部分,但在生理條件下分解以服務于所述部分之間共價連接的接頭或接頭單元(LU)。切割可以是酶促或非酶促的,但是通常在不降解抗體的情況下從抗體釋放有效載荷。如本文所用的“不可切割”指生理條件下不易分解的接頭或接頭單元(LU)。盡管可以在生理學上修飾接頭,但是它維持有效載荷與抗體連接直至抗體基本上降解,即在體內,抗體降解先于接頭的切割。如本文所用的“環辛炔”指含有碳-碳叁鍵(炔)的8元環。該環任選地與一個或兩個苯環稠合,所述苯環可以用以下基團取代:1-4個C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵素、羥基、COOH、COOL1、-C(O)NH-L1、O-L1或相似基團、并且可以含有N、O或S作為環成員。在優選的實施方案中,環辛炔可以是C8烴環,尤其除叁鍵之外飽和并且可以用F或羥基取代的孤立環,以及可以通過–O-、–C(O)、C(O)NH或C(O)O連接至接頭或LU。如本文所用的“環辛烯”指含有至少一個雙鍵、尤其反式雙鍵的8元環。該環任選地與一個或兩個苯環稠合,所述苯環可以用以下基團取代:1-4個C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵素、羥基、COOH、COOL1、-C(O)NH-L1、O-L1或相似基團、并且可以含有N、O或S作為環成員。在優選的實施方案中,環辛烯可以是除反式雙鍵之外飽和并且任選地用F或羥基取代的孤立C8烴環,以及可以通過–O-、–C(O)、C(O)NH或C(O)O連接至接頭或LU。除非本文另外說明或除非與語境明顯矛盾,否則本文所述的全部方法可以按任何合適的順序進行。除非另外聲明,否則本文中提供的任何和全部實施例或示例性表述(例如,“如”)的用途僅意圖在于更好地說明本申請而不顯示本申請的范圍。附圖說明圖1描述曲妥珠單抗(SEQIDNO:155)、人IgG1(SEQIDNO:151)、IgG2(SEQIDNO:152)、IgG3(SEQIDNO:153)和IgG4(SEQIDNO:154)的恒定區的氨基酸序列比對。圖2是描述抗體藥物綴合物在表達cKIT的細胞上的細胞殺傷活性的圖,所述抗體藥物綴合物包含在其恒定區中具有兩個cys突變的cKIT抗體。抗體與抑制Eg5的接頭-有效載荷復合物綴合。方形數據點針對表5中包含化合物A的免疫綴合物;三角形數據點針對表5中包含化合物B的免疫綴合物;方形數據點針對表5中包含化合物C的免疫綴合物。圖3描述這樣的圖,所述圖說明在H526腫瘤小鼠異種移植模型中包含半胱氨酸工程化的cKIT抗體的免疫綴合物按5mg/kg(圖3A)和10mg/kg(圖3B)劑量施用時的活性和按劑量5.9mg/kg(圖3A)和11.8mg/kg(圖3B)施用的包含野生型cKIT抗體的免疫綴合物的活性。圖4是描述與Eg5抑制劑綴合的抗Her2免疫綴合物在小鼠Her2陽性MDA-MB-231克隆16乳腺癌異種移植模型中的體內效力的圖。圖5是描述與Eg5抑制劑綴合的抗Her2免疫綴合物在小鼠Her2陽性MDA-MB-453乳腺癌異種移植模型中的體內效力的圖。圖6是描述與Eg5抑制劑綴合的抗Her2免疫綴合物在小鼠Her2陽性HCC1954乳腺癌異種移植模型中的體內效力的圖。圖7是描述來自與化合物F綴合的抗cKITADC在小鼠的H526腫瘤異種移植模型中體內效力研究的結果的圖。化合物F與半胱氨酸工程化cKIT抗體或野生型cKIT抗體綴合。包括抗Her2免疫綴合物作為無結合作用的對照。圖8是描述來自抗體抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F(圖8A)和抗體抗cKIT-化合物F(圖8B)ADC按劑量1mg/kg在未用過藥的小鼠中藥代動力學研究的結果的圖。圖9是描述兩種不同化合物綴合至兩種不同半胱氨酸工程化抗體的抗cKIT免疫綴合物在小鼠的H526腫瘤異種移植模型中體內效力的圖。發明詳述本申請提供位點特異性標記抗體或抗體片段的方法,所述方法通過將特定位置處親本抗體或抗體片段的一個或多個氨基酸替換為半胱氨酸氨基酸(“Cys”),從而工程化抗體或抗體片段能夠綴合至多種藥劑(例如,細胞毒性劑)。本申請還提供通過使用本文所述的方法產生的免疫綴合物。當半胱氨酸工程化到親本抗體或抗體片段中時,首先從表達培養基回收修飾的抗體或抗體片段,其具有半胱氨酸或谷胱甘肽(GSH)借助二硫鍵在工程化的半胱氨酸位點接合(Chen等人,(2009)mAbs16,353-571)。接合的半胱氨酸或GSH隨后在還原步驟移除,所述還原步驟也還原親本抗體或抗體片段的全部天然鏈間二硫鍵。在第二步驟中,這些二硫鍵在綴合發生前再氧化。本公開顯示,當半胱氨酸在某些位點工程化時,再氧化步驟進展不良,這推定地歸因于不正確的二硫鍵形成。因此,本申請分別在抗體重鏈恒定區和抗體輕鏈恒定區上提供獨特的位點集合,其中如本文所述的Cys置換產生修飾的抗體或抗體片段,所述修飾的抗體或抗體片段在再氧化過程中進展良好并且還產生穩定的和行為良好的免疫綴合物。本申請的位點特異性抗體標記可以用多種化學可及的標記試劑如抗癌藥、熒光團、肽、糖、去垢劑、聚乙二醇、免疫增效劑、放射成像探針、前藥和其他分子實現。因此,本申請提供制備用于癌療法和其他適應癥以及成像試劑的具有確定藥物/抗體比的均一免疫綴合物的方法。本申請還提供藉此制備的免疫綴合物,以及包含這些免疫綴合物的藥物組合物。本申請的方法可以與本領域已知的其他綴合方法組合使用。以下列舉的實施方案代表本申請的某些方面和變型:其中Ab代表抗體或抗體片段,所述抗體或抗體片段包含至少一個在本文所述的優選半胱氨酸置換位點之一處的半胱氨酸殘基;LU是如本文所述的接頭單元;X是有效載荷或藥物部分;并且n是從1至16的整數。在這些實施方案中,n優選地是約2、約4、約6或約8。LU一般是式–L1-L2-L3-L4-L5-L6-的基團,其中L1、L2、L3、L4、L5和L6獨立選自-A1-、-A1X2-和-X2-;其中:A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在這些實施方案的一些實施方案中,免疫綴合物包含下式的基團或者其中硫原子是修飾的抗體或抗體片段中半胱氨酸殘基的硫并且位于本文中確定的置換位點之一處。在任一前述實施方案中,半胱氨酸置換位點可以是與通過位置編號確定的位點之一對應的位置,盡管序列中位點的位置已經因修飾或截短全長抗體而改變。可以通過抗體或片段與全長抗體比對,輕易地確定相應位點。1.位點特異性半胱氨酸工程化抗體位點特異性標記本申請的抗體(例如,親本抗體,任選地含有一個或多個非規范氨基酸)根據如Edelman等人,(1969)Proc.Natl.Acad.USA63:78-85中所述的EU編號體系編號,但除了λ輕鏈根據如Kabat等人,(1991)第5版,NIH出版編號91-3242中所述的Kabat編號體系編號外。本申請通篇范圍內使用人IgG1恒定區作為代表。然而,本申請不限于人IgG1;可以通過序列比對輕易地導出相應氨基酸位置。例如,圖1顯示以下重鏈恒定區的序列比對結果:抗體曲妥珠單抗野生型重鏈恒定區(其序列是STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO:155))、人IgG1重鏈恒定區(其序列是STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO:151))、IgG2重鏈恒定區(其序列是STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO:152))、IgG3重鏈恒定區(其序列是STKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG(SEQIDNO:152))、和IgG4重鏈恒定區(其序列是STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQIDNO:153)),從而IgG1恒定區中確定的Cys工程化位點可以輕易地對IgG2、IgG3和IgG4進行確定,如圖1中所示。對于輕鏈恒定區,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4是相同的(人抗體曲妥珠單抗的全長野生型輕鏈序列是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:90))。下表1列出了抗體重鏈恒定區中可以被半胱氨酸替換的氨基酸位置。表2A列出了抗體κ輕鏈恒定區中可以被半胱氨酸替換的氨基酸位置。表2B列出了抗體λ輕鏈恒定區中可以被半胱氨酸替換的氨基酸位置。表1.在人IgG1的重鏈恒定區中確定的半胱氨酸置換位點(位點根據EU編號體系編號)。表2A.在人IgG1的κ輕鏈恒定區中確定的半胱氨酸置換位點(位點根據EU編號體系編號)。表2B.在人IgG1的λ輕鏈上確定的半胱氨酸置換位點因為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗體的恒定區的序列同源性高,本申請的發現不限于任何具體抗體或抗體片段。在一個實施方案中,本申請提供包含修飾的抗體或其抗體片段及藥物部分的免疫綴合物,其中所述修飾的抗體或其抗體片段包含在其重鏈恒定區上一個或多個(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸的置換。在本申請的一個實施方案中,本文所述的氨基酸置換是包含巰基的半胱氨酸。在本申請的一些方面,巰基用于化學綴合并且與接頭單元(LU)和/或藥物部分接合。在一些實施方案中,本申請的免疫綴合物包含藥物部分,所述藥物部分選自V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTOR抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、澳瑞司他汀、海兔毒素、類美登素、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白質CRM1核輸出的抑制劑、DPPIV抑制劑、蛋白酶體抑制劑、線粒體中磷酰基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、Eg5抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合物和DHFR抑制劑。在一些實施方案中,本申請的免疫綴合物包含作為抗癌藥的藥物部分。本申請的修飾的抗體或抗體片段可以是本領域已知的任何樣式,如單克隆、嵌合、人源化、全人、雙特異性或多特異性抗體或其抗體片段。根據本申請,修飾的抗體重鏈和/或輕鏈(或其抗體片段)可以在其恒定區中含有1、2、3、4、5、6、7、8或更多個半胱氨酸置換。在一個實施方案中,修飾的抗體或抗體片段在其恒定區中含有2、4、6、8個或更多個半胱氨酸置換。在一些實施方案中,修飾的抗體、其抗體片段或免疫綴合物包含4個或更多個Cys置換。在一個實施方案中,親本抗體(無半胱氨酸置換的抗體)是IgG、IgM、IgE或IgA抗體。在一個具體實施方案中,親本抗體是IgG1抗體。在另一個具體實施方案中,親本抗體是IgG2、IgG3、或IgG4抗體。本申請還提供了在其選自表1中確定的位置中的重鏈恒定區上包含一個或多個氨基酸置換的修飾抗體或其抗體片段。在一些實施方案中,本申請提供了在其選自表2A或表2B中確定的位置中的輕鏈恒定區上包含一個或多個氨基酸置換的修飾抗體或其抗體片段。在其他實施方案中,修飾抗體或其抗體片段在其選自表1中確定的位置中的重鏈恒定區上包含一個或多個氨基酸,并在其選自表2A中確定的位置中的輕鏈恒定區上包含一個或多個氨基酸。在某些實施方案中,使用與本領域已知的其他綴合方法組合的本申請方法,標記本文中提供的修飾的抗體或抗體片段,所述其他綴合方法包括但不限于通過賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、甲酰基-甘氨酸、吡咯賴氨酸、吡咯啉-羧基-賴氨酸、非天然氨基酸和用于酶介導綴合的蛋白質標簽(例如,S6標簽)的化學選擇性綴合。2.綴合化學本文提供的綴合抗體或其抗體片段通過翻譯后修飾至少一個半胱氨酸殘基產生,其中所述半胱氨酸殘基通過位點特異性標記方法并入如上文所述的抗體或其抗體片段中。可以通過本領域已知用于目的有效載荷與蛋白質中天然存在的半胱氨酸殘基綴合的方法和通過描述用于綴合至下述蛋白質的方法,制備綴合的抗體或抗體片段,所述蛋白質經工程化以含有用額外的半胱氨酸殘基置換天然蛋白質序列的另一個氨基酸。在某些實施方案中,使用如以下方案Ia所示的其中并入的半胱氨酸(cys)與馬來酰亞胺衍生物綴合的已知方法,綴合本文中提供的修飾的抗體或其抗體片段。經歷這種類型綴合的本申請的修飾抗體含有巰基-馬來酰亞胺鍵。方案Ia.通過形成巰基-馬來酰亞胺加合物的綴合。其中:LU是接頭單元(LU),并且X是有效載荷或藥物部分。在其他實施方案中,通過與α-鹵素羰基化合物如氯乙酰胺、溴乙酰胺或碘乙酰胺反應,綴合在修飾的抗體或抗體片段中并入的Cys,如下文方案Ib中所示。可以理解,鹵素之外的其他離去基團如甲苯磺酸鹽、三氟甲烷磺鹽和其他烷基或芳基磺酸鹽,可以用作離去基團Y。盡管方案Ib描述了Cys巰基與α-鹵素乙酰胺的反應,但是該方法包括用式Y-CHR-C(=O)-的基團對所并入的Cys的硫的任何烷基化,其中R是H或C1-4烷基,Y是離去基團(一般Cl、Br或I、并且任選地是烷基磺酸鹽或芳基磺酸鹽);它不限于酰胺。方案Ib.通過與α-鹵素羰基化合物反應而綴合。Y是離去基團(Cl、Br、I、OTs、OTf等)LU是接頭單元X是有效載荷或藥物部分備選地,可以通過在誘導二硫鍵于外部巰基和所并入的半胱氨酸殘基的硫原子之間形成的條件下與外部巰基的反應,綴合修飾的抗體或抗體片段中并入的Cys,如以下方案Ic中所顯示。在這些例子中,R可以是H;然而,已經發現其中一個或兩個R基團代表烷基例如甲基的化合物增加二硫鍵的穩定性。方案Ic.通過形成二硫鍵而綴合。每個R獨立地是H或C1-4烷基LU是接頭單元X是有效載荷或藥物部分僅以舉例方式,這類翻譯后修飾在上文方案(Ia)-(Ic)中顯示,其中起始結構代表在抗體輕鏈或重鏈中本文確定的特定位點之一處并入的半胱氨酸。用于實施這些綴合方法中每一者的方法是本領域熟知的。抗體可以通過這些方法在其輕鏈或其重鏈、或在輕鏈和重鏈中被修飾。其中已經修飾每條輕鏈或每條重鏈以含有單個并入的半胱氨酸的抗體通常將含有兩個綴合位點,因為抗體一般含有兩條輕鏈和兩條重鏈。一旦綴合,本申請的修飾抗體一般含有1-12個、往往2-8個和優選地2、4或6個–LU-X(接頭單元-有效載荷)部分。在一些實施方案中,修飾抗體輕鏈或重鏈以在本文中確定用于Cys置換的兩個特定位點處并入兩個新Cys殘基(或備選地,一個Cys并入輕鏈中和一個Cys并入重鏈中),從而四聚體抗體最終含有四個綴合位點。類似地,可以通過在輕鏈或重鏈或其組合中本文確定的特定位點處將其3或4個天然氨基酸替換為Cys,從而在四聚體抗體中產生6或8個綴合位點,修飾抗體。這些綴合物中的X代表有效載荷,所述有效載荷可以是可用于接合至抗體任何化學部分。在一些實施方案中,X是選自細胞毒素、抗癌藥、抗炎劑、抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生蟲藥、抗病毒藥、免疫增效劑和麻醉藥或任何其他治療藥、或生物活性部分或藥物部分中的藥物部分。在其他實施方案中,X是標記物如生物物理探針、熒光團、親和力探針、光譜探針、放射性探針、自旋標記物或量子點。在其他實施方案中,X是調節抗體的物理化學特性的化學部分如脂質分子、聚乙烯二醇、聚合物、多糖、脂質體或螯合劑。在其他實施方案中,X是有功能的或可檢出的生物分子如核酸、核糖核酸、蛋白質、肽(例如,酶或受體)、糖或多糖、抗體或抗體片段。在其他實施方案中,X是錨定部分如納米粒子、PLGA粒子、或表面、或使綴合物特異性結合另一個部分的任何結合部分如組氨酸標簽、多聚G、生物素、親和素、鏈霉親和素等。在其他實施方案中,X是可以用來使抗體綴合物接合另一個化學部分(如藥物部分、標記物、另一種抗體、另一個化學部分或表面)的反應性官能團。接頭單元(LU)可以是使巰基反應性基團(例如,馬來酰亞胺、α-鹵素羰基、乙烯基羰基(例如,丙烯酸酯或丙烯酰胺)、乙烯基砜、乙烯基吡啶或巰基)共價接合至有效載荷的任何合適的化學部分。許多合適的LU是本領域已知的。例如,LU可以包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個或多于六個本文中稱作L1、L2、L3、L4、L5和L6接頭。在某些實施方案中,LU包含選自非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭或其任何組合,并且LU任選地含有自降解(self-immolative)間隔子。在一些實施方案中,LU是式-L1-L2-L3-L4-或-L1-L-L3-L4-L5-L6-的基團。用于LU中的連接基L1、L2、L3、L4、L5和L6包括亞烷基團-(CH2)n-(其中n是1-20,一般是1-10或1-6)、乙二醇單位(-CH2CH2O-)n(其中n是1-20,一般是1-10或1-6)、酰胺–C(=O)-NH-或–NH-C(=O)-、酯–C(=O)-O-或–O-C(=O)-、具有兩個可用接合點的環如二價苯基、C3-8環烷基或C4-8雜環基團、氨基酸–NH-CHR*-C=O-或–C(=O)-CHR*-NH-,其中R*是已知氨基酸的側鏈(往往是規范氨基酸之一,但也包括例如正纈氨酸、正亮氨酸、高絲氨酸、同型半胱氨酸、苯基甘氨酸、瓜氨酸和其他指定的α-氨基酸)、具有已知氨基酸的多肽(例如,二肽、三肽、四肽等)、巰基-馬來酰亞胺鍵(來自添加–SH至馬來酰亞胺)、-S-CR2-和其他硫醚如-S-CR2-C(=O)-或-C(=O)-CR2-S-,其中R是如上文對方案Ic定義,-CH2-C(=O)-和二硫鍵(-S-S-)、以及上述這些與下述其他接頭(例如,鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭或包含自降解間隔子的接頭)的任何組合。在一些實施方案中,當LU是-L1-L2-L3-L4-L5-L6-時,L1、L2、L3、L4、L5和L6可以選自:-A1-、-A1X2-和-X2-;其中:A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8、-S-、-Si(OH)2O-、CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在一些實施方案中,L1、L2、L3、L4、L5和L6至少之一是穩定或不可切割的接頭。在一些實施方案中,L1、L2、L3、L4、L5和L6至少之一是可切割的接頭,所述接頭可以是化學可切割的(腙、二硫化物)或酶促可切割的。在一些實施方案中,酶促可切割的接頭是一個輕易由肽酶切割的接頭:Val-Cit接頭(纈氨酸-瓜氨酸)是一個這樣的接頭,其是具有兩個已知氨基酸的二肽。在其他實施方案中,酶促可切割的接頭是一個由葡糖醛酸糖苷酶的活性觸發的接頭:是這種接頭的例子,所述接頭還包含在生理條件下一旦葡糖醛酸糖苷酶切割糖苷鍵就自發降解的自降解間隔子。在一些實施方案中,本申請的免疫綴合物包含式IIA或式IIB的修飾半胱氨酸殘基:或者其中–CH2-S-代表在本文所述的選定Cys置換位點之一處并入的Cys的側鏈,并且L2–L6和X分別代表連接基團和有效載荷,如本文進一步描述。在IIA的一些實施方案中,L2是鍵。在IIB的一些實施方案中,L2是NH或O。在IIA和IIB二者的一些實施方案中,L3選自(CH2)1-10和(CH2CH2O)1-6。L4、L5和L6是選自本文所述那些接頭的額外的任選接頭。在某些實施方案中,L6可以是羰基(C=O)或包含自降解間隔子的接頭。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中:L1是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L2是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L3是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭,并且L4是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭或包含自降解間隔子的接頭。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L2是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L3是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭,并且L4是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭或包含自降解間隔子的接頭。在LU的一些實施方案中,L1、L2、L3、L4、L5和L6的至少之一是可切割接頭,并且LU視為可切割的。類似地,在LU的一些實施方案中,L1、L2、L3、L4、L5和L6至少之一是不可切割的接頭。在這些實施方案的某些中,LU的每個接頭是不可切割的,并且LU視為不可切割。在LU是–L1–L2–L3–L4–的一些前述實施方案中,L1、L2、L3和L4至少之一是選自-A1-、-A1X2-和-X2-的接頭;其中:A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、或-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O);每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在這些實施方案中,LU的其他接頭獨立選自鍵、-A1-、-A1X2-、-X2-、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭和包含自降解間隔子的接頭。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是鍵、-A1-、-A1X2-或-X2-;其中:A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、或-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9;L2是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L3是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭,并且L4是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭或包含自降解間隔子的接頭。在某些實施方案中,L1是C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-CH2CH2-S-,因此LU是–C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-CH2CH2-S-L2-L3-L4-。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是鍵、-A1-、-A1X2-或-X2-;其中:A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、或-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9;L2是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L3是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L4是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭或包含自降解間隔子的接頭。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是鍵、-A1-、-A1X2-或-X2-;其中:A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9;L2是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭;L3是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭或光可切割接頭,并且L4是鍵、非酶促可切割的接頭、不可切割的接頭、酶促可切割的接頭、光穩定性接頭、光可切割接頭或包含自降解間隔子的接頭。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是鍵、-A1-、-A1X2-或-X2-;其中:A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9;L2是鍵、非酶促可切割的接頭或不可切割的接頭;L3是鍵、非酶促可切割的接頭或不可切割的接頭;L4是鍵、酶促可切割的接頭或包含自降解間隔子的接頭。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是鍵、-A1-、-A1X2-或-X2-;L2是鍵、-A2-或-A2X2-;L3是鍵、-A3-或-A3X2-;L4是鍵、-A4-、-A4X2-、A1是-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;A2是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NR4-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nS-、-(C(R4)2)nS-、-S(CH2)n-、-S(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH-、-(C(R4)2)nNH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(=O)NH(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(=O)NH(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、A3是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nS-、-(C(R4)2)nS-、-S(CH2)n-、-S(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-,-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(=O)NH(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(=O)NH(C(R4)2)n-、-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(=O)-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mC(=O)-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mC(=O)-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、A4是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-(C(R4)2)nC(=O)NH-、-(CH2)nNHC(=O)-、-(C(R4)2)nNHC(=O)-、-NHC(=O)(CH2)n-、-NHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-C(=O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-S(C(R4)2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(C(R4)2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是鍵、-A1-、-A1X2-或-X2-;L2是鍵、-A2-或-A2X2-;L3是鍵、-A3-或-A3X2-;L4是鍵、-A4-、-A4X2-、A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;A2是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或A3是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或A4是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)NH-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-(CH2)nC(=O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;每個X2獨立地選自鍵、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在某些實施方案中,接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,其中L1是鍵、-A1-、-A1X2-或-X2-;L2是鍵、-A2-或-A2X2-;L3是鍵、-A3-或-A3X2-;L4是鍵、-A4-、-A4X2-、A1是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;A2是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-,-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或A3是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-或A4是-C(=O)NH-、-C(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;每個X2獨立地選自鍵、R8-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(=O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-;每個R4獨立地選自H、C1-4烷基、已知氨基酸的側鏈、-C(=O)OH和-OH,每個R5獨立地選自H、C1-4烷基、苯基或以1至3個–OH基團取代的C1-4烷基;每個R6獨立地選自H、氟、以-C(=O)OH取代的芐氧基、以–C(=O)OH取代的芐基、以-C(=O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(=O)OH取代的C1-4烷基;R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶;R8獨立地選自R9獨立地選自H和C1-6鹵代烷基;每個n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9,并且每個m獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在一個實施方案中,L1是–(CH2)1-10-C(=O)-,例如,–(CH2)5-C(=O)-;并且L2、L3和L4各自代表鍵。在某些實施方案中,LU包含這種式的val-cit接頭,其中X代表有效載荷,一般是藥物部分,如具有抗癌活性的一種藥物部分:當L4-L5-L6是如上顯示的val-cit接頭時,L3優選地是–(CH2)2-6-C(=O)-。在某些實施方案中,X基團是類美登素如DM1或DM4、或海兔毒素類似物或衍生物如海兔毒素10或15和澳瑞司他汀MMAF或MMAE、或刺孢霉素如N-乙酰基-γ-刺孢霉素、或標記物或染料如羅丹明或四甲基羅丹明。如本文所用,“接頭”是能夠連接抗體或其片段至X基團(有效載荷)以形成免疫綴合物的任何化學部分。接頭可以在化合物或抗體仍保持活性的條件下易受切割,如,酸誘導的切割、光誘導的切割、肽酶誘導的切割、酯酶誘導的切割和二硫鍵切割。備選地,接頭可以基本上抵抗切割。接頭可以包括或可以不包括自降解間隔子。如本文用來使X1基團與本文提供的修飾抗體或其抗體片段綴合的非酶促可切割接頭的非限制性例子包括酸不穩定接頭、含有二硫鍵部分的接頭、含有三唑部分的接頭、含有腙部分的接頭、含有硫醚部分的接頭、含有重氮基部分的接頭、含有肟部分的接頭、含有酰胺部分的接頭和含有乙酰胺部分的接頭。如本文用來使X基團與本文提供的修飾抗體或其抗體片段綴合的酶促可切割接頭的非限制性例子包括但不限于受蛋白酶切割的接頭、受酰胺酶切割的接頭和受β-葡糖醛酸糖苷酶或另一種糖苷酶切割的接頭。在某些實施方案中,這類酶可切割接頭是受組織蛋白酶切割的接頭,所述組織蛋白酶包括組織蛋白酶Z、組織蛋白酶B、組織蛋白酶H和組織蛋白酶C。在某些實施方案中,酶促可切割的接頭是受組織蛋白酶切割的二肽,所述二肽包括受組織蛋白酶Z、組織蛋白酶B、組織蛋白酶H或組織蛋白酶C切割的二肽。在某些實施方案中,酶促可切割的接頭是組織蛋白酶B可切割的肽接頭。在某些實施方案中,酶促可切割的接頭是組織蛋白酶B可切割的二肽接頭。在某些實施方案中,酶促可切割的二肽接頭是纈氨酸-瓜氨酸或苯丙氨酸-賴氨酸。如本文用來使X基團與本文提供的修飾抗體或其抗體片段綴合的酶促可切割接頭的其他非限制性例子包括但不限于受β-葡糖醛酸糖苷酶切割的接頭,例如,參見Ducry等人,BioconjugateChem,(2010)vol.21(1),5-13。“自降解間隔子”是雙官能化學部分,所述雙官能化學部分在一個末端與第一化學部分共價連接并且在另一個末端與第二化學部分共價連接,因而形成穩定的三部分分子。接頭可以包含與化學或酶促地從間隔子可切割的第三化學部分結合的自降解間隔子。一旦切割自降解間隔子和第一化學部分或第三化學部分之間的鍵,則自降解間隔子發生快速和自發的分子內反應并且因而從第二化學部分分離。這些分子內反應通常涉及電子重排如1,4、或1,6、或1,8消去反應或環化以形成高度有利的五元或六元環。在本申請的某些實施方案中,第一或第三部分是酶可切割的基團,并且這種切割因酶促反應所致,而在其他實施方案中,第一或第三部分是酸不穩定基并且這種切割因pH的變化而發生。如適用于本申請,第二部分是如本文定義的“有效載荷”基團。在某些實施方案中,第一或第三部分從自降解間隔子中的切下因蛋白水解酶的切割作用所致,而在其他實施方案中,它因水解酶切割所致。在某些實施方案中,第一或第三部分從自降解間隔子中的切下因組織蛋白酶或葡糖醛酸糖苷酶的切割作用所致。在某些實施方案中,酶可切割接頭是肽接頭并且自降解間隔子在其一個末端共價連接至肽接頭并且在另一個接頭共價連接至藥物部分。這個三部分分子是穩定的并且在不存在酶的情況下無藥理學活性,但是所述分子是由酶在共價連接間隔子部分和肽部分的鍵處酶促可切割的。肽部分從三部分分子切下,這啟動間隔子部分的自我降解特征,導致自發切割間隔子部分與藥物部分共價連接的鍵,因而實現藥物以藥理活性形式釋放。在其他實施方案中,接頭包含在一個末端直接或間接連接至肽和在另一端連接至有效載荷的自降解間隔子;并且間隔子與可以從間隔子(如由葡糖醛酸糖苷酶)酶促切下的第三部分接合。一旦切割第三部分,則間隔子以引起有效載荷釋放的方式降解或重排。具有這種類型的自降解間隔子的接頭的例子是葡糖醛酸糖苷酶可切割的這種接頭,其中葡糖醛酸酶催化的縮醛水解釋放了生理條件下自發降解的酚化合物:任選地用于X1基團與本文提供的修飾的抗體或其抗體片段綴合中的自降解間隔子的非限制性例子包括但不限于以下部分:包含芐基羰基部分、芐基醚部分、4-氨基丁酸酯部分、半硫胺(hemithioaminal)部分或N-酰基半硫胺部分。自降解間隔子的其他例子包括但不限于對氨基苯甲氧基羰基、電子上類似于對氨基苯甲氧基羰基的芳香族化合物如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物和鄰氨基芐基乙縮醛或對氨基芐基乙縮醛。在某些實施方案中,當酰胺鍵水解時經歷環化的本文所用的自降解間隔子包括取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺和2-氨基苯基丙酸酰胺。在某些實施方案中,自降解間隔子是而在其他實施方案中,自降解間隔子是其中n是0或1。在其他實施方案中,自降解間隔子是其中n是1或2。在其他實施方案中,自降解間隔子是其中n是1或2。在其他實施方案中,自降解間隔子是其中n是1或2。在其他實施方案中,自降解間隔子是其中n是1或2。方案(2a-2c)顯示本文提供的修飾抗體或其抗體片段的翻譯后修飾,其中接頭單元(LU)是–L1–L2–L3–L4–,并且在每種情況下L1是與新Cys反應的基團。方案2a.方案2b.方案3c.在方案2a-2c的每個方案中,起始物質是如本文所述修飾的抗體或抗體片段中的Cys替換殘基,其中劃虛線的鍵表示連接至抗體或抗體片段的毗鄰殘基;每個R是H或C1-4烷基、一般是H或甲基;L2、L3和L4是連接單元LU的組件,如上文描述的那些;X是有效載荷;并且使L2與本申請的取代基Cys的硫連接的基團是L1。在本申請的一些實施方案中,X是可以用來通過與合適的互補的官能團相互作用,使綴合的抗體與另一個化學部分連接的反應性官能團。表3描述X可以代表的反應性官能團的一些例子,以及可以用來使包含X的綴合物與另一種化合物連接的互補官能團。使用X連接至相應互補官能團的方法是本領域熟知的。使用疊氮化物的連接一般使用‘點擊(Click)’或無銅點擊化學進行;涉及肼、烷氧基胺或酰基肼的反應一般通過與羰基官能團之一形成西夫堿推進。表3使用這些組件產生的示例性連接產物在表4中描述,其中Y1代表本申請的抗體,A1代表連接抗體至有效載荷Xa的連接單元(LU),式II-a中的-L2-L3-L4-代表可以在分子中存在以通過Xa與綴合的抗體連接的接頭單元,并且X1代表有效載荷。有效載荷Xa是反應性官能團,并且在式II-a上的Xb是相應的互補官能團,并且式II-a本身代表與綴合的抗體連接的分子。表4中的第三列描述了來自Xa與Xb反應的產物。表4在某些實施方案中,本文提供的修飾的抗體或其抗體片段以約1和16之間如1-12、或1、2、3、4、5、6、7或8的“X基團對抗體”(有效載荷對抗體)比率綴合,其中修飾的抗體或其抗體片段含有1、2、3、4、5、6、7或8個在本文公開的特定位點處并入的半胱氨酸殘基。例如,可以通過并入兩個Cys殘基至抗體重鏈中,實現“X基團對抗體”比率4,所述抗體重鏈將會含有4個綴合位點,每條重鏈各有兩個。這類抗體的免疫綴合物將含有高達4個有效載荷基團,所述有效載荷基團可以相似或不同,且優選地是全部相似。在另一個例子中,可以通過將一個Cys殘基并入抗體的重鏈中并將第二個Cys殘基并入抗體的輕鏈中,實現“X基團對抗體”比率4,導致4個綴合位點,兩個在兩條重鏈中和兩個在兩條輕鏈中。可以通過在抗體的重鏈和輕鏈中組合本申請的3、4個或更多個半胱氨酸置換,實現6、8或更高的比率。將多個半胱氨酸基團置換至抗體中可能導致不適宜的二硫鍵形成和其他問題。因此對于負載多于4個有效載荷基團到一個抗體分子上,本申請的方法可以備選地與不依賴在半胱氨酸硫處反應的方法(如在賴氨酸處酰化或通過S6標簽或Pcl方法學綴合)組合。盡管對于特定綴合物分子而言,有效載荷對抗體比率具有確切的值,但是可以理解當用來描述含有許多分子的樣品時,該值將經常是平均值,原因在于某種程度的均一性,一般在綴合步驟中。免疫綴合物樣品的平均載量在本文中稱作藥物對抗體比率或“DAR”。在一些實施方案中,DAR在約4至約16之間,并且一般是約4、5、6、7、8。在一些實施方案中,以重量計至少50%的樣品是具有加或減2的平均比率的化合物,并且優選地至少50%的樣品是含有平均比率加或減1的綴合物。優選實施方案包括其中DAR是約2或約8,例如約2、約4、約6或約8的免疫綴合物。在一些實施方案中,‘約n’的DAR意指DAR的測量值在n的10%內部(在式(I)中)。3.Fc區構架的進一步改變本申請提供位點特異性標記的免疫綴合物。本申請的免疫綴合物可以包含修飾的抗體或其抗體片段,所述修飾的抗體或其抗原結合片段還在VH和/或VL內部包含對構架殘基的修飾,例如以改善抗體的特性。一般地,進行這種構架修飾以降低抗體的免疫原性。例如,一種方案是將一個或多個構架殘基“回復突變”成相應的種系序列。更具體地,已經歷過體細胞突變的抗體可以含有與衍生該抗體的種系序列不同的構架殘基。可以通過將抗體構架序列與衍生該抗體的種系序列比較而確定這類殘基。為了使構架區序列恢復其種系構型,可以例如通過位點定向誘變,將體細胞突變“回復突變”成種系序列。此類“回復突變的”抗體也意在由本申請涵蓋。另一個類型的構架修飾涉及使構架區內部、或甚至一個或多個CDR區內部的一個或多個殘基突變,以移除T細胞表位,從而減少抗體的潛在免疫原性。該方法也稱為“去免疫化”,并進一步詳細描述于Carr等的美國專利公開號20030153043中。除在構架區或CDR區內進行的修飾外,本申請的抗體還可以或備選地可以被改造以包括Fc區內的修飾,通常用來改變抗體的一種或多種功能性質,如血清半壽期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外,可化學修飾(例如,一個或多個化學部分可連接到抗體上)或修飾本申請的抗體以改變其糖基化,進而改變抗體的一種或多種功能性質。下文中進一步詳細描述了這些實施方案中的每一個方案。在一個實施方案中,修飾CH1的鉸鏈區,使得改變例如增加或減少鉸鏈區中半胱氨酸殘基的數目。Bodmer等的美國專利號5,677,425中進一步描述了該方法。改變CH1的鉸鏈區中半胱氨酸殘基的數目,例如用來便于輕鏈和重鏈的裝配、或提高或降低抗體的穩定性。在另一實施方案中,突變抗體的Fc鉸鏈區,以降低抗體的生物半壽期。更特別地,可以向Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區引入一個或多個氨基酸突變,使得抗體相對于天然的Fc鉸鏈結構域SpA結合具有受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。在Ward等人的美國專利號6,165,745中更詳細地描述了這種方法。還在其他實施方案中,通過將至少一個氨基酸殘基替換為不同氨基酸殘基,改變Fc區,以改變抗體的效應子功能。例如,可用不同氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸,使得抗體對效應子配體具有改變的親和力,但保留親本抗體的抗原結合能力。改變對配體的親和力的效應子配體可以是例如Fc受體或補體的C1組分。這種方法在Winter等人的美國專利號5,624,821和5,648,260中描述。在另一實施方案中,可用不同氨基酸殘基替換選自氨基酸殘基的一個或多個氨基酸,使得抗體具有改變的C1q結合和/或降低的或消除的補體依賴性細胞毒性(CDC)。在例如Idusogie等人的美國專利號6,194,551中描述這種方法。在另一實施方案中,改變一個或多個氨基酸殘基,由此改變抗體固定補體的能力。在例如Bodmer等人的PCT公開WO94/29351中描述了這種方法。在一個具體實施方案中,將本申請的抗體或其抗體片段的一個或多個氨基酸替換為一個或多個異型氨基酸殘基。異型氨基酸殘基還包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亞類的重鏈的恒定區以及κ同種型的輕鏈的恒定區,如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所描述。還在另一實施方案中,修飾Fc區以提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力,和/或通過修飾一個或多個氨基酸來增加抗體對Fcγ受體的親和力。在例如Presta的PCT公開WO00/42072中描述了這種方法。另外,已經繪制了人IgG1上FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點,并且已經描述了具有改進的結合作用的變體(見Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。還在另一實施方案中,修飾抗體的糖基化。例如,可以產生非糖基化的抗體(即,抗體缺少糖基化)。可以改變糖基化以便例如增加抗體對抗原的親和力。這類糖修飾也可以通過例如改變抗體序列內部的一個或多個糖基化位點來完成。例如,可以產生一個或多個氨基酸置換,所述氨基酸置換導致消除一個或多個可變區構架糖基化位點,從而消除在這個位點處的糖基化。這種非糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。在例如Co等人的美國專利號5,714,350和6,350,861中描述了這種方法。額外地或備選地,可以產生一種抗體,所述抗體具有改變的糖基化類型,如巖藻糖殘基數量減少的過低巖藻糖基化的抗體或對分型GlcNac結構增加的抗體。這類改變的糖基化模式已經展示增加抗體的ADCC能力。這類糖修飾可以通過例如在具有改變的糖基化裝置的宿主細胞中表達這種抗體而完成。已經在本領域中描述了具有改變的糖基化裝置的細胞,并且該細胞可用作表達本申請重組抗體的宿主細胞,由此產生具有改變的糖基化的抗體。例如,Hang等人的EP1,176,195描述了編碼巖藻糖基轉移酶的FUT8基因在功能上遭破壞的細胞系,從而在這種細胞系中表達的抗體顯示過低巖藻糖基化。Presta的PCT公開WO03/035835描述了一種變異CHO細胞系(Lecl3細胞),所述細胞系具有降低的將巖藻糖連接至Asn(297)聯糖的能力,這也導致在這種宿主細胞中表達的抗體過低巖藻糖基化(還見Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公開WO99/54342描述了經工程化以表達修飾糖蛋白的糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))的細胞系,從而在這種工程化的細胞系中表達的抗體顯示出增加的對分GlcNac結構,這導致抗體的增加的ADCC活性(還參見Umana等人,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。在另一實施方案中,修飾抗體以增加其生物半壽期。可使用多種方法。例如,可以引入以下一種或多種突變:T252L、T254S或T256F,如Ward的美國專利號6,277,375中所述。備選地,為了增加生物半壽期,可以在CH1或CL區內部改變抗體以含有救援受體(salvagereceptor)結合表位,所述救援受體結合表位取自IgG的Fc區的CH2結構域的兩個環,如Presta等人的美國專利5,869,046和6,121,022中所述。4.抗體綴合物本申請提供位點特異性標記方法、修飾的抗體及其抗體片段和如此制備的免疫綴合物。使用本申請的方法,可將修飾的抗體或其抗體片段綴合于標記物,如藥物部分,例如,抗癌藥、自身免疫治療藥、抗炎劑、抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生蟲藥、抗病毒藥、或麻醉藥、或成像試劑如PET成像用螯合劑、或熒光標記物、或MRI造影試劑(contrastreagent)。也可以使用幾個相同或不同標記部分,將本申請方法與其他綴合方法組合,來綴合抗體或抗體片段。在某些實施方案中,本申請的免疫綴合物包含藥物部分,所述藥物部分選自V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTOR抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、澳瑞司他汀、海兔毒素、類美登素、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白質CRM1核輸出的抑制劑、DPPIV抑制劑、蛋白酶體抑制劑、線粒體中磷酰基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合物、拓撲異構酶抑制劑、RNA合成抑制劑、驅動蛋白抑制劑、蛋白質-蛋白質相互作用的抑制劑、Eg5抑制劑、和DHFR抑制劑。另外,本申請的修飾的抗體或抗體片段可以與調節給定生物學反應的藥物部分綴合。藥物部分不得解釋為限于經典的化學治療藥。例如,藥物部分可以是免疫調節物,如免疫增效劑、小分子免疫增效劑、TLR激動劑、CpG寡聚體、TLR2激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR9激動劑、TLR8激動劑、T細胞表位肽等。藥物部分也可以是寡核苷酸、siRNA、shRNA、cDNA等。備選地,藥物部分可以是擁有所需生物活性的蛋白質、肽或多肽。這類蛋白質可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素、或白喉毒素、蛋白質如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原激活物、細胞因子、凋亡劑、抗血管生成劑、或生物學應答調節物,例如淋巴因子。在一個實施方案中,本申請的修飾的抗體或抗體片段與藥物部分、如細胞毒素、藥物(例如,免疫抑制劑)或放射性毒素綴合。細胞毒素的例子包括但不限于紫杉烷類(參見例如,國際(PCT)專利申請號WO01/38318和PCT/US03/02675)、DNA烷化劑(例如,CC-1065類似物)、蒽環類、微管溶素類似物、倍癌霉素(duocarmycin)類似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、類美登素和細胞毒藥物,包含反應性聚乙二醇部分(參見例如,Sasse等人,J.Antibiot.(Tokyo),53,879-85(2000);Suzawa等人,Bioorg.Med.Chem.,8,2175-84(2000);Ichimura等人,J.Antibiot.(Tokyo),44,1045-53(1991);Francisco等人,(2003)(電子出版先于印刷出版))、美國專利號5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931、美國專利申請公開號2001/0036923A1、待決美國專利申請系列號10/024,290和10/116,053和國際(PCT)專利申請號WO01/49698)、紫杉酚、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙堿、多柔比星、佐柔比星、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質激素和嘌呤霉素及其類似物或同源物。治療劑還包括例如抗代謝物(例如,甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、消融劑(例如,氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法倉、卡莫司汀(BSNU)和羅莫司汀(CCNU)、環磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂霉素C和順-二氯二胺鉑(II)(DDP)、順鉑、蒽環類(例如,佐柔比星(以前稱作柔紅霉素)和多柔比星)、抗生素(例如,更生霉素(以前稱作放線菌素)、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有絲分裂藥(例如,長春新堿和長春堿)。(參見例如,SeattleGeneticsUS20090304721)。可以與本申請的修飾的抗體或抗體片段綴合的治療性細胞毒素的其他例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生和澳瑞司他汀和其衍生物。刺孢霉素抗體綴合物的例子是可商業獲得的(MylotargTM;Wyeth-Ayerst)。關于各種細胞毒素、接頭和用于治療藥與抗體綴合的方法的進一步討論,還參見Saito等人,(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215;Trail等人,(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337;Payne,(2003)CancerCell3:207-212;Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763;Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091;Senter和Springer,(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。根據本申請,修飾的抗體或其抗體片段也可以與放射性同位素綴合以產生細胞毒性放射藥物,稱作放射免疫綴合物。可以與抗體綴合的用于診斷或治療性用途的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔90和镥177。本領域中建立了用于制備放射免疫綴合物的方法。放射免疫綴合物的例子是可商業獲得的,包括ZevalinTM(IDECPharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals),并且相似的方法可以用來利用本申請的抗體制備放射免疫綴合物。在某些實施方案中,大環螯合劑是1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA),其可通過接頭分子附著到抗體上。這類接頭分子是本領域共知的并且在Denardo等人,(1998)ClinCancerRes.4(10):2483-90;Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.10(4):553-7;和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中描述,所述文獻每篇通過引用的方式完整并入。本申請還提供了與抗原特異性結合的修飾的抗體或其片段。修飾的抗體或片段可以與異源蛋白或多肽(或其片段、優選地與至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個氨基酸的多肽)綴合或融合以產生融合蛋白。特別地,本申請提供融合蛋白,所述融合蛋白包含本文所述的抗體片段(例如,Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH結構域、VHCDR、VL結構域或VLCDR)和異源蛋白、多肽或肽。在一些實施方案中,本申請的無抗原結合特異性的修飾抗體片段,如但不限于半胱氨酸殘基工程化的修飾Fc結構域,用來產生包含這種抗體片段(例如,工程化Fc)和異源蛋白、多肽或肽的融合蛋白。可通過基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(統稱為“DNA改組”)技術,產生其他融合蛋白。可利用DNA改組來改變本申請抗體或其片段的活性(例如,具有更高親和力和更低解離速率的抗體或其片段)。通常參見,美國專利號5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458;Patten等人,(1997),Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33;Harayama,(1998),TrendsBiotechnol.16(2):76-82;Hansson等人,(1999),J.Mol.Biol.287:265-76;和Lorenzo和Blasco,(1998),Biotechniques24(2):308-313(這些專利和出版物的每篇每因而通過引用方式完整地并入)。可以通過在重組之前借助易錯PCR、隨機核苷酸插入或其他方法經歷隨機誘變,改變抗體或其片段或編碼的抗體或其片段。編碼與抗原特異性結合的抗體或其片段的多核苷酸可以與一種或多種異源分子的一種或多種組分、基序、節段、部分、結構域、片段等重組。另外,本申請的修飾的抗體或其抗體片段可以綴合于標記序列,如促進純化的肽。在優選的實施方案中,標記氨基酸序列是六組氨酸肽,如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的標簽等,它們中的許多是可商業獲得的。如Gentz等,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824中所述,例如,六組氨酸為純化融合蛋白提供了便利。用于純化的其他肽標簽包括但不限于血凝素(“HA”)標簽,其對應于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,(1984)Cell37:767),和“FLAG”標簽(A.Einhauer等人,J.Biochem.Biophys.Methods49:455–465,2001)。根據本申請,抗體或抗體片段也可以與滲透腫瘤的肽綴合以提高它們的效力。在其他實施方案中,本申請的修飾抗體或抗體片段與診斷物質或可檢測物質綴合。這類免疫綴合物可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的功效),用于監測或預測疾病或病癥的發作、形成、進展和/或嚴重性。可以通過將抗體與可檢測物質偶聯實現這類診斷和檢測,所述可檢測物質包括但不限于多種酶,如但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶;輔基,如但不限于鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素;熒光物質,如但不限于AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白;發光物質,如但不限于魯米諾;生物發光物質,如但不限于螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白;放射性物質,如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn和117Sn;和用于各種正電子發射成像術中的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。本申請的修飾的抗體或抗體片段也可以接合至固相支持物,所述支持物特別可用于免疫測定法或靶抗原的純化。此類固相支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。5.藥物組合物為了制備包含免疫綴合物的藥物組合物或無菌組合物,將本申請的免疫綴合物與可藥用載體或賦形劑混合。該組合物可以額外地含有一種或多種適于治療或預防癌癥(乳腺癌、結直腸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、外周神經鞘腫瘤(例如,神經鞘瘤)、頭頸癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、膠質母細胞瘤、軟組織的透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤病、腎癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房發育癥和子宮內膜異位癥)的其他治療藥。可以通過與生理可接受載體、賦形劑或穩定劑混合以例如凍干散劑、膏劑、水溶液劑、洗劑或混懸劑的形式制備治療劑和診斷劑的制劑(參見,例如,Hardman等人,GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.,2001;Gennaro,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,NewYork,N.Y.,2000;Avis等人,(編著),PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedications,MarcelDekker,NY,1993;Lieberman等人,(編著),PharmaceuticalDosageForms:Tablets,MarcelDekker,NY,1990;Lieberman等人,(編著)PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystems,MarcelDekker,NY,1990;Weiner和Kotkoskie,ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,2000)。治療劑施用方案的選擇取決于若干因素,包括該實體的血清或組織周轉率、癥狀水平、該實體的免疫原性、及在生物基質中的靶細胞可達性。在某些實施方案中,符合可接受的副作用水平,施用方案使遞送給患者的治療劑的量最大化。因此,遞送的生物劑的量部分取決于具體實體和所治療病癥的嚴重性。選擇適宜劑量抗體、細胞因子和小分子的指南是可獲得的(參見,例如,Wawrzynczak,AntibodyTherapy,BiosScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996;Kresina(編著),MonoclonalAntibodies,CytokinesandArthritis,MarcelDekker,NewYork,N.Y.,1991;Bach(編著),MonoclonalAntibodiesandPeptideTherapyinAutoimmuneDiseases,MarcelDekker,NewYork,N.Y.,1993;Baert等人,NewEngl.J.Med.348:601-608,2003;Milgrom等人,NewEngl.J.Med.341:1966-1973,1999;Slamon等人,NewEngl.J.Med.344:783-792,2001;Beniaminovitz等人,NewEngl.J.Med.342:613-619,2000;Ghosh等人,NewEngl.J.Med.348:24-32,2003;Lipsky等人,NewEngl.J.Med.343:1594-1602,2000)。由臨床醫生,例如,使用本領域已知或疑似影響治療或預計影響治療的參數或因素確定適宜的劑量。通常,劑量始于或多或少小于最佳劑量的量并此后將它以小增量增加,直至相對于任何不利副作用,實現所需的或最佳的效果。重要的診斷量值包括癥狀(例如炎癥)的那些量值或產生的炎性細胞因子的水平。可改變本申請的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平,以獲得活性成份的下述量,所述量就具體患者、組合物和施用方式而言可以有效達到所希望的治療反應,并同時對患者無毒性。選擇的劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學因素,包括所用的本申請具體組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時間、正在使用的特定化合物的排泄速率、治療的持續期、與所用特定組合物聯合使用的其他藥物、化合物和/或材料、正在治療的患者的年齡、性別、重量、狀況、總體健康和既往醫史等醫學領域已知的因素。可以通過連續輸注或通過以例如,1日、1周或每周1-7次的時間間隔,提供包含本申請的抗體或其片段的組合物。可通過靜脈內、皮下、局部、口服、鼻、直腸、肌肉內、腦內或通過吸入來提供劑量。具體劑量方案可以涉及避免顯著不良副作用的最大劑量或劑量頻率。對于本申請的免疫綴合物,向患者施用的劑量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者體重。劑量可在0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg、或0.01至0.10mg/kg患者體重之間。可以用以千克(kg)計的患者體重乘以以mg/kg計的待施用劑量來計算本申請的抗體或其片段的劑量。可以重復本申請免疫綴合物的劑量并且各次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3個月或至少6個月。在一個具體實施方案中,每3周重復本申請的免疫綴合物的劑量。特定患者的有效量可以根據多種因素變動,如正在治療的病狀、患者的總體健康、施用方法、途徑和劑量和副作用的嚴重程度(參見,例如,Maynard等人,AHandbookofSOPsforGoodClinicalPractice,InterpharmPress,BocaRaton,Fla.,1996;Dent,GoodLaboratoryandGoodClinicalPractice,UrchPubl.,London,UK,2001)。施用途徑可以是通過靜脈內、腹膜內、腦內、肌內、眼內、動脈內、腦室椎管內、病灶內或通過緩釋系統或植入物借助例如局部或皮膚施加、注射或輸注(參見例如,Sidman等人,Biopolymers22:547-556,1983;Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981;Langer,Chem.Tech.12:98-105,1982;Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692,1985;Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030-4034,1980;美國專利號6,350,466和6,316,024)。如果需要,組合物也可以包含增溶劑和局部麻醉藥,如利多卡因,以便減輕注射部位處的疼痛。此外,也可以利用肺部施用法,例如,通過使用吸入器或霧化器和含有霧化劑的制劑。參見,例如,美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078;和PCT公開號WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903,每份專利通過引用方式完整并入本文。也可用本領域已知的多種方法中的一種或多種方法,經由一種或多種施用途徑,施用本申請的組合物。熟練技術人員將理解,施用的途徑和/或模式將取決于所希望的結果而變。用于本申請免疫綴合物的所選擇施用途徑包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、皮下、脊髓或其他腸胃外施用途徑,例如通過注射或輸注。胃腸外施用可以是除了腸和局部施用以外的施用模式,通常通過注射進行,并包括但不限于靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。備選地,本申請的組合物可經非胃腸外途徑,例如局部、表皮或黏膜施用途徑施用,例如鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部施用。在一個實施方案中,通過輸注法施用本申請的免疫綴合物。在另一個實施方案中,皮下施用本申請的免疫綴合物。如果本申請的免疫綴合物在控釋或緩釋系統中施用,則泵可以用來實現控釋或緩釋(參見Langer,上文;Sefton,CRCCrit.RefBiomed.Eng.14:20,1987;Buchwald等人,Surgery88:507,1980;Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574,1989)。高分子材料可以用來實現本申請治療藥的控釋或緩釋(參見例如,MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(編著),CRCPres.,BocaRaton,Fla.,1974;ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(編著),Wiley,NewYork,1984;Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1983;還參見Levy等人,Science228:190,1985;During等人,Ann.Neurol.25:351,1989;Howard等人,J.Neurosurg.71:105,1989;美國專利號5,679,377;美國專利號5,916,597;美國專利號5,912,015;美國專利號5,989,463;美國專利號5,128,326;PCT公開號WO99/15154;和PCT公開號WO99/20253。在持續釋放制劑中使用的聚合物的例子包括但不限于,聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚原酸酯。在一個實施方案中,在持續釋放制劑中使用的聚合物是惰性的、不含可瀝濾的雜質、儲存時穩定、無菌和可生物降解。可以將控釋或持續釋放系統靠近預防靶或治療靶布置,因此僅需要全身性劑量的一部分(見,例如,Goodson,引自MedicalApplicationsofControlledRelease,上文,第2卷,第15-138頁,1984)。控釋系統在Langer,Science249:1527-1533,1990的綜述中討論。本領域技術人員已知的任何技術可以用來產生包含本申請的一種或多種免疫綴合物的持續釋放制劑。參見,例如,美國專利號4,526,938,PCT公開WO91/05548,PCT公開WO96/20698,Ning等人,Radiotherapy&Oncology39:179-189,1996;Song等人,PDAJournalPharmaceuticalScience&Technology50:372-397,1995;Cleek等人,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854,1997;和Lam等人,Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760,1997,所述的每篇文獻通過引用方式完整并入本文。如果局部施用本申請的免疫綴合物,則可以將它們按油膏劑、乳膏劑、透皮貼劑、洗劑、凝膠劑、洗發劑、噴霧劑、氣溶膠劑、溶液劑、乳劑的形式或本領域技術人員熟知的其他形式配制。參見,例如,Remington'sPharmaceuticalSciencesandIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第19版,MackPub.Co.,Easton,Pa.(1995)。對不可噴霧的局部劑型,通常使用黏性至半固體或固體形式,該形式包含與局部施用相容的載體或一種或多種賦形劑,并在某些情況下具有大于水的動態黏度。合適的制劑包括但不限于溶液劑、混懸劑、乳劑、乳膏劑、油膏劑、散劑、搽劑、藥膏劑等,如果需要,將它們進行消毒或與影響多種特性(例如,滲透壓)的助劑(例如,防腐劑、穩定劑、潤濕劑、緩沖液或鹽)混合。其他合適的局部用劑型包括可噴霧氣溶膠制品,其中與固體或液體惰性載體組合的有效成分在一些情況下包裝在含有加壓的揮發性物質(例如,氣態推進劑,如FreonTM)的混合物中或擠瓶中。如果需要,也可以將潤濕劑或濕潤劑添加至藥物組合物和劑型。這類額外成分的例子是本領域熟知的。如果鼻內施用包含免疫綴合物的組合物,則可以將它以氣溶膠劑、噴霧劑、霧化劑形式或以滴劑形式配制。具體而言,根據本申請用的預防藥或治療藥可以在采用合適推進劑(例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適氣體)的情況下,以從加壓的包裝或霧化器中提供的氣溶膠噴霧劑形式便利地遞送。在加壓氣霧劑的情況下,可通過提供閥門、確定劑量單位、以提供經計量的量。可以配制用于吸入器或吹入器中的膠囊劑和套筒劑(cartridge)(由例如明膠組成),其含有所述化合物及合適散劑基底(powderbase)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。與第二治療藥例如細胞因子、類固醇、化療藥、抗生素或輻射共施用或治療的方法是本領域已知的(參見,例如,Hardman等人,(編著)(2001)GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第10版,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.;Poole和Peterson(編著)(2001)PharmacotherapeuticsforAdvancedPractice:APracticalApproach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.;Chabner和Longo(編著)(2001)CancerChemotherapyandBiotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治療劑可使癥狀減少至少10%、至少20%、至少約30%、至少40%或至少50%。可以與本申請的免疫綴合物組合施用的額外治療(例如,預防藥或治療藥)可以按照與本申請的免疫綴合物間隔小于5分鐘、間隔小于30分鐘、間隔1小時,按間隔約1小時、間隔約1至約2小時、間隔約2小時至約3小時、間隔約3小時至約4小時、間隔約4小時至約5小時、間隔約5小時至約6小時、間隔約6小時至約7小時、間隔約7小時至約8小時、間隔約8小時至約9小時、間隔約9小時至約10小時、間隔約10小時至約11小時、間隔約11小時至約12小時、間隔約12小時至18小時、間隔18小時至24小時、間隔24小時至36小時、間隔36小時至48小時、間隔48小時至52小時、間隔52小時至60小時、間隔60小時至72小時、間隔72小時至84小時、間隔84小時至96小時、或間隔96小時至120小時施用。可在同一次患者就診中施用2種或更多種療法。在某些實施方案中,可以配制本申請的免疫綴合物以確保恰當的體內分布。例如,血腦屏障(BBB)排除許多高親水性化合物。為了確保本申請的治療性化合物跨過BBB(如果希望),可將它們配制在例如脂質體中。對于制造脂質體的方法,參見,例如美國專利號4,522,811;5,374,548;和5,399,331。脂質體可以包含一個或多個被選擇性轉運至特定細胞或器官中的部分,因而增強靶向的藥物遞送(參見,例如Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括葉酸或生物素(見,例如Low等人的美國專利號5,416,016);甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(Bloeman等人,(1995)FEBSLett.357:140;Owais等人,(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性蛋白質A受體(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134);p120(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090);還參見K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler(1994)Immunomethods4:273。本申請提供向有需求的受試者單獨或與其他治療藥組合下施用包含本申請免疫綴合物的藥物組合物的方案。本申請聯合療法的治療(例如,預防藥或治療藥)可以同時或依次向受試者施用。本申請聯合療法的治療(例如,預防藥或治療藥)也可以循環施用。循環治療涉及施用第一治療藥(例如,第一預防藥或治療藥)一段時間,隨后施用第二治療藥(例如,第二預防藥或治療藥)一段時間并重復這種依次施用,即,重復該循環,以減少對一種治療藥(例如藥物)的耐藥性形成,以避免或減少一種治療藥(例如藥物)的副作用和/或以改善治療藥的效力。本申請聯合療法的治療(例如,預防藥或治療藥)可以同時施用至受試者。術語“同時”不限于在完全相同的時間施用治療(例如,預防藥或治療藥),而是意指將包含本申請抗體或其片段的藥物組合以這樣的順序并在這樣的時間間隔內施用至受試者,從而本申請的抗體可以與另一種治療或多種治療一起發揮作用,以提供與如果另外施加它們相比而言增加的益處。例如,可在同一時間或在不同時點以任意順序順次對個體施用各療法;然而,如果不在同一時間施用,則應在足夠接近的時間內施用,以提供希望的治療效果或預防效果。可以以任意合適的形式和通過任意合適的途徑對受試者分開施用各療法。在多個實施方案中,將治療(例如,預防藥或治療藥)相隔小于15分鐘、小于30分鐘、小于1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔24小時、48小時、72小時或1周施用至受試者。在其他實施方案中,將兩種或更多種治療(例如,預防藥或治療藥)在相同的患者訪視中施用。聯合療法的預防劑或治療劑可在同一藥物組合物中施用給個體。備選地,聯合療法的預防藥或治療藥可以在分立的藥物組合物中同時施用至受試者。可通過相同或不同的施用途徑對個體施用這些預防劑或治療劑。已經充分描述了本申請,通過以下實施例和權利要求進一步說明本發明,所述實施例和權利要求是說明性的并且不意圖是進一步限制性的。實施例實施例1.有效載荷化合物下表5列出了在產生如本申請實施例中所述的抗體藥物綴合物中使用的各種有效載荷化合物的結構。化合物A-E和合成這些化合物的方法例如在PCT/US2014/024795中公開,并且化合物F例如在PCT/US2014/070800中公開,所述兩份文獻均通過引用方式完整并入本文。下文公開化合物G的合成方法。化合物G:合成過程合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(MC-MMAF,化合物G)MMAF-OMe(135mg,ConcortisBiosystems)溶解于CH3CN(10mL)中。向所產生的清亮溶液添加5mL水,隨后添加0.375mL1N氫氧化鈉水溶液(認證的,FisherScientific)。將反應混合物在21℃磁力攪拌18小時,此時LCMS分析顯示完全反應。將反應混合物冷凍并凍干,產生MMAF鈉鹽。LCMS保留時間為0.911分鐘。MS(ESI+)m/z732.5(M+1)。先前反應中如此獲得的全部MMAF鈉鹽溶解于10mLDMSO中。在獨立反應容器中,將6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸(95mg)用3.0mLDMSO中的HATU(165mg)和DIEA(0.126mL)在21℃處理25分鐘。將活化酯的完整反應混合物添加至MMAF鈉鹽溶液并且將反應混合物在相同溫度攪拌3小時。反應混合物在40mLEtOAc和20mL5%含水檸檬酸之間分配。將有機層分離并將水層用20mLEtOAc提取。將合并的有機層用10mLNaCl飽和溶液洗滌、經無水MgSO4干燥、過濾并在降低的壓力下濃縮。在ISCOCombiFlash儀上使用ISCOC18gold15.5g柱純化殘余物。將所需的物質用H2O中的50%CH3CN洗脫。將含有所需產物的級分合并并凍干,產生作為白色固體的化合物。LCMS保留時間為1.392分鐘。MS(ESI+)m/z925.6(M+1)。表5:測試的接頭-有效載荷實施例2.曲妥珠單抗Cys突變抗體的制備將編碼曲妥珠單抗(一種抗HER2抗體(術語“曲妥珠單抗”、“抗HER2抗體”和“TBS”在本文中可互換地使用))重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA化學合成并克隆至含有人IgG1和人κ輕鏈的恒定區的兩個哺乳動物表達載體pOG-HC和pOG-LC中,分別產生兩個野生型構建體:pOG-曲妥珠單抗HC和pOG-曲妥珠單抗LC。在載體中,抗體重鏈和輕鏈構建體在哺乳動物細胞中的表達受CMV啟動子驅動。載體在重鏈或輕鏈的N末端含有合成的24氨基酸信號序列:MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA(SEQIDNO:99),以導引它們從哺乳動物細胞分泌。已經驗證該信號序列有效指導數百種哺乳動物蛋白質在293FreestyleTM細胞中的蛋白質分泌。寡核苷酸定向誘變法用來制備曲妥珠單抗中的Cys突變構建體。化學合成用于每個Cys突變位點的成對突變引物(表6)。有義和反義的突變引物對在PCR擴增之前混合。以pOG-曲妥珠單抗HC和pOG-曲妥珠單抗LC作為模板,通過使用PfuUltraII融合HSDNA聚合酶(Stratagene)進行PCR反應。在PCR反應后,將PCR產物在瓊脂糖凝膠上確認,并用DpnI處理,隨后在DH10b細胞中轉化(Klock等人,(2009)MethodsMolBiol.498:91-103)。表6.用來制備人IgG1的11個分別的Cys突變重鏈和輕鏈的突變引物的DNA序列。在一些情況下,在曲妥珠單抗的相同鏈中產生兩個或更多個突變。使用與上文相同的方法,但是使用pOG-曲妥珠單抗Cys突變質粒作為系列輪次誘變的模板,將寡核苷酸定向誘變法用來制備多重Cys突變構建體。通過DNA測序證實全部Cys突變構建體的序列。表7和表8中分別顯示HC和LCCys突變IgG1構建體的恒定區的編碼的蛋白質序列。人IgG1重鏈和人κ輕鏈中的氨基酸殘基依據EU編號體系(Edelman等人,(1969)ProcNatlAcadSciUSA,63:78-85)編號。表7.人IgG1重鏈中Cys突變構建體的恒定區的氨基酸序列。SEQIDNO:1是全長曲妥珠單抗的序列,其中恒定區加下劃線。額外的序列是人IgG1重鏈中的Cys突變構建體,僅顯示恒定區的序列。突變cys位置由加粗和加下劃線的文本顯示。表8.3個人κ輕鏈Cys突變構建體的恒定區的氨基酸序列。SEQIDNO:90是全長曲妥珠單抗的(人κ輕鏈)序列,其中恒定區加下劃線。額外的序列是人κ輕鏈的恒定區中Cys突變構建體的序列ID編號。實施例3.轉移曲妥珠單抗重鏈和輕鏈Cys突變至不同的抗體。對于曲妥珠單抗,用于接合藥物有效載荷的全部Cys突變均選擇位于其人IgG1重鏈和人κ輕鏈的恒定區中。因為抗體的恒定區在一級序列和結構方面高度保守,所以在曲妥珠單抗的背景下被確定為良好的有效載荷接合位點的Cys突變殘基也將充當其他抗體中的優選接合殘基。為了展示這些類屬綴合位點向其他抗體的可轉移性,我們克隆了一組Cys突變至抗cKIT抗體中。抗cKIT抗體是具有與cKIT蛋白結合的人IgG1重鏈和人κ輕鏈的抗體。將編碼抗cKIT抗體可變區的DNA克隆至三個選擇的pOG曲妥珠單抗-HCCys突變質粒構建體和兩個選擇的pOG曲妥珠單抗LCCys突變質粒構建體中(表9中列出的SEQIDNO)以替代質粒中曲妥珠單抗構建體的可變區,如實施例2中所述。作為結果,抗cKIT抗體和曲妥珠單抗的相應5個Cys構建體中的重鏈恒定區和輕鏈恒定區的氨基酸序列是相同的。后續實施例顯示,這些位點可以輕易地綴合。相反地,歸因于不同的人IgG同種型的一級序列和三級結構的高程度相似性,曲妥珠單抗κ輕鏈上的Cys突變可以輕易地轉移至含有不同的同種型重鏈的人抗體上的等同輕鏈。以相同方式,IgG1恒定區中確定的位點可以轉移至IgG2、IgG3和IgG4。表9.用于克隆抗cKIT抗體可變區的曲妥珠單抗Cys構建體的序列ID編號。曲妥珠單抗Cys構建體的序列IDNO:SEQIDNO:48SEQIDNO:61SEQIDNO:77SEQIDNO:129SEQIDNO:131實施例4.293FreestyleTM細胞中Cys突變抗體的表達和純化。通過綴合至賴氨酸殘基或部分還原的天然二硫鍵所產生的抗體綴合物經常以藥物對抗體比(DAR)在3和4之間為特征。Cys工程化抗體更一般以DAR是2為特征。對于某些適應癥,可能想要產生DAR較高的ADC,這原則上可以通過在抗體中引入多個Cys突變實現。隨著Cys突變數目增加,這類突變在ADC制備期間干擾需要的再氧化過程并且因此產生不均一產物的可能性也增加。在這項研究中,確定了具有良好再氧化行為的大量重鏈和輕鏈單位點Cys突變。為了顯示可以組合幾種綴合位點用于產生DAR大于2的ADC,在293FreestyleTM細胞中共表達曲妥珠單抗和抗cKIT抗體(表10)的輕鏈和重鏈的幾個單位點Cys構建體。表10.產生DAR為4或6的ADC的Cys工程化抗體恒定區的序列ID通過使用如先前描述的瞬時轉染方法(Meissner等人,BiotechnolBioeng.75:197-203(2001))共轉染重鏈質粒和輕鏈質粒,在293FreestyleTM細胞中表達Cys突變抗體。使用Qiagen質粒制備試劑盒根據制造商的方案,制備共轉染中使用的DNA質粒。將293FreestyleTM細胞在37℃在5%CO2下在FreestyleTM表達培養基(Invitrogen)中懸浮培養。在轉染前三天,將細胞分成0.25x106個細胞/ml置于新鮮的培養基中。在轉染當日,細胞密度一般達到1.5-2x106個細胞/ml。使用PEI方法,將細胞用比率1:1的重鏈質粒和輕鏈質粒混合物轉染(Meissner等人,BiotechnolBioeng.75:197-203(2001))。進一步培養轉染的細胞5天。通過將培養物以2000g離心20分鐘并通過0.2微米濾器過濾,從培養物收獲培養基。使用蛋白A-瓊脂糖凝膠TM(GEHealthcareLifeSciences),從過濾的培養基純化表達的抗體。將抗體IgG通過洗脫緩沖液(pH3.0)從蛋白A-瓊脂糖凝膠TM柱洗脫并立即用1MTris-HCl(pH8.0)中和,隨后將緩沖液交換成PBS。瞬時轉染的293FreestyleTM中曲妥珠單抗和抗cKITCys突變抗體的表達水平類似于野生型抗體,產率為12-25mg/L,表明選擇的位點中單點突變至三點突變并未顯著地改變細胞分泌裝置對表達抗體的滯留。使用非還原性SDSPAGE分析純化的Cys突變抗體表明Cys突變抗體未形成由工程化半胱氨酸通過二硫鍵連接的寡聚體。實施例5.Cys突變抗體的還原、再氧化和與各種有效載荷的綴合。因為抗體生物合成期間一般通過加合物(二硫化物)如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修飾哺乳動物細胞中表達的抗體中的工程化Cys(Chen,2009),初始表達的產物中的修飾Cys對巰基反應性試劑如如馬來酰亞胺基或溴乙酰胺基或碘乙酰胺基無反應。為了在表達后綴合工程化的半胱氨酸,需要通過還原這些二硫化物移除谷胱甘肽或半胱氨酸加合物,這通常導致表達的蛋白質中的全部二硫鍵還原。這可以通過以下方式完成:首先使抗體暴露于還原劑如二硫蘇糖醇(DTT),隨后進行允許抗體的全部天然二硫鍵再氧化以恢復和/或穩定功能抗體結構的操作。因此,為了還原全部天然二硫鍵和在工程化半胱氨酸殘基的半胱氨酸或GSH加合物之間結合的二硫鍵,將新鮮制備的DTT添加至曲妥珠單抗和抗cKIT抗體的純化Cys突變體至終濃度10或20mMDTT。抗體在37℃與DTT溫育1小時后,將混合物對PBS透析3天,每天交換緩沖液以移除DTT并再氧化天然二硫鍵。通過能夠使完整IgG與單個重鏈和輕鏈分子分離的反相HPLC,監測再氧化過程。在加熱到80℃的PRLP-S4000A柱(50mmx2.1mm,Agilent)上綴合反應混合物進行分析,并且通過含有0.1%TFA的水中30-60%乙腈的線性梯度以流速1.5ml/分鐘實施柱洗脫。在280nm監測從柱洗脫蛋白質的過程。允許透析繼續直至再氧化完成。再氧化恢復了鏈內二硫鍵,而透析允許透析掉與新引入的半胱氨酸連接的半胱氨酸和谷胱甘肽。在再氧化后,抗體為綴合做好準備。一般按比率1.5:1、2:1或10:1添加含有馬來酰亞胺的化合物至PBS緩沖液(pH7.2)中的再氧化抗體。實施溫育1小時至24小時。通過大多數情況下能夠使綴合的抗體與未綴合的抗體分離的反相HPLC監測綴合過程。在280nm、254nm和215nm波長依據UV吸光度監測從柱洗脫蛋白質的過程。通過反相HPLC分析綴合混合物時,許多Cys位點生成均一的綴合產物,如均一、單峰洗脫圖所提示,而一些Cys位點生成不均一的綴合產物或僅顯示匹配未綴合抗體的峰。上文描述的操作過程涉及天然二硫鍵的還原和再氧化以及還原在工程化半胱氨酸殘基的半胱氨酸和GSH加合物之間的鍵。在再氧化過程期間,工程化的半胱氨酸殘基可以通過二硫鍵改組過程干擾再形成正確的天然二硫鍵。這可能導致在工程化的半胱氨酸和天然半胱氨酸殘基之間或在不正確匹配的天然二硫鍵之間形成錯配的二硫鍵。這類錯配的二硫鍵可能影響在反相HPLC柱上保留抗體。除了所需的工程化的半胱氨酸之外,錯配過程還可以產生未配對的半胱氨酸殘基。馬來酰亞胺-化合物與抗體上的不同位置接合差異地影響保留時間(參見下文對均一綴合的ADC的討論)。此外,除與工程化半胱氨酸殘基的目的綴合之外,不完全的再氧化還將留下帶天然半胱氨酸殘基的抗體,其將與馬來酰亞胺化合物反應。阻礙正確和完全形成天然二硫鍵的任何過程將導致與Cys反應性化合物綴合時復雜的HPLC特性。雖然選擇位點是表面暴露的,但是如果在抗體的一些或全部構象中引入的游離半胱氨酸是馬來酰亞胺-藥物不可及的或否則不能有效地與馬來酰亞胺-藥物相互作用,則終產物中也可能存在不均一性。如果游離半胱氨酸是無反應性的,最終的DAR將會低并且產物可能是完全修飾、部分修飾和未修飾的Cys突變抗體的不均一混合物。在引入兩個或更多個游離半胱氨酸的抗體情況下,如果藥物在一個位點的接合干擾(即因空間位阻)第二藥物在第二位點的結合作用,則能引入額外的復雜性。這種競爭將會導致較低的最終DAR和不均一產物。如果兩個引入的半胱氨酸非常靠近并且恰當地取向,則隨后它們還可以形成非天然的二硫鍵,而不是形成兩個游離半胱氨酸。在這種情況下,抗體將對馬來酰亞胺-藥物化合物無反應性并且結果將是較低的最終DAR或甚至均勻的未綴合產物。如通過未純化的反應混合物的RP-HPLC依據UV吸收所測量的均勻ADC產率取決于Cys突變以及所用的接頭-有效載荷化合物而變動。使用上文描述的還原/再氧化方案和綴合程序,對于這類小型試驗綴合,本文描述的45種多重Cys突變曲妥珠單抗或抗cKIT抗體中有26種產生最終DAR可接受的均一綴合產物(對于雙重Cys突變,DAR為3.4-4.4;對于三重Cys突變,為5.1-6.0,表11)。當制備ADC時,這些Cys位點和藥物組合是有利的。表11.從RP-HPLC分析計算的并通過LCMS驗證的由上述方法與多種藥物綴合的45種多重Cys突變抗體樣品中完整、還原、去糖基化抗體鏈的DAR。在多種測定法中詳細分析表11中45份ADC樣品的子集:差異性掃描熒光測定(DSF)用來測量熱穩定性。分析性大小排阻色譜(AnSEC)和多角度光散射(MALS)用來測量聚集。通過細胞生存力測定法測量體外抗原依賴性細胞殺傷效力并且在小鼠中測量藥代動力學行為。通常,多重Cys突變ADC顯示類似于單個Cys突變ADC的熱穩定性。ADC優勢地為單體,如通過分析性大小排阻色譜所測定。實施例6.與多種化合物綴合的抗cKIT和曲妥珠單抗Cys突變ADC的制備。使用如上文所述的幾種有效載荷,制備曲妥珠單抗和抗cKITcys突變抗體HC-E152C-S375C和HC-K360C-LC-K107C的抗體藥物綴合物。表12中顯示這些ADC的一些特性。如實施例7中所述測試這些ADC的體外細胞殺傷效力并且在表13和表14中匯總結果。如實施例8中所述在未用過藥的小鼠中對化合物進行進一步的藥代動力學(PK)研究。表15和表16中匯總PK特性。表12.與多種化合物綴合的抗Her2Cys突變ADC的特性。a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的名稱組成。b根據反相HPLC的藥物對抗體比率。c通過分析性大小排阻色譜測量的聚集;包括二聚體種類和低聚體種類。BLQ=低于定量限。實施例7.測量Cys突變ADC的體外細胞殺傷效力的細胞增殖測定法天然表達靶抗原的細胞或經工程化以表達靶抗原的細胞系往往用來分析ADC的活性和效力。為了在體外評價曲妥珠單抗ADC的細胞殺傷效力,使用兩種工程化的細胞系,即MDA-MB231克隆16和克隆40、及HCC1954細胞(GazdarA,RabinovskyR,YefenofE,GordonB,VitettaES.BreastCancerResTreat.(2000)61:217-228)。MDA-MB231克隆16細胞穩定表達高拷貝數(約5x105個拷貝/細胞)的重組人Her2,而克隆40表達低拷貝數(約5x103個拷貝/細胞)的人Her2。HCC1954細胞在表面中內源表達高水平(約5x105個拷貝/細胞)的人Her2。為了測定抗cKITADC的細胞殺傷效力,使用H526、KU812、CMK11-5和Jurkat細胞。雖然CMK11-5、H526和KU812細胞在細胞表面表達針對抗cKIT抗體的高水平抗原,但在Jurkat細胞中沒有檢測到抗原表達。抗原依賴性細胞毒效應應當僅殺傷在細胞表面表達足量抗原的細胞并且不殺傷缺少該抗原的細胞。在細胞與多種濃度的ADC溫育5天后,用Cell-Titer-GloTM(Promega)實施細胞增殖測定法(Riss等人,(2004)AssayDrugDevTechnol.2:51-62)。在一些研究中,基于細胞的測定法是高通量的并且在自動化系統中實施(Melnick等人,(2006)ProcNatlAcadSciUSA.103:3153-3158)。曲妥珠單抗Cys突變ADC特異性殺傷表達Her2的MDA-MB231克隆16和HCC1954,但是不殺傷以很低水平表達Her2的MDA-MB231克隆40細胞(表13)。用化合物F制備的曲妥珠單抗ADC也殺傷JimT1細胞。曲妥珠單抗Cys突變ADC的IC50因細胞類型和取決于所用的化合物而變動(表13)。類似地,抗cKITCys突變ADC在細胞增殖測定法中顯示抗原依賴性細胞殺傷。抗cKITCys-藥物ADC殺傷表達抗原的NCI-H526、KU812和CMK115細胞,但是不殺傷抗原陰性的Jurkat細胞。抗cKITADC的IC50隨所用的細胞類型和化合物變動(表14)。表13.與多種化合物綴合的抗Her2ADC的體外細胞殺傷效力。a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的名稱組成。b測定法中使用的最高濃度是6.7E-02μM。因此IC50值6.7E-02μM指ADC在測定法中無活性。表14.與多種化合物綴合的抗cKITADC的體外細胞殺傷活性。a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的名稱組成。b測定法中使用的最高濃度是6.7E-02μM。因此IC50值6.7E-02μM指ADC在測定法中無活性。實施例8.Cys突變ADC的藥代動力學研究已經證實,長血清半壽期對ADC的體內高效力至關重要(Hamblett等人,“Effectsofdrugloadingontheantitumoractivityofamonoclonalantibodydrugconjugate,”ClinCancerRes.,10:7063-7070(2004);Alley等人,BioconjugChem.19:759-765(2008))。通常疏水性藥物有效載荷與抗體的接合可以顯著地影響抗體的特性,并且這可以導致ADC在體內快速清除(Hamblett等人,2004)和體內效力低劣。為了評價不同綴合位點在體內對清除多重Cys-藥物ADC的影響,在非攜瘤小鼠中實施藥代動力學研究。為了檢測鼠血漿中含有藥物的ADC,生成抗MMAF抗體。使用抗人IgG(抗hIgG)捕獲來自血漿的人IgG分子及使用抗人IgG(抗hIgG)抗體和抗MMAF抗體在兩個獨立測定法中生成信號,在GyrosTM平臺上開發了檢測ADC的ELISA測定法。兩種ELISA測定法分別測量抗體的和“完整”ADC的血清濃度,如下文更詳細地討論。對每組三只小鼠按1mg/kg施用單次劑量的CysADC。在3周期間采集8份血漿樣品并且通過如上文所述的ELISA測定。使用與注入小鼠相同的材料,分別生成每種ADC的標準曲線。如通過抗hIgGELISA所測量,Cys突變ADC(表15和表16)顯示與未綴合的野生型抗體相似的藥代動力學曲線,這表明突變和與這些位點綴合的有效載荷未顯著地影響抗體的清除。為了確定小鼠中循環期間各個Cys位點處馬來酰亞胺有效載荷和抗體之間的鍵的化學穩定性,對于用化合物F制備的ADC,將通過抗MMAFELISA測定法所測量的和通過抗hIgGELISA測定法所測量的ADC濃度彼此比較,其輕易地用抗MMAFELISA檢測到(表15和表16)。對于這些ADC,從抗MMAF(AUC-MMAF)和抗hIgGELISA(AUC-IgG)的量值計算血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)值。相似分析的先前結果提示不確定性>25%。由于如果不出現藥物損耗,則比率應當保持接近1,比率>0.7表示在測量的準確度范圍內,對采用化合物F制備的曲妥珠單抗ADC和抗cKITADC在小鼠中施用后幾乎觀察不到藥物損耗(表15和表16)。為了進一步理解ADC藥物有效載荷的停留,尤其通過抗MMAFELISA不可檢出的有效載荷(如化合物A-E),通過免疫沉淀質譜法(IP-MS)分析樣品。特別地,從通過末梢采血采集的小鼠血清親和純化ADC并且通過MS分析法分析與ADC接合的藥物有效載荷。在常見過程中,將200μl血漿用等量含有10mMEDTA的PBS稀釋。向稀釋物添加10μl親和樹脂(IgG選擇瓊脂糖凝膠6Fastflow;GEHealthcare17-0969-01;50%漿液)。通過施加輕微攪拌以避免樹脂沉降,樹脂與稀釋的血漿樣品在室溫溫育1小時。隨后將樹脂濾除并用200μlPBS洗滌2次。為了使抗體去糖基化,將10μlPBS稀釋的10μlPNGaseF(1mg/mL,1/2xTBSpH7.4,2.5mMEDTA,50%甘油)添加至樹脂并將混合物在37℃溫育2-3小時。通過用200μlPBS洗滌親和樹脂2次移除PNGaseF后,通過添加20μl1%甲酸并濾除樹脂從親和樹脂洗脫樣品2次。合并的洗脫物用20μl6M鹽酸胍和5μl還原緩沖液(0.66MTCEP,3.3M乙酸銨,pH5)稀釋。為了有效還原抗體,將樣品在分析前在室溫溫育至少30分鐘。用AgilentTechnologies6550-iFunnelQTOFMS/Agilent1260HPLC系統進行LCMS。用PLRS柱(8μm,2.1x50mm,Agilent)以流速0.5ml/分鐘在80℃,將標準反相色譜用于樣品脫鹽。使用含有20%乙腈至含有60%乙腈的0.1%甲酸的線性梯度,實施洗脫6分鐘。Agilent定性分析法用于處理圖譜記錄結果和圖譜反卷積。為了分析,將圖譜記錄結果在涵蓋洗脫全部相關種類的時間區間范圍內加總。加總的圖譜按電荷狀態解卷積并且記錄解卷積的圖譜的圖像。提取峰的強度值用于可歸屬種類。基于從所分析抗體序列計算的質量值和含藥物分子的綴合物的預期質量位移,進行DAR狀態和片段種類的歸屬。使用全部DAR狀態跨某分布的相對峰高度計算平均DAR。平均抗體DAR計算為來自平均2條輕鏈和平均2條重鏈的DAR的總和。從小鼠循環三周后的血漿純化的ADC的平均DAR(如通過MS所測量)與原始ADC制備物中的DAR比較。從兩種DAR的比率(從小鼠血漿分離的ADC的DAR除以原始ADC制備物的DAR)算出“有效載荷保留”(表15和表16),并且代表在三周后小鼠循環中的ADC上留下的有效載荷的百分數。如通過MS所測量的ADC的有效載荷保留大體上與通過前述ELISA測定法對采用化合物F制備的ADC獲得的結果一致(表15和表16)。數據顯示在3周時間范圍內在小鼠中循環期間本文所述的CysADC的藥物-抗體連接的高度穩定性。表15.與多種化合物綴合的抗cKITCys突變ADC的藥代動力學特性。a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的名稱組成。b由抗MMAFELISA讀出的AUC。c由抗IgGELISA讀出的AUC。d在小鼠中3周循環后如通過IP-MS所測量的有效載荷保留。n.a:不適用。抗MMAFELISA未檢出有效載荷。表16.與多種化合物綴合的抗Her2Cys突變ADC的藥代動力學特性。a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的名稱組成。b由抗MMAFELISA讀出的AUC。c由抗IgGELISA讀出的AUC。d在小鼠中3周循環后如通過IP-MS所測量的有效載荷保留。n.a:不適用。抗MMAFELISA未檢出有效載荷。實施例9.制備與Eg5抑制劑綴合的曲妥珠單抗和抗cKITADC。已經報道工程化的CysADC在小鼠和大鼠動物模型中比通過綴合至部分還原的天然二硫鍵或通過天然賴氨酸殘基產生的ADC耐受更好(Junutula等人,(2008)NatBiotechnol.26(8):925-932)。為了評價通過工程化Cys抗體綴合的ADC和與部分還原的天然二硫鍵綴合的ADC之間的體內效力差異(Doronina等人,(2003)Nat.Biotechnol.21,778-784),如實施例4中所述,在293FreestyleTM細胞中表達并且純化曲妥珠單抗和抗cKIT抗體的Cys突變體并且如實施例5中所述制備ADC。將表5中的Eg5接頭-有效載荷化合物A綴合至抗體抗cKIT-HC-E152C-S375C雙突變體(也稱作cKitB,免疫綴合物稱作cKitB-CmpdA或cKitB-5B)和抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C雙突變體(也稱作cKitC,免疫綴合物稱作cKitC-CmpdA或cKitC-5B)以及野生型抗cKIT抗體(免疫綴合物也稱作cKitA-CmpdA或cKitA-5B)。(殘基編號是EU編號)。表17中闡述抗體恒定區的序列。表17:抗體的野生型恒定區和cys置換型恒定區的序列信息。具體而言,通過將5mg/ml抗體與0.35mM化合物A在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中溫育1小時,使再氧化的抗體與化合物A綴合。通過RP-HPLC監測反應的完成度并且對于cKitB綴合物和cKitC綴合物,分別獲得3.9和4.0的DAR。通過MS進一步驗證DAR量值。顯示ADC在體外細胞殺傷測定法中強效并且在非攜瘤小鼠中具有與未綴合的抗體相似的藥代動力學特性。在2步驟方法中如下制備化合物A與cKitA的天然二硫鍵綴合的ADC。將含有2mMEDTA的PBS中濃度為5-10mg/ml的抗體首先在37℃用50mM巰基乙胺(作為固體添加)部分還原1小時。在脫鹽并添加1%w/vPS-20去垢劑后,部分還原的抗體(1-2mg/ml)在4℃與按每10mg抗體為0.5-1mg化合物A的量反應過夜,其中所述的化合物A以10mg/ml溶解于DMSO中。通過蛋白A色譜純化ADC。用PBS基線洗滌后,將綴合物用50mM檸檬酸鹽,pH2.7,140mMNaCl洗脫,中和并無菌過濾。平均DAR是3.2。表18:與化合物A綴合的三種抗cKITADC的特性ADC名稱aDARb聚集c抗cKIT-化合物A(cKitA-5B)3.20.8%抗cKIT-HC-E152C-S375C–化合物A(cKitB-5B)3.91.5%抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物A(cKitC-5B)4.03.2%a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的名稱組成。b根據反相HPLC或HIC的藥物對抗體比率。c通過分析性大小排阻色譜測量的聚集;包括二聚體種類和低聚體種類。類似地,制備具有有效載荷與具有半胱氨酸置換的抗cKIT和曲妥珠單抗突變型抗體的以下組合的免疫綴合物并且依據相同方法表征。注意,如果對每個抗體復合物而言4個添加的半胱氨酸殘基均與有效載荷綴合,則工程化抗體一致地提供接近預期載量4的DAR(表18和表19):表19.具有Eg5抑制劑有效載荷的抗cKIT和曲妥珠單抗Cys突變ADC的總結。a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的名稱組成。b根據反相HPLC的藥物對抗體比率。c通過分析性大小排阻色譜測量聚集;包括二聚體種類和低聚體種類。實施例10.用Eg5抑制性有效載荷制備的ADC的體外效力和體內效力。從表5中顯示的每種Eg5抑制性接頭-有效載荷化合物與抗cKIT抗體(也稱作cKitA)和HC-E152C-S375CCys-突變形式的抗cKIT抗體(cKitB)綴合來制備免疫綴合物。上表17中顯示抗cKIT(cKitA)野生型和Cys置換型突變體的恒定區。通過上文描述的方法對每種有效載荷制備了藥物對抗體比率(DAR)在3.5和4.0之間的綴合物。在預計被針對cKit的抗體識別的細胞系中測試免疫綴合物的活性。圖2顯示包含化合物A、B和C的、與HC-E152C-S375CCys置換型cKIT免疫綴合的免疫綴合物抑制細胞生長。Jurkat細胞是cKIT陰性細胞系,并且對三種抗cKIT(cKitA)免疫綴合物不敏感。然而,cKIT陽性細胞系H526細胞的增殖受全部三種抗cKIT(cKitA)綴合物抑制,IC50范圍從100pM至500pM。選擇H526細胞系作為體內效力研究的異種移植模型。體內異體移植腫瘤模型模擬在人類中觀察到的生物學活性并且由移植相關和充分表征的人原發腫瘤或腫瘤細胞系入免疫缺陷性裸鼠組成。用抗癌癥試劑治療腫瘤異種移植小鼠的研究已經提供了關于所測試試劑的體內效力的寶貴信息(Sausville和Burger,(2006)CancerRes.66:3351-3354)。全部動物研究均根據實驗動物護理與使用指南實施(NIH出版;NationalAcademyPress,第8版,2001)。將H526細胞在nu/nu小鼠中皮下植入(Morton和Houghton,NatProtoc.2007;2:247-250)。在腫瘤尺寸達到約200mm3后,將ADC在單次給藥中通過靜脈內注射施用至小鼠中。在注射ADC后定期測量腫瘤生長。圖3中顯示這種體內效力研究的實施例。圖3總結了用半胱氨酸工程化的抗cKIT抗體制備的兩種ADC即抗cKIT-HC-E152C-S375C–化合物A(cKitB-5B)和抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物A(cKitC-5B)的活性,所述ADC在劑量5mg/kg(圖3A)和10mg/kg(圖3B)抑制小鼠中H526腫瘤異種移植物生長。因為DAR較低,用野生型抗體通過部分還原制備的抗cKIT-化合物A(cKitA-5B)以較高劑量施用以匹配摩爾有效載荷劑量。每個組就測試的每種ADC而言注射6只小鼠。在任何組中未觀察到與ADC治療相關的明顯體重減輕,提示全身毒性低。化合物A的半胱氨酸工程化抗cKITADC比通過部分還原野生型抗cKIT抗體-化合物A制備的ADC(cKitA-5B)更有活性。因此,盡管Eg5抑制劑與多種cKIT抗體(包括未修飾的一種cKit抗體)的免疫綴合物均有活性,這表明了工程化引入新半胱氨酸殘基至恒定區中并且使用新半胱氨酸殘基作為有效載荷/接頭基團接合點的蛋白質能夠提供改善的免疫綴合物。在鼠異種移植模型中也測試了Cys置換型cKitA免疫綴合物。兩種Cys置換型免疫綴合物均顯示比非置換型免疫綴合物更大的活性,如通過植入后腫瘤體積所測量的那樣。實施例11:與Eg5抑制劑綴合的抗Her2ADC在小鼠Her2陽性MDA-MB-231克隆16乳腺癌模型中的劑量依賴性體內效力在Her2陽性MDA-MB-231HER2克隆16乳腺癌異種移植模型中評價通過曲妥珠單抗-HC-E152C-S375CCys突變抗體與Eg5抑制劑化合物A綴合所制備的抗Her2ADC曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A的抗腫瘤效力。對雌性無胸腺Foxn1裸小鼠皮下植入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中含有5x106個細胞的50%MatrigelTM(BDBiosciences)。含有細胞的懸液的總注射體積是200μl。植入腫瘤細胞后13天腫瘤平均體積約220mm3時,小鼠入選于研究中。在隨機分配到8個組之一(n=5只/組)后,對小鼠施用PBS、非特異性同種型對照-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)或曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A(2.5、5或10mg/kg)的單次靜脈內劑量。每周至少二次測量腫瘤體積(圖4)和體重。在腫瘤細胞植入后第40日,用單次施用2.5mg/kg曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A處理的小鼠出現了與運載體對照相比(T/C)顯示腫瘤體積平均變化百分數8.22%的腫瘤。用單次施用5mg/kg和10mg/kg曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A處理的小鼠具有分別顯示體積消退74.14%和76.35%的腫瘤,二者均與僅運載體和非特異性同種型ADC對照有統計差異(p<0.05,ANOVA,Tukey事后檢驗)。各處理在全部劑量水平均耐受良好。表20:在第40日小鼠的Her2陽性MDA-MB-231克隆16乳腺癌模型中TBS-HC-E152C-S375C-化合物A的劑量反應。實施例12:與Eg5抑制劑綴合的抗Her2ADC在Her2陽性MDA-MB-453人乳腺癌異種移植小鼠模型中的體內效力也在Her2陽性MDA-MB-453人乳腺癌異種移植模型中評價抗Her2曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物AADC的抗腫瘤效力。對雌性SCID棕灰色小鼠皮下植入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中含有5x106個細胞的50%MatrigelTM(BDBiosciences)。含有細胞的懸液的總注射體積是200μl。植入腫瘤細胞后7天腫瘤體積為大約168mm3–216mm3時,小鼠入選于研究中。在隨機分配到4個組之一(n=6只/組)后,對小鼠施用PBS、非特異性同種型對照-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)或曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)的單次靜脈內劑量。每周至少二次測量腫瘤體積(圖5)和體重。在植入后第45日,用曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)處理的小鼠具有分別顯示體積消退71.2%的腫瘤,這與僅運載體和非特異性同種型ADC對照有統計差異(p<0.05,ANOVA,Tukey事后檢驗)。各處理在全部劑量水平均耐受良好。表21:曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A在10mg/kg時在第45日Her2陽性MDA-MB-453人乳腺癌異種移植小鼠模型中的ADC效力。實施例13:與Eg5抑制劑綴合的抗Her2ADC在Her2陽性HCC1954人乳腺癌異種移植小鼠模型中的體內效力進一步在Her2陽性HCC1954乳腺癌異種移植模型中評價了抗Her2曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物AADC的抗腫瘤效力。對雌性無胸腺Foxn1裸小鼠皮下植入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中含有5x106個細胞的50%MatrigelTM(BDBiosciences)。含有細胞的懸液的總注射體積是200μl。植入后11天在腫瘤體積為大約148mm3–216mm3時,小鼠入選于研究中。在隨機分配到4個組之一(n=6只/組)后,對小鼠施用PBS、非特異性同種型對照-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)或曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)的單次靜脈內劑量。每周至少二次測量腫瘤體積(圖6)和體重。在植入后第45日,用曲妥珠單抗-HC-E152C-S372C-化合物A(10mg/kg)處理的小鼠具有分別顯示體積消退63.0%的腫瘤,這與僅運載體和非特異性同種型ADC對照有統計差異(p<0.05,ANOVA,Tukey事后檢驗)。各處理在全部劑量水平均耐受良好。表22:曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A在10mg/kg時在第45日Her2陽性HCC1954人乳腺癌異種移植小鼠模型中的ADC效力。實施例14:比較抗cKITCys突變ADC與通過部分還原非工程化抗體制備的ADC的體內效力研究。在H526異種移植小鼠模型中比較兩種抗cKITADC:抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F和抗cKIT-化合物F的體內效力(圖7)。兩種ADC用相同有效載荷即化合物F(表5)制備,使用兩個不同方法與不同Cys位點綴合。如實施例5中所述,用Cys突變抗體制備綴合物抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F,其中化合物F與工程化的Cys殘基(HC-E152C和HC-S375C)綴合。通過應用實施例9中描述的部分還原方法對野生型抗cKIT抗體制備綴合物抗cKIT-化合物F,其中化合物F與天然Cys殘基綴合。抗cKIT-化合物F具有比抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F(DAR3.9,0.6%聚集)略高的DAR(DAR4.6)和聚集(2.9%)。非攜瘤小鼠中的藥代動力學研究顯示,在小鼠中三周循環期間兩種ADC以非常不同的程度保留相同的有效載荷:如通過ELISA(圖8A,圖8B)所示和如通過IP-MS所測定(參見實施例8),抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F顯示比抗cKIT-化合物F(20%)好得多的有效載荷保留(56%)。在H526異種移植模型中,相同劑量的抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F比抗cKIT-化合物F更有效地抑制腫瘤(圖7)。在H526細胞中不表達其抗原的抗Her2-HC-E152C-S375C-化合物F(特性參見表12)作為對照納入并且不顯示任何腫瘤抑制活性。實施例15比較在不同位點處與化合物F和化合物A綴合的抗cKITCys突變ADC的體內效力研究在另一個實施例中,在H526異種移植模型中比較抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F、抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物F、抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物A、和抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物AADC的體內效力(圖9)。使用如實施例7中所述的兩種不同抗體,使兩種有效載荷-化合物F和化合物A與不同Cys位點綴合。表12中總結了ADC的特性。對于全部四種綴合物,測量的DAR接近于理論DAR4,并且對所得的ADC幾乎觀察不到聚集(表12)。將單次劑量3.5mg/kg的ADC靜脈內注射至攜帶H526腫瘤的動物中。圖9中顯示H526異種移植模型中腫瘤體積測量的結果。在這個模型中,相同劑量的抗cKIT-化合物FADC比采用化合物A制備的ADC更有效地抑制腫瘤。與不同的兩組Cys突變體綴合的ADC之間不存在腫瘤抑制活性的統計顯著差異。實施例16與化合物G綴合的曲妥珠單抗ADC的疏水性為了進一步優化Cys突變體和突變體組合的選擇以制備DAR為2、4、6和更高的ADC,就疏水性方面分析曲妥珠單抗Cys突變ADC的特性。如上文所述制備與化合物G(MC-MMAF)綴合的Cys突變ADC。如所述那樣實驗測定的最終DAR通常接近于目標并且在下表23中列出。通過疏水相互作用色譜如下測量這些ADC的疏水性。使用安裝在Agilent1260LC系統(SantaClara,CA,美國)上的TosohBioscience(KingofPrussia,PA,USA)TSK凝膠丁基-NPR柱(100mm×4.6mm,2.5μm),采集曲妥珠單抗Cys-MMAFADC的分析性HIC數據。該方法由緩沖液A(20mMHis-HCl,1.5M硫酸銨,pH6.0)和緩沖劑B(20mMHis-HCl,15%異丙醇,pH6.0)的雙元梯度組成。通過用0.5體積的3M硫酸銨稀釋大約20μg抗體(PBS)制備樣品。該梯度由如下組成:在100%A維持5分鐘,隨后是經30分鐘的0至100%B線性梯度,經5分鐘返回至100%A,并在初始條件最終再平衡10分鐘,之后下一次進樣。通過在280nm的UV吸收監測分離過程并使用Chromelion軟件(Dionex)分析。出人意料地,觀察到DAR4ADC的保留時間大幅度變動,盡管唯一差異是化合物G的接合位點。此外,保留時間的范圍基本上與對納入用于比較的DAR2ADC所觀察到的范圍重疊(表23)。HIC基于疏水性分離分子。全部DAR2ADC均具有大于未綴合抗體(保留時間=45分鐘)的HIC保留時間,其中疏水性藥物分子如化合物G與抗體接合時,預計出現前述情況。但是,在不同位點接合有效載荷會在不同程度上增加ADC的疏水性。表23.DAR和DAR=2、4或6的曲妥珠單抗Cys-化合物GADC的分析性HIC保留時間。出乎意料大的保留時間差異可以從觀察抗體結構上接合位點的位置理性得到合理說明:如果藥物有效載荷在抗體外部暴露的位點處(例如在測量到幾乎19分鐘保留時間的HC-P247C處)接合,則保留時間較高。相反,如果有效載荷在內部位點(如可變結構域和CH1結構域之間形成的空穴(例如,HC-E152C)或抗體CH2結構域和CH3結構域之間的大開口(例如,HC-P396C))處接合,則HIC保留時間低于16分鐘,因為部分地隔絕了有效載荷與溶劑和HIC柱相互作用。同樣,對于包括兩個相對內部的位點(例如HC-E152C-P396C和HC-E152C-S375C)的DAR4ADC,保留時間仍然短,在15.5-16.5分鐘級別,而包括非常暴露的位點(例如,LC-K107C-HC-K360C)的DAR4ADC能顯示大于21分鐘的保留時間。通常認為降低蛋白質藥物(包括ADC)的疏水性有益,因為這可以減少聚集及從循環中清除。在使它們與溶劑相互作用隔絕并且當藥物接合時接合過程最小程度地增加抗體疏水性的位點處綴合藥物有效載荷應當是有益的,與綴合化學和有效載荷類別無關。當每個抗體接合4、6或更多藥物時或當特別地使用疏水性有效載荷時,仔細選擇導致疏水性變化最少的接合位點可能是特別有益的。實施例17.與多種化合物綴合的抗Her2Cys突變ADC的疏水性實施例7中制備的曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C和曲妥珠單抗-HC-K360C-LC-K107CADC的子集(特性參見表12)還通過如下文詳述的疏水相互作用色譜表征(表24)。與暴露的Cys殘基組合(位置HC-K360C-LC-K107C)綴合的ADC比藥物與HC-E152C-S375C抗體接合的ADC更疏水。與細胞毒性肽化合物F相比,對Eg5抑制劑有效載荷化合物A和化合物C的影響更明顯。如實施例16中討論,在使藥物與溶劑相互作用隔絕的位點如HC-E152C-S375C處接合藥物似乎增加抗體疏水性的程度比在更暴露于溶劑的位置如HC-K360C和LC-K107C處接合時低。盡管有益于許多應用,特別有益于接合疏水性有效載荷,在更暴露于溶劑的位置處綴合有效載荷將在其他應用中具有有益的實用性。表24:與不同有效載荷綴合的各種Cys突變抗Her2-ADC的疏水性評分ADC名稱a疏水性評分b曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物F0.91曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物A0.90曲妥珠單抗-HC-E152C-S375C-化合物C0.87曲妥珠單抗-HC-K360C-LC-K107C-化合物F0.51曲妥珠單抗-HC-K360C-LC-K107C-化合物A0.33曲妥珠單抗-HC-K360C-LC-K107C-化合物C0.31a名稱由突變抗體的描述和化學綴合步驟中所用化合物的描述組成。b疏水相互作用色譜(HIC)測量:在連接至Agilent1260InfinityLC系統(AgilentTechnologies)的TSK凝膠丁基-NPR柱(4.6mmIDx35mmL,TosohBioscience)上實施不同種類的分離。該系統首先用流動相B(17mMHis/HCl,pH6.0,含有15%異丙醇)平衡和隨后用流動相A(20mMHis/HClpH6.0,含有1.5M(NH4)2SO4)平衡直至達到穩定基線。將在4℃貯存于自動進樣器中的10μg至50μg樣品進樣并且以流速1.0mL/分鐘在恒定溫度25℃分離。在30個柱體積內使用從100%流動相A至100%流動相B的梯度實現不同疏水性的各種類的洗脫。在280nm處檢測洗脫種類并且最大峰的保留時間用來計算疏水性指數。相對于疏水性確定的三種參考分子的線性回歸,測定這種指數(保留時間對疏水性指數作圖)。這種程序允許補償試驗間潛在變異性和因柱批次之間差異所致的變異并且與精確的絕對硫酸銨濃度無關。疏水性指數越低(=從HIC洗脫晚),分子的疏水性越高并且在生產或儲存原料藥和藥品期間不利行為的風險越高。可以理解本文所述的實施例和實施方案的目的僅在于說明,并且在其影響下的多種修改或改變將會啟發本領域技術人員并且將納入本申請的精神與權限范圍內和所附權利要求書的范圍內。當前第1頁1 2 3 
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