一種大葉茜草素/殼聚糖納米微球及其制備方法和應用與流程

本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種大葉茜草素/殼聚糖納米微球及其制備方法和應用。

背景技術：
茜草(RubiacordifoliaL.)是一種醫藥學上應用前景廣闊的中草藥，而大葉茜草素(mollugin)是茜草科植物中的主要活性成分。研究發現，大葉茜草素具有良好抗腫瘤、抗氧化、抗誘變、抗病毒、抗菌、抗炎抗風濕、保護神經、抑制脂肪積聚、止血等生物活性，用于關節炎、痛經、大出血、風濕和泌尿系統紊亂等疾病的治療，是一種有著廣闊研究價值和市場前景的植物活性物質。但由于大葉茜草素中酚羥基的存在，致使該化合物不穩定，在有機溶劑中易氧化降解；而且大葉茜草素不溶于水，生物利用率低，限制了其發展應用。相關研究表明，將納米技術引入傳統中藥，制備納米中藥，可改善藥物水溶性，利用納米粒子的實體瘤的高通透性和滯留效應(EPR效應)可實現藥物控釋緩釋、提高藥物靶向性，從而提高中藥生物利用度；同時，還可豐富傳統中藥劑型和給藥途徑，解決中藥劑型單一的問題。雖然納米技術在中醫藥領域起步較晚，但已展現出巨大的潛力及廣闊的前景。殼聚糖是自然界中唯一堿性多糖，天然無毒，不僅具有生物相容性，還擁有氨基等活性基團，使它在藥物的控制與釋放、改善藥物的溶解性和吸收性等方面發揮重要作用。殼聚糖作為緩釋載體具有維持血藥濃度平衡、降低藥物不良反應、提高藥物療效等優勢。近年來已公開了一些殼聚糖載藥微球的報道。例如，專利CN201612864U提供了一種以殼聚糖與戊二醛的縮合物為囊殼，包覆白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇、紫檀芪和白皮杉醇的緩釋微球，微球粒徑為2～100μm；CN102293752B公開了通過離子交聯法聯合噴霧干燥法制備殼聚糖載辣椒素微球，微球粒徑為0.8～4.5μm；專利CN101991541B報道了通過離子交聯法，經二次冷凍干燥制備負載阿昔洛韋的殼聚糖-明膠 納米粒。這些殼聚糖載藥微球的制備方法存在一定缺陷，如有些方法使用了有毒試劑(戊二醛)，有些方法制備復雜，反應條件較高(離子交聯法聯合二次冷凍干燥法)，并且所得到的載藥微球粒徑均偏大，分布較廣等。

技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術中存在的上述不足，提供一種粒徑較小、分散良好的大葉茜草素/殼聚糖納米微球及其制備方法和應用。本發明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為：一種大葉茜草素/殼聚糖納米微球，該納米微球為殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯形成的三維網狀結構，大葉茜草素以分子形式固定其中，大葉茜草素的包封率為4.58～14.64％，納米微球的平均粒徑為96～467nm，納米微球粒徑的多分散系數為0.25～0.27，載藥量為5.73～28.153μg/mg，Zeta電位為45.07～48.73mV。本發明還提供了上述大葉茜草素/殼聚糖納米微球的制備方法，步驟如下：(1)將殼聚糖溶于含有0.1～0.5wt％泊洛沙姆188和1.0～1.5％(V/V)醋酸的水溶液中，配成1.0～3.0mg/mL的殼聚糖水溶液，然后用微孔濾膜過濾，所得濾液經NaOH溶液調節pH值為3.5～4.5，得到殼聚糖組分液；(2)將大葉茜草素溶于無水乙醇中配成濃度為1.0～5.0mg/mL的大葉茜草素乙醇溶液，采用微孔濾膜過濾，得到大葉茜草素組分液；(3)將步驟(2)所得大葉茜草素組分液逐滴加入步驟(1)所得殼聚糖組分液中，充分攪拌，并逐滴加入1.0～3.0mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，其中大葉茜草素組分液、殼聚糖組分液和三聚磷酸鈉溶液的體積比為1:5:2，在30～40℃持續攪拌反應10～60min，所得微乳液靜置陳化10～15h，再后處理即得大葉茜草素/殼聚糖納米微球。本發明以殼聚糖為載體，三聚磷酸鈉為交聯劑，泊洛沙姆188為穩定劑，將大葉茜草素負載到殼聚糖上制備得到粒徑較小、分散性好的納米微球。按上述方案，步驟(1)所述殼聚糖脫乙酰度為82～97％，分子量為10～50萬。按上述方案，步驟(1)和步驟(2)所述微孔濾膜的孔徑為0.45μm。按上述方案，步驟(1)所述NaOH溶液濃度為1mol/L。按上述方案，步驟(3)所述攪拌速率為800～1600r/min。按上述方案，步驟(3)所述后處理包括過濾、透析、真空冷凍干燥。本發明還提供了上述大葉茜草素/殼聚糖納米微球的應用，具體為在制備抗氧化劑方面的應用，在制備人肝癌細胞抑制劑方面的應用，及在制備人宮頸癌細胞抑制劑方面的應用。本發明的有益效果在于：1、本發明以殼聚糖為載體，三聚磷酸鈉為交聯劑，泊洛沙姆188為穩定劑，將大葉茜草素負載到殼聚糖上制備得到粒徑較小、分散性好的納米微球，解決了現有制備技術中存在的有毒物質殘留和載藥微球粒徑偏大、粒度分布廣、生物活性低的問題，對提高藥物的療效和有效性、豐富藥物劑型有著重要意義。2、大葉茜草素/殼聚糖納米微球具有顯著地抗氧化和抑制癌細胞活性，將大葉茜草素制備成納米微球，增強了藥物的穩定性，改善了藥物的水溶性，提高了藥物的生物利用率，為開發治療和預防由體內氧化反應引起的心腦血管、糖尿病、癌癥等疾病的新制劑提供了新途徑，并對開發中藥新劑型和實現中藥現代化具有積極促進作用。3、本發明提供的制備方法操作簡單，條件溫和，重復性好。以殼聚糖為藥物載體，利用殼聚糖的生物相容和可體內生物降解性能，可實現藥物的控釋緩釋。附圖說明圖1為本發明實施例1所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球的原子力顯微鏡(AFM)圖；圖2為實施例2所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球的原子力顯微鏡(AFM)圖；圖3為實施例3所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球的掃描電子顯微鏡(SEM)圖；圖4為實例1-3所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球清除自由基活性圖；圖5為實例1-3所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球及大葉茜草素對人肝癌細胞(HepG2)存活率關系圖；圖6為實例1-3所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球及大葉茜草素對 人宮頸癌細胞(HeLa)存活率關系圖。具體實施方式為使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述。實施例1本實施例大葉茜草素/殼聚糖納米微球的制備方法如下：(1)將殼聚糖(脫乙酰度82％，分子量50萬)溶于含有0.1wt％泊洛沙姆188和1.5％(V/V)醋酸的水溶液中，配成1.0mg/mL的殼聚糖水溶液，然后用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，所得濾液經濃度為1mol/L的NaOH溶液調節pH值為4.0，得到殼聚糖組分液；(2)將大葉茜草素溶于無水乙醇中配成濃度為1.0mg/mL的大葉茜草素乙醇溶液，采用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，得到大葉茜草素組分液；(3)將1mL步驟(2)所得大葉茜草素組分液逐滴加入5mL步驟(1)所得殼聚糖組分液中，充分攪拌(攪拌速率為800r/min)，并逐滴加入2mL1.0mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，在33℃持續攪拌反應10min，所得微乳液靜置10h，采用中速定量濾紙抽濾，再將濾液放入8000～14000截留分子量的透析袋中并在室溫下于超純水中透析3h；將透析后的微乳液倒入培養皿中，在-20℃預凍12h，然后在-50℃真空冷凍干燥24h，即得大葉茜草素/殼聚糖納米微球。本實施例所制備的納米微球平均粒徑約為96nm，載藥量為5.73μg/mg，包封率為4.58％，PDI值為0.26，Zeta電位為45.07mV。附圖1為采用MultiModeTM型原子力顯微鏡所觀察到的本實施例所得大葉茜草素/殼聚糖納米微球的AFM圖。由AFM圖可以看出，制備得到的納米微球球形規則，粒徑均一，分散良好，微球平均粒徑約為96nm。實施例2本實施例大葉茜草素/殼聚糖納米微球的制備方法如下：(1)將殼聚糖(脫乙酰度97％，分子量10萬)溶于含有0.3wt％泊洛沙姆188和1.0％(V/V)醋酸的水溶液中，配成1.2mg/mL的殼聚糖水溶液，然后用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，所得濾液經濃度為1mol/L的NaOH 溶液調節pH值為3.5，得到殼聚糖組分液；(2)將大葉茜草素溶于無水乙醇中配成濃度為3.0mg/mL的大葉茜草素乙醇溶液，采用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，得到大葉茜草素組分液；(3)將1mL步驟(2)所得大葉茜草素組分液逐滴加入5mL步驟(1)所得殼聚糖組分液中，充分攪拌(攪拌速率為1200r/min)，并逐滴加入2mL1.5mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，在30℃持續攪拌反應30min，所得微乳液采用與實施例1相同的方法后處理得大葉茜草素/殼聚糖納米微球。本實施例所制備的納米微球平均粒徑約為107nm，載藥量為14.67μg/mg，包封率為5.87％，PDI值為0.25，Zeta電位為47.7mV。附圖2是本實施例所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球的AFM圖。由AFM圖可以看出，制備得到的載藥微球球形規則，粒徑均一，分散良好，微球平均粒徑約為107nm。實施例3本實施例大葉茜草素/殼聚糖納米微球的制備方法如下：(1)將殼聚糖(脫乙酰度90％，分子量30萬)溶于含有0.5wt％泊洛沙姆188和1.2％(V/V)醋酸的水溶液中，配成3.0mg/mL的殼聚糖水溶液，然后用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，所得濾液經濃度為1mol/L的NaOH溶液調節pH值為4.5，得到殼聚糖組分液；(2)將大葉茜草素溶于無水乙醇中配成濃度為5.0mg/mL的大葉茜草素乙醇溶液，采用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，得到大葉茜草素組分液；(3)將1mL步驟(2)所得大葉茜草素組分液逐滴加入5mL步驟(1)所得殼聚糖組分液中，充分攪拌(攪拌速率為1600r/min)，并逐滴加入2mL3.0mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，在40℃持續攪拌反應60min，所得微乳液采用與實施例1相同的方法后處理即得大葉茜草素/殼聚糖納米微球。本實施例所制備的納米微球平均粒徑約為467nm，載藥量為28.153μg/mg，包封率為14.64％，PDI值為0.27，Zeta電位為48.73mV。附圖3是采用LEO1530型掃描電子顯微鏡所觀察到的本實施例所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球的SEM圖。由SEM圖可以看出，制備得到的載藥納米微球球形圓整，表面光滑，分散良好，粒徑均一，微球平均粒徑約 為467nm。實施例4大葉茜草素/殼聚糖納米微球清除自由基活性測試將二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)用無水乙醇配置成1mmol/L的工作液，實施例1、實施例2和實施例3所制備的納米微球亦分別用無水乙醇配成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL的懸濁液，待用。實驗時將3.5mL無水乙醇，400μLDPPH·溶液分別和100μL各懸濁液樣品混合均勻，37℃于暗處振蕩反應1h；3000r/min離心5min，使用UV4500紫外/可見分光光度計(美國PerkinElmer公司)檢測上清液在517nm處吸光值，以無水乙醇調零。結果表示為各懸濁液樣品對DPPH·自由基的清除率(％)＝(Ac－Ai)/Ac×100％(Ac為未加樣品的吸光值，Ai為加入樣品的吸光值)。實驗均重復三次，取平均值。附圖4是實例1-3所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球清除自由基活性圖。結果表明，載藥納米微球能清除自由基，而且載藥納米微球對自由基的清除率隨著濃度增加呈增強趨勢。實施例5大葉茜草素/殼聚糖納米微球及大葉茜草素對人肝癌細胞(HepG2)的細胞毒性測試將實施例1、實施例2和實施例3所制備的納米微球用高糖型DMEM細胞培養液配成1mg/mL溶液，超聲分散，現配現用；大葉茜草素用二甲基亞砜配置成5mg/mL溶液，然后用高糖型DMEM稀釋至5、15、30μg/mL，現配現用。收集對數期HepG2細胞，以1×105個/mL接種至96孔板中，每孔接種100μL；細胞培養至對數生長期，100μL/孔加入納米微球溶液和大葉茜草素溶液，每個濃度5孔，連續培養48h后，每孔避光加入20μL噻唑藍(5mg/mL)溶液，37℃培養4h；棄去孔內培養液，每孔加入100μLDMSO，37℃恒溫低速振蕩30min，使用酶標儀在490nm處檢測吸光值。結果表示為細胞存活率(％)＝(A1–Ai)/(A0–Ai)×100％(A0為對照孔的吸光值；A1為加藥孔的吸光值；Ai為調零孔的吸光值)。對比納米微球和裸藥(即大葉茜草素) 對HepG2細胞生長的抑制作用。附圖5是實例1-3所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球及大葉茜草素對人肝癌細胞(HepG2)存活率關系圖。由圖可知，所制備的納米微球能有效抑制HepG2細胞的生長，且實施例1、實施例2和實施例3所制備的載藥納米微球對HepG2細胞的細胞毒性均優于裸藥。實施例6大葉茜草素/殼聚糖載藥納米微球及大葉茜草素對人宮頸癌細胞(HeLa)的細胞毒性測試：將實施例1、實施例2和實施例3所制備的納米微球用高糖型DMEM細胞培養液配成1mg/mL溶液，超聲分散，現配現用；大葉茜草素用二甲基亞砜配置成5mg/mL溶液，然后用高糖型DMEM稀釋至5、15、30μg/mL，現配現用。收集對數期HeLa細胞，以1×105個/mL接種至96孔板中，每孔接種100μL；細胞培養至對數生長期，100μL/孔加入納米微球溶液和大葉茜草素溶液，每個濃度5孔，連續培養48h后，每孔避光加入20μL噻唑藍(5mg/mL)溶液，37℃培養4h；棄去孔內培養液，每孔加入100μLDMSO，37℃恒溫低速振蕩30min，使用酶標儀在490nm處檢測吸光值。結果表示為細胞存活率(％)＝(A1–Ai)/(A0–Ai)×100％(A0為對照孔的吸光值；A1為加藥孔的吸光值；Ai為調零孔的吸光值)。對比納米載藥微球和裸藥對HeLa細胞生長的抑制作用。附圖6是實例1-3所制備的大葉茜草素/殼聚糖納米微球及大葉茜草素對人宮頸癌細胞(HeLa)存活率關系圖。由圖可知，所制備的納米載藥微球能有效抑制HeLa細胞的生長，而且實施例1和實施例2所制備的載藥納米微球對HeLa細胞的細胞毒性優于裸藥。