本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及用于增強抗原免疫應答的佐劑，該佐劑包含鋁膠、左旋咪唑或其衍生物，還包括聚丙烯酸鹽，用于疫苗組合物和蛋白中，但不在受試者中產生毒性或不想要的副反應。
背景技術：
細菌、病毒及寄生蟲感染廣泛分布于人和動物，由這些感染劑引起的疾病通常對抗微生物學療法具有抗性，使得無有效的治療方法。因此，愈來愈多人使用疫苗學方法以控制傳染，具體是通過用活的病原體、經滅活的病原體或其產物、或經基因工程手段將病原體蛋白質亞基制備成疫苗進行疫苗接種來誘導特異性免疫。然而，當單獨給予某些抗原時不對免疫系統產生足夠的刺激作用。因此，必須加入能夠使機體免疫應答增加的免疫佐劑來獲得足夠量的保護性抗體。
免疫佐劑是疫苗必不可少的組成部分，不僅能影響機體對疫苗免疫應答的強度，而且能針對特定病原體誘導最有效的免疫應答類型(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,et al.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416)。目前，研究的免疫佐劑類型很多，如鋁膠、油佐劑、弗氏佐劑、微生物及其代謝產物、核酸及其類似物、細胞因子、脂質體等(Dey AK,Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses induced by immunogens.Expert review of vaccines,2011,10:227-251)，但由 于存在不同程度的毒副作用或安全隱患等一些不可避免的缺陷而難以實際應用(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416；Batista-Duharte A,Lindblad EB,Oviedo-Orta E.Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicology letters,2011,203(2):97-105)，導致這些佐劑遠遠不能滿足新型疫苗發展的需求。特別地，大量的臨床免疫試驗認為鋁膠佐劑存在一些問題：(1)對Th2介導的體液免疫反應具有很強的激發作用，而對Th1介導的細胞免疫反應的作用較弱，只適用于以抗體為主要保護性免疫的疫苗(Exley C,Siesjo P,Eriksson H.The immunobiology of aluminum adjuvants:how do they really work？Trends in immunology,2010,31:103-109)；(2)可促進IgE抗體產生，容易誘導機體產生過敏反應；(3)有局部反應，會形成肉芽腫，極個別可發生局部無菌性膿腫；(4)因其理化性質，含鋁膠疫苗怕凍，凍后鋁膠疫苗容易變性；(5)對人、畜神經系統可能有影響(見中國專利CN102526724A、CN101402666A)。因而，尋找安全、有效、新型的免疫佐劑是當前疫苗研究領域的一個熱點(Schijins VEJC,Lavelle EC.Teends in vaccine adjuvants.Expert review of vaccines,2011,10(4):539-550)。并且，免疫佐劑研究現已被列為疫苗研究的優先領域(Harandi AM,Medaglini D,Shattock RJ.Vaccine adjuvants:A priority for vaccine research.Vaccine,2010,28(12):2363-2366；Harand AM,Brewe J,Schijn V.Conference scene:recent advancements in immunopotentiators for modern vaccines.Immunotherapy,2011,3(11):1297-1301)。
另外，目前商品化的菌苗(如豬肺炎支原體菌苗、副豬嗜血桿菌菌苗)是通過在含血清的培養基上生長所得的生物體制備而成，引起了對于免疫物質中存在的血清組分(如免疫復合物或非 免疫原性特異性蛋白)誘導副反應發生(見中國專利CN104334186A)。并且在獸用生物制品技術領域臨床試驗的研究中，發現蛋白的重復性和穩定性十分重要，良好的穩定性是數據可靠的一個重要標志。但是，在臨床試驗中，一些蛋白的穩定性較差，在一般條件下極易降解或變性，直接影響試驗結果的準確性。因此，如何保持蛋白的穩定性是臨床試驗中的關鍵技術。
技術實現要素：
為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種疫苗用佐劑及其應用。
本發明的第一方面在于提供一種疫苗用佐劑，所述佐劑包括鋁膠、左旋咪唑或其衍生物。
作為本發明的一種優選實施方式，所述鋁膠包括氫氧化鋁、磷酸鋁中的至少一種。
作為本發明的一種優選實施方式，所述左旋咪唑或其衍生物包括左旋咪唑、鹽酸左旋咪唑、磷酸左旋咪唑中的至少一種。
術語“佐劑”是指當與抗原連同投與時，使受試者對這一抗原的免疫反應增強的化合物。
術語“鋁膠”(Aluminium oxide)又稱鋁佐劑(Aluminum-containing adjuvants)，包括氫氧化鋁佐劑(Aluminium hydroxide adjuvant)和磷酸鋁佐劑(Aluminium phosphate)。所述鋁膠還可以包括以下任一產品如 HPA(General Chemical,LLC)、M9400SP(J.M.Huber Corporation)、(Merck)、(Brenntag Biosector)、Aluminum hydroxide(Sigma-aldrich、Watson、Bisely&Company Pty Ltd.、Noah thchnologies corporation或CellMark USA,LLC)、氫氧化鋁凝膠(內蒙古新宏生物科技有限公司)、20％氫氧化鋁膠生理鹽水(中牧實業股份有限公司)。
術語“左旋咪唑或其衍生物”包括左旋咪唑、左旋咪唑衍生物如鹽酸左旋咪唑(Levamisole Hydrochloride)或磷酸左旋咪唑(Levamisole phosphate)中的至少一種；所述左旋咪唑(Levamisole，LMS)又稱左咪唑(L-Tetramisol)或左旋四咪唑，為四咪唑的左旋光學異構體，是一種廣譜驅蟲藥。所述左旋咪唑或其衍生物還可以包括以下任一產品如TotalonTM Topical Cattle Anthelmintic(Pitman-Moore,Inc.)、(Intervet,Inc.)、 (Schering-Plough)、(Janssen Pharmaceuticals,Inc.)、Levamisole Hydrochloride(Bimeda,Inc.)、Plus(Fort Dodge Animal Health)、ProhibitTM Soluble Drench Power(Agri laboratories,Ltd.)、Levamisole phosphate(Agri laboratories,Ltd.)、Levamisole Hydrochloride Soluble Pig Wormer(Cross Vetpharm Group Ltd.)、左旋咪唑原料藥(西安帥諾生物科技有限公司)、鹽酸左旋咪唑(陜西漢江藥業集團股份有限公司)、鹽酸左旋咪唑注射液(廣西南寧市桃源獸藥廠)、左旋咪唑搽劑(參見中國專利CN1048399A)。
在本發明的一個優選實施方式中，所述佐劑還包括聚丙烯酸鹽。
在本發明的一個優選實施方式中，所述聚丙烯酸鹽包括聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸鉀、聚丙烯酸鈣。
在本發明的一個優選實施方式中，所述聚丙烯酸鹽為聚丙烯酸鈉。
術語“聚丙烯酸鹽”包括但不限于聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸鉀、聚丙烯酸鈣，優選為聚丙烯酸鈉；所述聚丙烯酸鈉(Sodium polyacrylate或acrylic sodium salt polymer)，別名2-丙烯酸納均聚物、S聚丙烯酸鈉，簡稱ASAP或PAA-Na，又稱super-slurper，是水溶性高分子化合物，溶于水形成極粘稠的透明溶液。所述聚丙烯酸鈉還可以包括以下任一產品如Sodium polyacrylate (Sigma-Aldrich、Flinn Scientific,Inc.、Kowa India Pvt.Ltd.、上海一基實業有限公司或湖北巨勝科技有限公司)、聚丙烯酸鈉(參見中國專利CN104292375A、CN101423577A或CN1112380A)。
在本發明的一個優選實施方式中，所述佐劑中所述鋁膠為5％-30％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為0.1-8mg/ml。
在本發明的一個優選實施方式中，所述佐劑中所述鋁膠為8％-20％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為2-5mg/ml。
在本發明的一個優選實施方式中，所述佐劑中所述鋁膠為5％-30％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為0.1-8mg/ml，所述聚丙烯酸鹽為0.1-8mg/ml。
在本發明的一個優選實施方式中，所述佐劑中所述鋁膠為8％-20％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為2-5mg/ml，所述聚丙烯酸鹽為0.5-6mg/ml。
本發明的第二方面在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物含所述佐劑和免疫有效量的抗原。
在本發明的一個優選實施方式中，所述疫苗組合物中所述抗原為滅活的或亞單位抗原。
在本發明的一個優選實施方式中，所述疫苗組合物中所述佐劑包含所述鋁膠為5％-30％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為0.1-8mg/ml。
在本發明的一個優選實施方式中，所述疫苗組合物中所述佐劑包含所述鋁膠為8％-20％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為2-5mg/ml。
在本發明的一個優選實施方式中，所述疫苗組合物中所述佐劑包含所述鋁膠為5％-30％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為0.1-8mg/ml，所述聚丙烯酸鹽為0.1-8mg/ml。
在本發明的一個優選實施方式中，所述疫苗組合物中所述佐劑包含所述鋁膠為8％-20％V/V，所述左旋咪唑或其衍生物為 2-5mg/ml，所述聚丙烯酸鹽為0.5-6mg/ml。
術語“免疫有效量”又稱免疫保護量或產生免疫應答的有效量，為可在接受者體內有效誘導免疫原性應答的量。所述免疫應答可能足以用于診斷目的或其它試驗，或可能適合用于預防疾病的征兆或癥狀，包括由病原體引起的感染所造成的不利的健康結果或其并發癥。體液免疫力或由細胞介導的免疫力或此二者均可被誘導。動物對免疫原性組合物的免疫應答可通過例如測量抗體效價、淋巴細胞增殖分析而間接評估，或在以野生型毒株攻擊后通過監測征兆或癥狀來直接評估，而該由疫苗提供的保護性免疫力可通過測量例如受試者的臨床征兆如死亡率、發病率的減少、溫度數值、受試者總體生理狀況及總體健康和表現來評估。所述免疫應答可包括但不限于誘導細胞性和/或體液免疫力。
術語“抗原”又稱免疫原，是指任何刺激免疫應答的物質，是一種能夠被抗體結合的分子，還能夠誘導產生B-和/或T-細胞的體液免疫應答和/或細胞免疫應答，還具有一個或多個表位(B-和T-表位)。所述抗原包括殺死的、滅活的細菌、病毒或寄生蟲，或其培養細胞制劑、上清液；還包括亞單位抗原，所述亞單位抗原為個別的或其任何組合的多核苷酸、多肽、重組蛋白質、合成的肽、蛋白質提取物、細胞、組織、多糖、脂質或其片段，亦包括抗體如抗受試者遺傳型抗體或其片段以及可模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽模擬位mimotopes。其中，所述殺死的、滅活的細菌、病毒或寄生蟲是指含有不再能夠復制或生長的感染性生物體或病原體，病原體可通過各種方法包括凍融、化學處理(如用硫柳汞或福爾馬林處理)、聲處理、照射、熱或任何其它足以阻止生物體復制或生長的常用方法來實現滅活而維持其免疫原性。
在本發明的一個優選實施方式中，所述抗原包括豬圓環病毒抗原、豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬繁殖與呼吸綜合 征病毒抗原、豬細小病毒抗原、多殺巴斯德菌抗原、豬鏈球菌抗原、豬葡萄球菌抗原、支氣管炎博德特菌抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬霍亂沙門氏菌抗原、腸炎沙門氏菌抗原、豬紅斑丹毒絲菌抗原、豬鼻支原體抗原、豬滑液支原體抗原、豬鉤端螺旋體細菌抗原、豬呼吸道冠狀病毒抗原、豬流行性腹瀉病毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬傳染性胃腸炎病毒抗原、豬細環病毒抗原、豬巨細胞病毒抗原、豬腸病毒抗原、腦心肌炎病毒抗原、豬流感病毒抗原、豬瘟病毒抗原中的一種或多種。
在本發明的一個優選實施方式中，所述抗原為豬圓環病毒抗原、豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原中的一種或多種。
術語“豬圓環病毒抗原”是指含有至少一種豬圓環病毒(Porcine circovirus，PCV)抗原形式的任何組合物，所述豬圓環病毒抗原可誘導、刺激或增強抵抗豬圓環病毒感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限于滅活的或亞單位的抗原。所述豬圓環病毒抗原包含SH株(保藏號為CGMCC No.23890，參見中國專利CN101240264A)、SD株(保藏號為CGMCC No.7707，參見中國專利CN103421748A)、D株(保藏號為CGMCC No.7245，參見中國專利CN103275938A)、WH株(保藏號為CCTCC No.V201333，參見中國專利CN103409374A)、ZJ/H株(保藏號為CGMCC No.6391，參見中國專利CN102787100A)、DBN-SX07株(保藏號為CGMCC No.3064，參見中國專利CN101549155A)、V201312株(保藏號為CCTCC No.V201312，參見中國專利CN103436498A)，還可以包含以下組合物的任一種抗原如梅里亞公司Merial的、輝瑞公司Pfizer的PCV2、哈爾濱維科生物技術開發公司的豬圓環病毒2型滅活疫苗(LG株)、浙江諾倍威生物技術有限公司的豬圓環病毒2型滅活疫苗(ZJ/C株)、勃林格殷格翰公司Boehringer-Ingelheim的Ingelvac
術語“豬肺炎支原體抗原”是指含有至少一種豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)抗原形式的任何組合物，所述豬肺炎支原體抗原可誘導、刺激或增強抵抗豬肺炎支原體感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限于滅活的或亞單位的抗原，或其培養上清液。所述豬肺炎支原體抗原包含HN0613株(保藏號為CCTCC No.M2012230，參見中國專利CN103083655A)、J株(購自美國典型培養物保藏中心ATCC，ATCC編號為25934)、NJ株(保藏號為CCTCC No.M2012286，參見中國專利CN103585622A)、HDZK-Mhp57株(保藏號為CGMCC No.8096，參見中國專利CN103484414A)、AN306株(保藏號為CCTCC No.M2012431，參見中國專利CN103740625A)、DJ-166株(保藏號為CGMCC No.4545，參見中國專利CN103184171A)和NM04/41259株(保藏號為NM04/41259株，參見中國專利CN102458462A)，還可以包含以下組合物的任一種抗原如哈藥集團公司的瑞倍適Respisure和瑞倍適-旺RespisureOne、英特威公司的安百克M+PAC、勃林格殷格翰公司的M.hyo、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFend MH、碩騰(上海)動物保健品有限公司的瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、梅里亞動物保健公司的豬克喘SprintVac、海博萊公司的喜宜豐Mypravac Suis。
術語“副豬嗜血桿菌抗原”是指含有至少一種副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)抗原形式的任何組合物，所述副豬嗜血桿菌抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限于滅活的或亞單位的抗原，或其培養上清液。所述副豬嗜血桿菌抗原包括本領域技術人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的1-15個血清型或無法測定血清型的副豬嗜血桿菌，包含至少兩個血清型的混合抗 原如4型(如JS株，保藏號為CCTCC No.M2011172，參見中國專利CN103083655A)和5型(如ZJ株，保藏號為CCTCC No.M2011173，參見中國專利CN103083655A)的混合抗原，還可以包含以下組合物的任一種抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1、海博萊公司Hipra的Hiprasuis-Glasser、中牧實業股份有限公司成都藥械廠和武漢科前動物生物制品有限責任公司的副豬嗜血桿菌滅活疫苗(4型MD0322株+5型SHO165株)。
術語“豬”是指任何屬于豬科(Suidae)成員的動物，即小豬(piglets)，swine，pigs，porcine，大母豬(sows)，小母豬(gilts)，barrows，公豬(boars)以及豬科的成員。
本發明第三方面在于提供所述疫苗組合物在制備預防和/或治療的藥物中的應用。
術語“預防和/或治療”在涉及細菌、病毒或寄生蟲感染時是指抑制細菌、病毒或寄生蟲的復制、抑制細菌、病毒或寄生蟲的傳播或防止細菌、病毒或寄生蟲在其宿主體內定居，以及減輕細菌、病毒或寄生蟲感染所之疾病或病癥的癥狀。若細菌、病毒或寄生蟲荷載量減少、感染癥狀減輕和/或攝食量和/或生長增加，那么就可以認為所述治療達到了治療效果。
本發明的第四方面在于提供所述佐劑在制備蛋白穩定液中的應用。
術語“蛋白”包括化學合成的蛋白、培養細胞的基因編碼的天然合成的蛋白以及由細胞分泌的重組蛋白。所述重組蛋白是由分子生物技術引入細胞的轉基因編碼的那些，可通過化學方法或翻譯后過程中的酶進行修飾。所述蛋白包括動物蛋白，是通過細胞培養產生的那些，也包括其他來源例如昆蟲、細菌、植物等表達的蛋白，以及突變的、人工的、合成的、融合的或嵌合的蛋白。根據本發明，所述蛋白包括但不限于兔病毒性出血癥病毒RHDV的VP60蛋白，犬細小病毒PPV的VP2蛋白，豬圓環病毒PCV2 的Cap、Rep蛋白，豬肺炎支原體的P46、P65、NrdF、P97R1、P102、PdhA、XylF、P78、EutD、Mhp145、P132、Mhp389蛋白，副豬嗜血桿菌HPS的PilA、OMP、HbpA、OppA、PalA蛋白，豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的Nsp2、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白，豬細小病毒PPV的VP2蛋白，多殺巴斯德菌P.multocide的hyaE蛋白，豬鏈球菌S.suis的38KDa、SaoA、MRP、HM6、GAPDH、Omp40、VirB4、SLY蛋白，豬葡萄球菌S,hyicus的ExhA、ExhB、ExhC、ExhD蛋白，支氣管炎博德特菌Bb的P68蛋白，大葉性肺炎放線桿菌APP的Omp20、OmpW、Omp27、Omp27、OmpA1和OmpA2蛋白，大腸桿菌E.coli的K88、K99、987P、F41、F17、LTB、Orf353、TolC蛋白，豬萎縮性鼻炎AR的PMT，豬偽狂犬病毒PRV的gB、gC、gD、gE，腸炎沙門氏菌S.enteria的Hfq蛋白，豬紅斑丹毒絲菌E.rhusiopathiae的SpaA、Lipo蛋白，豬鼻支原體Mhr的P37蛋白，豬呼吸道冠狀病毒PRCV的S、N蛋白，豬流行性腹瀉病毒PEDV的S、M、N蛋白，豬輪狀病毒PRV的VP4、VP6、VP7蛋白，豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的S、M、N蛋白，豬細環病毒TTSuV的Cap蛋白，豬巨細胞病毒PCMV的gB蛋白，豬腦心肌炎病毒EMCV的VP1、VP2、3AB蛋白，豬流感病毒的HA、NP、NA、M、NS蛋白，豬瘟病毒CSFV的E0、E1、E2蛋白中的一種或多種。
術語“蛋白穩定液”是指使免疫原性蛋白成分的穩定性得以顯著改善，在制備過程中和適當條件下長期(例如數月至數年)優選地超過12個月(例如24個月或30個月)保存后，保持蛋白原有分子量、結構和/或生物活性的至少80％優選至少90％不變，保持蛋白生物穩定性、物理穩定性、化學穩定性，不會形成化學降解產物，不會發生不可逆變化(例如聚集、沉淀或變性)。所述化學降解產物與天然蛋白結構相比具有潛在的更低生物效價和/或潛在的更低免疫原性。
本發明具有以下突出的優點：
(1)所述佐劑具有成本低廉、使用方便、免疫活性強等優點，既能使動物機體產生體液免疫又能提供細胞免疫，免疫持續時間長，并且在抗原含量較低、單次免疫時也能使動物獲得較好的免疫應答水平，且無副反應發生；
(2)所述佐劑凍存也不變性，可用作蛋白穩定液保存蛋白，使蛋白穩定不降解或不發生不可逆變化。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
本發明實施例中豬圓環病毒抗原以滅活的豬圓環病毒2型SH株，豬肺炎支原體抗原以滅活的豬肺炎支原體HN0613株，副豬嗜血桿菌抗原以滅活的4型副豬嗜血桿菌JS株和5型副豬嗜血桿菌ZJ株為例進行闡述，但該實施方式無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
本發明實施例中肺病變指數采用28分法進行評判。所述28分法是根據豬支原體肺炎的典型肺部眼觀病變，對發病程度進行量化判定，包括肺尖葉、心葉、膈葉、中間葉出現的實質樣病變，如“肉樣變”、“胰樣變”。肺炎病變評分標準為：2個尖葉、2個心葉、2個膈葉、1個中間葉共計7個肺葉，每個肺葉滿分為4分，共計28分。根據發生實質病變的肺葉面積所占該葉的比例，分別對每個肺葉進行打分。無肺炎病變記為0分；病變面積比例為1％-25％，記為1分；病變面積比例26％-50％，記為2分；病 變面積比例為51％-75％，記為3分；病變面積比例為76％-100％，記為4分。如肺葉正反兩面均有病變，以病變面積大的一面進行記分。各個肺葉打分總和即為該發病株的肺炎病變得分。分別對免疫組豬和對照組豬進行記分后，按照以下公式計算免疫組豬的肺葉病變減少率：
本發明實施例統計分析方法為：統計7個肺葉的肺病變指數，確定病變程度。用SPSS計算機軟件進行ANOVA分析，比較各組間差異，確定病變差異的有效性。
本發明中所用的pH7.2PBS溶液配方為：1000ml蒸餾水中加入NaCl 9g、Na2HPO4·12H2O 6g、NaH2PO4·2H2O 0.4g，經121℃高壓滅菌30分鐘后使用，但該實施方式無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
本發明中所用到的化學試劑均為分析純，購自國藥集團，但該實施方式無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于本發明而不用于限制本發明的范圍。本發明所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
實施例1抗原的制備
1.1豬圓環病毒抗原的制備
按照中國專利CN103083655A制備豬圓環病毒2型SH株病毒液及測定病毒液含量，結果：豬圓環病毒2型SH株的含量為5×106.0TCID50/ml；并對病毒液進行滅活及用間接免疫熒光法IFA檢測滅活效果，結果：無綠色PCV2陽性細胞產生，表明豬圓環病毒2型SH株病毒液滅活成功。
1.2豬肺炎支原體抗原的制備
按照中國專利CN103083655A進行制備豬肺炎支原體HN0613株菌液及測定菌液的含量，結果：豬肺炎支原體HN0613株的含量為1×109CCU/ml；并對菌液進行滅活及檢驗，結果：培養基著色未發生變化，培養基pH值不降低，表明豬肺炎支原體HN0613株菌液滅活成功。
1.3副豬嗜血桿菌抗原的制備
按照中國專利CN103083655A分別制備副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌液及測定菌液含量，結果：副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株的含量均為5×109CFU/ml；并對菌液進行滅活及檢驗，結果：平皿中無任何細菌生長，表明副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌液滅活均成功。
實施例2佐劑的制備
鋁膠：購自美國General Chemical,LLC的HPA佐劑。
左旋咪唑母液：將購自西安帥諾生物科技有限公司的左旋咪唑原料藥加熱溶解成40mg/ml溶液，并進行過濾除菌，即得40mg/ml左旋咪唑母液。
聚丙烯酸鈉母液：將購自上海一基實業有限公司的1g聚丙烯酸鈉與100蒸餾水混合，加熱煮沸直到完全溶解，然后冷卻至室溫，即配置成濃度為10mg/ml的聚丙烯酸鈉母液，并于121℃高壓滅菌30分鐘后備用。
實施例3滅活疫苗組合物的制備及動物試驗
3.1滅活疫苗組合物的制備
將實施例1制備的抗原、實施例2制備的佐劑使用PBS溶液稀釋，使稀釋后的各抗原溶液與佐劑終濃度按表1中滅活的疫苗組合 物所含組分混合，以500-800轉/分鐘的轉速攪拌10-15分鐘，在終止攪拌前加入1％V/V的硫柳汞(購自國藥集團化學試劑有限公司)溶液，使其終濃度不超過萬分之一，充分振蕩混勻、分裝，分裝后2-8℃保存備用。
3.2滅活疫苗組合物之豬圓環病毒抗原的動物試驗
將實施例3.1所制備的疫苗A1、A2、A3、A6、A7、A9、B1、B2、B3、B6、B7、B9以及參考疫苗對照組(PCV2疫苗，由普萊柯生物工程股份有限公司生產)分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型和豬瘟)，5頭/組，2ml/頭，同時設置空白對照組，共14組(共70頭仔豬)。免疫接種后21天、35天、60天、90天對每頭豬采血，收集血清，保存在-20℃直到測試。
按照血清學方法對豬圓環病毒抗原部分的免疫效果進行評價，具體為：
(1)ELISA抗體檢測用大腸桿菌表達的PCV2ORF2蛋白(按照中國專利CN101101296A制備)作為抗原，通過方陣滴定試驗確定抗原的最佳包被濃度。將抗原稀釋到最佳包被濃度后包被酶標板，100μl/孔，后4℃包被過夜；洗滌3次，每次3-5分鐘；每孔加200μl的0.15％M/V BSA封閉液封閉板子，37℃作用2小時；洗滌；將待檢血清用PBS倍比稀釋，每個樣品一行，每孔加100μ1，37℃作用1h；洗滌；然后加入酶標的SPA(1:10000倍稀釋)，100μl/孔，37℃作用1h；洗滌；加底物液TMB顯色，最后用2mol/L的H2SO4終止反應。結果判定：待檢血清OD450值/陰性血清OD450值≥2.1為陽性。
(2)血清中和試驗采用固定病毒稀釋血清法。待檢血清56℃加熱30分鐘，10000轉/分鐘離心5分鐘，小心吸出上清，做1:2稀釋后進行倍比稀釋；分別與等量PCV2病毒液混合，37℃1h,接種于含單層PK15細胞的96孔板內，100μ1/孔，每一稀釋度接種4孔，同時設細胞對照和病毒對照孔。37℃培養12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖處理，37℃繼續培養48h，80％丙酮固定細胞，用間接免疫熒光法測定每個稀釋度含有熒光的孔數。以能夠抑制50％特異性熒光細胞數的細胞孔的血清最大稀釋度作為待檢血清的中和效價，并計算每組平均值。
血清學評價結果見表2。
表2 滅活疫苗組合物之豬圓環病毒抗原的血清學評價結果
注：參考疫苗對照組所用的PCV2疫苗由普萊柯生物工程股份有限公司生產，抗原含量為107.0TCID50/ml，按廠家說明書進行兩次免疫。
由表2可知：1-3組、7-9組同一含量的PCV2抗原(單苗)不同佐劑含量時，免疫后所產生的抗體隨佐劑含量的增大而略升高，且與高抗原含量的PCV2參考單苗所產生的抗體一致甚至更高，并能持續至少60天；4-6組、10-12組含相同含量佐劑的PCV2聯苗免疫后所產生的抗體比PCV2參考單苗所產生的抗體更高，并能持續至少60天。表明疫苗A1、A2、A3、A6、A7、A9、B1、B2、B3、B6、B7、B9分別免疫動物后能刺激機體產生PCV2特異性抵抗力，效果確實，并且疫苗A6、A7、A9、B6、B7、B9之其他抗原對PCV2抗原的免疫效果無影響；并且疫苗組合物中佐劑含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉的免疫效果優于含鋁膠、左旋咪唑的。
3.3滅活疫苗組合物之豬肺炎支原體抗原的動物試驗
將實施例3.1所制備的疫苗組合物A4、A6、A8、A9、B4、B6、B8、B9，分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環2型和豬瘟)，5頭/組，2ml/頭，同時設置參考疫苗對照組、攻毒對照組，共10組(共50頭仔豬)。免疫接種后觀察體溫、副反應至28日，并于28日按照豬肺炎支原體抗體檢測試劑盒(購自IDEXX)說明書進行抗體檢測，結果見表3；同時對所有豬氣管注射豬肺炎支原體濟南系強毒CVCC354株(保藏號為CVCC354，保藏單位為國家獸醫微生物菌種保藏管理中心)，100MID50/頭，觀察28天后解剖，并觀察肺部病變，按照28分法對肺部病變進行評分。攻毒前后，分別對試驗組仔豬進行稱重，并計算平均日增重。
攻毒后大約10天左右，攻毒對照組其中4頭豬陸續出現咳嗽、 氣喘等癥狀，皮毛不光滑；參考疫苗對照組有1頭豬出現了咳嗽的癥狀、并發生了副反應；其他免疫組的豬未出現氣喘病的類似癥狀。攻毒前后，各試驗組豬的肺炎病變平均得分和平均日增重結果見表3。
表3 滅活疫苗組合物之豬肺炎支原體抗原的動物試驗結果
注1：參考疫苗對照組所選用的疫苗為現有產品中的豬支原體肺炎滅活疫苗(J株)，即安百克(M+PAC)，按廠家說明書進行免疫。
注2：體溫“無”表明未發生一過性體溫升高，“有”表明發生一過性體溫升高，其中一過性體溫升高是指于二免疫后第1-2天體溫會短暫呈現40.5度，并于第3天恢復正常體溫。
注3：副反應“無”表明未發生過副反應，“有”表明發生過副反應，其中副反應是指出現過短暫性精神沉郁、食欲減退、過敏反應中的至少一種。
注4：差異性統計分析中，組間比較，字母相同者表示差異不顯著，字母不同者表示差異顯著(p＜0.05)。
由表3可知：1-4組、5-8組分別使用含豬肺炎支原體抗原和同樣含量佐劑的單苗或聯苗進行免疫，免疫后的血清抗體表明含鋁膠、左旋咪唑佐劑的自制疫苗及含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉佐劑的自制疫苗的抗體水平均高于參考疫苗的，且含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉佐劑的高于含鋁膠、左旋咪唑佐劑的；之后進行攻毒，結果顯示1-4組、5-8組免疫豬均未發生一過性體溫升高，也未出現副反應，并且肺炎病變減少率分別均＞73％、＞84％，平均日增重分別為0.0411-0.0414kg、0.0421-0.0423kg，雖1-4組各小組、5-8各小組之間差異不顯著(p＞0.05)，但1-4組與5-8組相比差異均顯著(p＜0.05)；與參考疫苗對照組相比，差異也均顯著(p＜0.05)；與攻毒對照組相比，差異也均顯著(p＜0.05)。表明疫苗組合物中佐劑含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉的免疫效果顯著優于含鋁膠、左旋咪唑的。
3.4滅活疫苗組合物之副豬嗜血桿菌抗原的動物試驗
將實施例3.1所制備的疫苗組合物A5、A7、A8、A9、B5、B7、B8、B9，分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環2型和豬瘟)，5頭/組，2ml/頭，同時設置參考疫苗對照組、攻毒對照組，共10組(命名為1、2、3、4、5、6、7、8、參考疫苗對照組1、攻毒對照組1)；同時做重復試驗，共10組(命名為11、12、13、14、15、16、17、18、參考疫苗對照組2、攻毒對照組2)，詳見表4。
免疫接種后28天時用副豬嗜血桿菌抗體檢測試劑盒(購自Biovet)進行抗體檢測，同時進行攻毒，前10組用副豬嗜血桿菌4型腹腔注射3ml進行攻毒，攻毒劑量為9.0×109CFU/頭；后10組用副豬嗜血桿菌5型腹腔注射3ml進行攻毒，攻毒劑量為6.0×109CFU/頭，攻毒后觀察各組豬臨床表現，觀察14天后剖殺進行病理觀察。攻毒前后分別對試驗組仔豬進行稱重，以計算平均日增重。
表4 滅活疫苗組合物之副豬嗜血桿菌抗原的動物試驗結果
注1：參考疫苗對照組所用副豬嗜血桿菌病滅活疫苗為中牧實業股份有限公司成都藥械廠生產的，抗原含量為4.0×109CFU/頭份，按照廠家說明書進行兩次免疫。
注2：差異性統計分析中，組間比較，字母相同者表示差異不顯著，字母不同者表示差異顯著(p＜0.05)。
由表4可知：1-4與5-8組、11-14與15-18組使用含副豬嗜血桿菌抗原和同樣含量佐劑的單苗或聯苗進行免疫，免疫后的血清抗體表明含鋁膠、左旋咪唑佐劑的自制疫苗及含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉佐劑的自制疫苗抗體水平高于參考疫苗的，且含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉佐劑的高于含鋁膠、左旋咪唑佐劑的；之后進行攻毒，結果顯示1-4與5-8組、11-14與15-18組免疫豬均獲得完全保護，平均日增重為0.0311-0.0342kg，1-4、5-8、11-14、15-18各小組之間差異不顯著(p＞0.05)，而1-4組與5-8組相比差異顯著(p＜0.05)、11-14與15-18組相比差異顯著(p＜0.05)；與參考疫苗對照組相比，抗原含量低還能使免疫保護效率高，并且平均日增重差異均顯著(p＜0.05)；與攻毒對照組相比，平均日增重差異均顯著(p＜0.05)。表明疫苗組合物中含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉佐劑的免疫效果顯著優于含鋁膠、左旋咪唑佐劑的。
實施例4蛋白穩定液的應用
4.1RHDV VP60蛋白穩定性研究
按照中國專利CN103555766A中所描述的方法制備兔出血癥病毒(Rbabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的免疫原性VP60蛋 白，對表達后的VP60蛋白進行鑒定確認無疑后進行純化，并用人的O型紅細胞的凝集價進行檢測，檢測結果表明VP60蛋白的血凝價HA為1:217。
將實施例2制備的佐劑各成分即鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉母液用以制備VP60蛋白穩定液，用PBS稀釋制備RHDV VP60蛋白溶液(溶液1-2)，使各組分終濃度為：VP60HA為1:214，鋁膠為10％V/V，左旋咪唑為4mg/ml。同時，制備溶液3-4使各組分終濃度為：VP60HA為1:214，鋁膠為10％V/V，左旋咪唑為4mg/ml，聚丙烯酸鈉為4mg/ml。取同樣劑量的RHDV VP60蛋白溶液各2份在2-8℃分別存放6、12、18、24、30、36個月，并用PBS稀釋的VP60蛋白溶液2份做對照，對不同保存條件下的蛋白溶液進行血凝檢測，結果見表5。
表5 RHDV VP60蛋白穩定性試驗結果
由表5可知：含鋁膠、左旋咪唑的溶液作為RHDV VP60蛋白穩定液使VP60蛋白穩定至少24個月，含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉的溶液作為RHDV VP60蛋白穩定液使VP60蛋白穩定至少30個月，而以PBS作為保存溶液的對照組HA隨時間的延長而逐漸降低，表明蛋白出現了一定程度的降解或發生了不可逆變化。
4.2PCV2Cap蛋白穩定性研究
按照中國專利CN104017813A中所描述的方法制備豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)的免疫原性Cap蛋白，對表達后的Cap蛋白進行鑒定確認無疑后進行純化，按照BCA蛋白定量試劑盒(購自Merck公司)說明書的方法定量Cap蛋白的濃度，結果表明：Cap蛋白的濃度為2mg/ml。
將實施例2制備的佐劑各成分即鋁膠、左旋咪唑母液、用以制備Cap蛋白穩定液，用PBS稀釋制備PCV2Cap蛋白溶液1-2，使各組分終濃度為：Cap蛋白濃度為0.40mg/ml，鋁膠為10％V/V，左旋咪唑為4mg/ml。同時制備溶液3-4使各組分終濃度為：Cap蛋白濃度為0.40mg/ml，鋁膠為10％V/V，左旋咪唑為4mg/ml，聚丙烯酸鈉為4mg/ml。
取同樣劑量的PCV2Cap蛋白溶液各2份在2-8℃分別存放6、12、18、24、30、36個月，并用PBS稀釋的Cap蛋白溶液2份做對照，對不同保存條件下的蛋白溶液分別進行BCA測定，結果見表6。
表6 PCV2Cap蛋白穩定性試驗結果
由表6可知：含鋁膠、左旋咪唑的溶液作為PCV2Cap蛋白穩定液，使Cap蛋白穩定至少24個月，含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉的溶液作為PCV2Cap蛋白穩定液，使Cap蛋白穩定至少30個月，而以PBS作為保存溶液的對照組中Cap蛋白的濃度隨保存時間的延長而逐漸降低，蛋白出現了一定程度的降解或發生了不可逆變化。
綜上所述，含鋁膠、左旋咪唑、聚丙烯酸鈉佐劑的疫苗組合物的免疫效果顯著優于含鋁膠、左旋咪唑佐劑的，這些疫苗組合物(1)免疫動物后的免疫應答水平隨佐劑含量的增加而升高，且與現有商品化疫苗的免疫應答水平相當甚至較高，抗體持續時間也較長，效果確實；(2)在抗原含量較低時也能使動物獲得較好的免疫效果，免疫次數少使豬的應激反應減少甚至無，且無副反應發生；(3)所含佐劑凍存也不變性，可作為蛋白穩定液使用，使蛋白穩定不降解或不發生了不可逆變化。
以上所述僅是本發明的優選實施例而已，并非對本發明做任何形式上的限制，雖然本發明已以優選實施例揭露如上，然而并非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發 明技術方案的范圍內，當可利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發明技術方案的范圍內。