綴合蛋白的聚合物膠束的制作方法與工藝

綴合蛋白的聚合物膠束發明領域本發明總體涉及藥物遞送技術，且更具體地涉及納米膠束藥物遞送系統，包括用于使用疏水性水不溶性蛋白和水溶性聚合物制備此系統的方法，該膠束可包括聚乙二醇(PEG)或可共價附著至疏水性水不溶性蛋白諸如谷醇溶蛋白的其他親水性部分以形成用于制備納米膠束藥物遞送系統的兩親的綴合物。背景信息約40％的藥物化合物具有差的水溶解性，其是新的藥物順利通過臨床試驗的主要限制因素(Lipinski(2002),AmPharmRev5:82-85)。已使用許多方法溶解疏水性藥物用于改善它們至患者的遞送。此類方法的一些實例包括研磨、與環糊精絡合、形成鹽、和使用表面活性劑或聚合物膠束。這些方法的每一種都具有某些優勢和劣勢，因此急切尋求改善的方法溶解藥物。聚合物膠束是自組裝的兩親的嵌段或接枝共聚物。聚合物膠束作為有前景的膠質藥物遞送系統已引起人們的重視(Torchilin,JControlledRelease2001,73,137；Allen等人,ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces1999,16,3；和Otsuka等人,CurrentOpinioninColloid&InterfaceScience2001,6,3)。在這些膠質系統中，疏水性嵌段通常形成核，本質上形成用于親脂性的貨物分子(cargomolecule)的“微容器”(Kataoka等人，Adv.DrugDeliveryRev.2001,47,113)。膠束的親水性部分形成穩定核與外部水環境之間的界面的外殼。與基于表面活性劑的膠束系統相比，基于聚合物的膠束能夠展示明顯的優勢諸如較低的臨界膠束濃度(CMC)和降低的毒性。盡管具備這些優勢，因為不適合的生物降解能力、生物相容性、包封率(encapsulationefficiency)、穩定性、制劑的臨床副作用、和與制備已知膠束制劑相關的難度與成本，已知膠束系統的使用某種程度上是有限的。因此，對具備與膠束藥物遞送系統相關的一些已知的優勢、但具有增加的生物相容性并是制備更容易的且更便宜的另外的膠束系統有需求。發明概述本發明提供了用于遞送水不溶性化合物的新的納米膠束平臺技術。還提供了用于使用疏水性水不溶性蛋白和水溶性聚合物制備膠束的方法，和使用膠束組合物例如，用于體內(invivo)藥物遞送的方法。聚乙二醇(PEG)或其他親水性部分可共價地附著于疏水性水不溶性蛋白諸如玉米醇溶蛋白，以形成用于制備納米膠束藥物遞送系統的非常有用的兩親性綴合物。因此，本發明提供了包括生物相容的和生物可降解的共聚物的膠束，其中該共聚物包括疏水性嵌段和親水性嵌段；疏水性嵌段包括共價綴合至親水性嵌段的疏水性谷醇溶蛋白且親水性嵌段包括具有至少約3kDa的分子量的親水性聚乙二醇部分；兩親的共聚物的谷醇溶蛋白鏈朝向膠束的內部，且兩親的共聚物的聚乙二醇部分朝向膠束的外部；且膠束的直徑為約10nm至約300nm。生物相容的和生物可降解的共聚物可包括接枝共聚物和/或嵌段共聚物。膠束在水中的臨界膠束濃度例如在約27℃下可以為約0.015g/L至約0.035g/L、約0.02g/L至約0.03g/L、或約0.25g/L。疏水性藥物可具有約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、或約1至約7、或來自從1至7的任何整數的范圍的LogP。疏水性谷醇溶蛋白可以是玉米醇溶蛋白、麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白、或其組合。親水性聚乙二醇部分可具有約4kDa至約220kDa的分子量。親水性聚乙二醇部分可具有約4kDa至約20kDa的分子量。膠束還可在膠束的核(core)中包括多個貨物分子。貨物分子可包括，例如，一種或多種藥物、蛋白、核酸、激素、受體、診斷劑、顯像劑(imagingagent)、或其組合。藥物可以是抗氧化劑、抗炎藥物或抗癌藥物。在一個實施方案中，藥物是姜黃素或阿霉素。在另外的實施方案中，顯像劑是尼羅紅。在另外的實施方案中，藥物是類視黃醇。適合的類視黃醇的實例包括視黃醇、13-反式-視黃酸(維甲酸)、13-順式-視黃酸(異維甲酸)、9-順式-視黃酸(阿利維A酸)、視黃醛、阿維A酯(etretnate)、阿維A、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素、玉米黃質、或其組合。本發明還提供了包括多個本文描述的膠束和藥學上或美容上可接受的稀釋劑、賦形劑、或載體的藥物或美容組合物。藥物或美容組合物可以，例如，以分散體、片劑、膠囊、注射制劑、氣霧劑制劑、凝膠、軟膏、乳膏、洗劑、或洗發劑的形式。本發明還提供了制備膠束的方法。該方法可包括將緩沖液添加至水懸浮液以從水醇溶劑中沉淀PEG化的谷醇溶蛋白以形成PEG化的谷醇溶蛋白的水分散體，并通過針對去離子水透析去除分散體中的乙醇和未反應的PEG和甘氨酸。本發明另外提供了制備膠束的方法，其中該方法包括從PEG化的谷醇溶蛋白的水懸浮液中去除乙醇以形成PEG化的谷醇溶蛋白的干膜；并將PEG-玉米醇溶蛋白膜重懸在水或緩沖液中，之后針對去離子水透析，例如，以去除未包封的疏水性分子，以在例如水和緩沖液組合物諸如分散體中提供多個膠束。在該方法中，玉米醇溶蛋白PEG化后，可通過例如在旋轉蒸發器中的蒸發將乙醇去除以形成干膜。隨后可將干膜在水中重構并針對去離子水透析，例如，以去除未包封的疏水性化合物，以在水相中形成膠束。因此，本發明還提供了通過以下制備本文描述的膠束的方法：將聚乙二醇化合物和谷醇溶蛋白溶解在水醇溶劑中以形成第一混合物；其中聚乙二醇化合物的一個末端是被單烷基取代的且另一個末端包括反應基，且聚乙二醇化合物具有至少約3kDa的分子量；加熱第一混合物以在水懸浮液中形成PEG化的谷醇溶蛋白，并任選地猝滅水懸浮液中聚乙二醇化合物的過量的反應基并通過針對去離子水的透析去除分散體中的乙醇和未反應的PEG和甘氨酸，之后冷凍干燥。方法的其余步驟可遵循兩個途徑之一。在一個實施方案中，該方法包括(a)將PEG-玉米醇溶蛋白添加至水醇溶劑中并通過針對去離子水的透析去除乙醇以在緩沖液和水組合物中形成多個膠束。在另一實施方案中，該方法包括(b)去除水懸浮液的乙醇以形成PEG化的谷醇溶蛋白的干膜；和將PEG化的谷醇溶蛋白的干膜重懸在水或緩沖液中，之后透析，例如，以去除未包封的疏水性化合物、以在水相中形成膠束。因此，在制備后，可將PEG-谷醇溶蛋白以特定的濃度溶解在水醇溶液中。當遵循膜制備法時，將乙醇去除以形成PEG-玉米醇溶蛋白膜。隨后用去離子水重構膜以形成PEG-玉米醇溶蛋白膠束。隨后可針對水透析該組合物以去除未包封的化合物。隨后，水分散體形成之后可通過冷凍干燥以獲得PEG-玉米醇溶蛋白膠束粉末。當遵循透析制備法時，通過針對去離子水的透析將乙醇去除以形成膠束。隨后可將水分散體冷凍干燥以提供PEG-玉米醇溶蛋白膠束粉末。因此，該方法可包括冷凍干燥組合物諸如分散體中的多個膠束以提供多個以粉末形式的分離的膠束。在任何制備方法中，有用的貨物分子，例如，治療劑或顯像劑可被溶解在溶劑系統中并可被添加至第一混合物，導致負載貨物的膠束的形成，諸如負載藥物的膠束。膠束的包封率可為約60％至約95％。該方法可包括將多個膠束分散在緩沖溶液中以提供負載藥物的膠束的治療組合物。在一個實施方案中，本發明提供了抑制細胞中細胞P-糖蛋白(P-pg)外排泵的方法，包括將細胞與多個本文描述的膠束接觸，從而抑制細胞中的細胞P-pg外排泵。在另一實施方案中，本發明提供了增強抗藥性癌細胞中治療劑的攝入的方法，包括將細胞與多個本文描述的膠束接觸，從而增強抗藥性癌細胞中治療劑的攝入。在另一實施方案中，本發明提供了增強親脂性化合物的水溶解性的方法，包括將親脂性化合物包封在如本文描述的膠束中，從而增強親脂性化合物的水溶解性。在另一實施方案中，本發明提供了增強化合物的化學穩定性的方法，包括將化合物包封在如本文描述的膠束中，從而增強化合物的化學穩定性。在另一實施方案中，本發明提供了提供化合物從組合物的緩釋的方法，包括將化合物包封在如本文描述的膠束中和將生物介質與被包封的化合物接觸，其中該化合物經約1小時至約14天的時間段從膠束被釋放。在另一實施方案中，本發明提供了以非免疫原性和生物相容的制劑向受試對象或樣品提供化合物的方法，包括將受試對象或樣品與本文描述的膠束或組合物接觸，從而向受試對象或樣品提供非免疫原性的和生物相容的制劑。在一方面，此制劑可改善被包封的化合物的體循環。在另一實施方案中，本發明提供了增加活性劑或顯像劑的皮膚滲入和保留的方法，包括將活性劑或顯像劑包封在如本文描述的膠束中和將皮膚與包括膠束的組合物接觸，從而與不存在膠束時的活性劑或顯像劑的皮膚滲入相比增加活性劑或顯像劑的皮膚滲入。在另一實施方案中，本發明提供了增強藥物的腫瘤積累的方法，包括將藥物包封在如本文描述的膠束中，和將多個膠束施用至患有腫瘤的受試對象，其中被包封的藥物在腫瘤處積累至比在膠束不存在時被施用至受試對象的藥物更大的程度。在另一實施方案中，本發明提供了減少藥物在哺乳動物中的不具有腫瘤的組織中積累的方法，包括將藥物包封在如本文描述的膠束中，和將多個膠束施用至患有腫瘤的受試對象，其中被包封的藥物在不具有腫瘤的組織中的積累至比在膠束不存在時被施用至受試對象的藥物更低的程度。在另一實施方案中，本發明提供了增加藥物效力的方法，包括將多個如本文描述的被負載的膠束施用至受試對象，其中與膠束不存在時藥物的施用相比，該藥物的效力是增加的。在又另一實施方案中，本發明提供了減少藥物毒性的方法，包括將多個如本文描述的被負載的膠束施用至受試對象，其中與膠束不存在時藥物的施用相比，該藥物的毒性是降低的。本發明還提供了式I的共聚物：Z-(PEG)n(I)其中Z是谷醇溶蛋白，“PEG”是具有至少約3kDa分子量的聚乙二醇部分，且n為約1至約100、或約5至約50。谷醇溶蛋白可以是，例如，白玉米醇溶蛋白、黃玉米醇溶蛋白、麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白、或高粱醇溶蛋白。具有不同的分子量的多種PEG部分可綴合至谷醇溶蛋白。例如，PEG部分的分子量可以為1kDa至約220kDa、約2kDa至約20kDa、約3kDa至約20kDa、約4kDa至約20kDa、約4kDa至約10kDa、或約5kDa。式I可包括谷醇溶蛋白和PEG的接枝共聚物；和谷醇溶蛋白和PEG的嵌段共聚物(二嵌段或多嵌段共聚物，諸如三嵌段共聚物)。實例包括式II-V：Z-g-PEG(接枝共聚物)(II)Z-b-PEG(二嵌段共聚物)(III)Z-b-PEG-b-Z(三嵌段共聚物)(IV)PEG-b-Z-b-PEG(三嵌段共聚物)(V)式I的共聚物是用于制備可在藥物遞送應用諸如用于遞送疏水性治療劑中使用的聚集體的有用的中間體。本發明還提供了包括在液體懸浮液、分散體或溶液中的多個如本文描述的共聚物或膠束的組合物，諸如I.V.制劑。本發明還提供了用于制備本發明的包封物(encapsulate)的方法，包括在溶劑或溶劑系統中組合多個式I的共聚物和分子(例如，治療劑)，和允許式I的共聚物圍繞分子聚集，以提供包封物(即分子被多個式I的共聚物包封或環繞)。本發明還提供了包括稀釋劑和從環繞分子(例如，治療劑)的多個式I的共聚物形成的膠束的組合物。本發明還提供了包括本發明的包封物(即，被多個式I的共聚物包封或環繞的治療劑，諸如在膠束中)；和藥學上可接受的載體的藥物組合物。可選地，治療劑可綴合或絡合至疏水性核中的谷醇溶蛋白和/或至親水性共聚物殼。膠束還可被用于包封多種治療劑，和/或多種治療劑可被絡合/綴合至核和/或殼。除了治療劑或代替治療劑，膠束還可被用于攜帶診斷和/或顯像劑，和類似的。本發明還提供了用于遞送治療劑至需要用該劑治療的動物的方法，包括將本發明的包封物施用至動物，其中包封物包括式I的共聚物的膠束組裝物內部的治療劑。本發明還提供了本文描述的膠束組合物在藥物治療中使用的用途。藥物治療可以是治療癌癥、例如，乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、或結腸癌。本發明還提供了本文描述的膠束組合物用于治療此類癌癥的藥劑的制造的用途。藥劑可包括藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑、或載體。本發明還提供了用于皮膚和毛囊障礙諸如痤瘡的治療，并可被用于脫發、皮脂溢性濕疹、毛囊炎、皮膚惡性腫瘤、牛皮癬、角質化障礙、皮膚色素減退、創傷、和光老化的治療。附圖簡述下面的附圖形成說明書的部分并被包括以進一步說明本發明的某些實施方案或不同的方面。在某些情況下，本發明的實施方案可通過參考附圖結合本文呈現的詳述被最佳理解。描述和附圖可強調某個特定的實例，或本發明的某個方面，然而，本領域的技術人員將理解實例或方面的部分可與本發明的其他實例或方面結合被使用。圖1根據實施方案示意性說明負載藥物的PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束的形成。圖2根據實施方案說明描繪用于兩親性PEG-玉米醇溶蛋白的制備的一般步驟的流程圖。圖3根據一個實施方案說明描繪用于兩親性PEG-玉米醇溶蛋白的制備的特定步驟的流程圖。在這個和其他圖中所列舉的特定的量是用于說明特定的實施方案，且本領域技術人員容易認識的是，許多變化可應用至本文描述的步驟。圖4說明通過(a)FTIR和(b)尺寸排阻色譜的PEG-玉米醇溶蛋白綴合物的表征。在NICOLET380ATR-FTIR分光光度計(THERMOELECTRONCorporation,Madison,WI)中以2cm-1的分辨率在ZnSe晶體上記錄玉米醇溶蛋白、PEG-酯、和PEG-玉米醇溶蛋白(每一個5mg)的FTIR光譜。每一個光譜為平均100次掃描。使用OMNIC軟件分析官能團的峰位置。在HPLC(BECKMANCOULTER,Brea,CA)系統中使用PHENOMENEXBISEPSEC-S20004.6mmx3000色譜柱(Torrance,CA)實施SEC。使用0.5mL/min的流速，使用70％(v/v)乙醇作為流動相將樣品分開。在280nm處監測色譜柱洗脫液。圖5描繪了PEG-玉米醇溶蛋白在(a)DMSO和(b)D2O中的1HNMR光譜。在圖5(a)中，在3.56ppm處觀察到PEG的亞乙基并在3.36ppm處觀察到蛋白/酰胺峰。在圖5(b)中，在3.56ppm處觀察到PEG的亞乙基鍵，而在3.36ppm處不存在蛋白/酰胺峰，因為疏水性玉米醇溶蛋白核不溶于D2O。圖6說明當稀釋時，PEG-玉米醇溶蛋白膠束的穩定性；PEG-玉米醇溶蛋白膠束在10mM檸檬酸鹽緩沖液pH7.4中的2mg/mL的儲存分散體被稀釋20、100、200、500、和1000倍，并在粒徑分析儀(NICOMP380ZLSZetaPotentialAnalyzer,ParticleSizingSystems,SantaBarbara,CA)中確定了膠束的大小。數據顯示膠束在稀釋時是穩定的，因為膠束的大小沒有顯著改變。每一個數據點是三次實驗的平均值±SD。圖7說明在激發波長為339nm和334nm(發射波長為390nm)的芘的吸光度(0.6μM)的比率對PEG化的玉米醇溶蛋白對數濃度(g/L)的繪圖。因為PEG化的玉米醇溶蛋白的濃度的增加，在臨界膠束濃度(CMC)處的芘的吸光度的強度顯著改變。PEG化的玉米醇溶蛋白在27℃時的CMC為0.025(g/L)。圖8說明在小鼠中體內施用PEG-玉米醇溶蛋白膠束后的免疫應答。在第一劑量的第三周并在激發劑量后的第5周后測量血清中的抗玉米醇溶蛋白抗體(光學密度在y軸)。將鹽水或PEG-玉米醇溶蛋白膠束(100μg/50μL)皮下施用至小鼠。結果表示為平均值±平均值的標準誤差(n＝4)。PEG-玉米醇溶蛋白膠束沒有產生任何抗玉米醇溶蛋白抗體且值與鹽水對照相似。圖9根據實施方案說明使用膜方法制備負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的步驟。圖10根據實施方案說明使用透析方法制備負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的步驟。圖11說明用1％w/v的乙酸雙氧鈾陽性染色負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的透射電子顯微鏡照片(TEM)。標尺lmm＝0.05gm。圖12說明負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束在非輕敲模式中以2μm的掃描速率的原子力顯微術(AFM)圖像。從左至右分別為具有88nm的z-縮放(scale)、0.39V、和61°的代表性樣品的2D形貌(topography)、振幅(amplitude)、和相位(phase)圖像。在AFM中測量的100個粒子的平均粒徑為90±10nm。圖13說明甲醇、PBSpH7.4(具有10％甲醇)中的姜黃素(10μg/mL)和PBSpH7.4中負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的UV-可見光光譜。負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白的吸光度和溶解在甲醇中的姜黃素的吸光度是相似的，顯示負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的增加的水溶解性。圖14說明甲醇、PBSpH7.4(具有10％甲醇)中的姜黃素(10μg/mL)和PBSpH7.4中負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的熒光光譜。姜黃素的發射光譜的λmax從540nm至525nm的位移顯示姜黃素被捕獲在膠束中。由于姜黃素的顯著增強的水溶解性，在PEG化的玉米醇溶蛋白膠束捕獲之后，水中的姜黃素熒光同樣顯著增加(約4倍)。圖15說明玉米醇溶蛋白、姜黃素、空白PEG-玉米醇溶蛋白、mPEG-酯、和負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的差示掃描量熱法(DSC)熱分析圖。圖16說明姜黃素從檸檬酸鹽緩沖液pH7.4中的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外釋放曲線(平均值±SE；n＝3)。通過本文描述的透析方法制備負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(1mg/mL)，在離心管中1mL檸檬酸鹽緩沖液pH7.4中孵育，并將懸浮液在水平水浴搖床中以50rpm保持在37℃。將樣品在12,000rpm離心12分鐘。隨后將上清液用于使用HPLC分析姜黃素從PEG-玉米醇溶蛋白膠束的釋放。使用C18色譜柱(WATERSTMCorporation,MA,USA)且流動相由60％乙腈和40％檸檬酸鹽緩沖液(使用50％(w/w)氫氧化鈉溶液調節到pH3.0的1％(w/v)檸檬酸溶液)組成。流速為1.0mL/min且檢測波長為420nm。實施釋放研究24小時。每一個數據點是三次實驗的平均值±SD。圖17說明姜黃素(溶解在10％DMSO中)和姜黃素膠束的體外細胞毒性曲線。用濃度范圍為7.8nM至500nM的姜黃素溶液或姜黃素膠束處理抗藥性的NCl/ADR-RES抗藥性人卵巢癌細胞(2000個細胞每孔)4天。在第五天使用MTT分析執行細胞毒性分析。數據點代表平均值±SE(n＝4)。姜黃素溶液(Curcu-soln)和姜黃素膠束(Curcu-M)的IC50值分別為104nM和34nM。圖18說明使用切除的豬皮膚在垂直擴散池中處理不同的時間段后，游離姜黃素(PBS中10％TWEEN80，pH7.4；在圖中表示為“C”)和被包封的姜黃素(PBS中，pH7.4；在圖中表示為“CM”)的體外皮膚滲入。切除的豬皮膚被夾在垂直擴散池的兩個室之間。由磷酸鹽緩沖液(pH7.4具有20％乙醇)組成的接受介質被維持在37℃并使用磁珠攪動。沖洗皮膚并使用SCOTCHTAPE膠帶剝離15-20次以去除角質層(SC)。使用90％乙醇從剝離的膠條和剩余的皮膚(有活力的表皮+真皮)提取姜黃素。通過HPLC方法確定皮膚中和接受相中姜黃素的量。圖19說明用游離姜黃素(a)和被包封在PEG-玉米醇溶蛋白膠束中的姜黃素(b)處理6小時后豬皮膚的共聚集熒光XZ光學掃描圖像(0-100μm深)和姜黃素膠束(c)通過毛囊的滲入(xy表面視圖)和(d)角質層(SC)和有活力的表皮中定量的姜黃素熒光像素。將對于SC0-20μm和對于表皮20-100μm的XZ光學切片用于定量熒光像素。圖20根據實施方案說明使用膜方法制備負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的步驟。圖21根據實施方案說明使用透析方法制備負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的步驟。圖22說明用1％w/v的乙酸雙氧鈾陽性染色負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的透射電子顯微鏡照片(TEM)。標尺lmm＝0.11μm。圖23說明負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束在非輕敲模式中以2μm的掃描速率的原子力顯微術(AFM)圖像。從左至右為具有228nm的z-縮放、0.64V、和71°代表性樣品的2D形貌、振幅、和相位圖像。100個粒子的平均粒徑為125±15nm。圖24分別說明磷酸鹽緩沖液pH7.4中的阿霉素(10μg/mL)、90％乙醇中的阿霉素、和PBSpH7.4中負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的UV-可見光光譜。由于PEG玉米醇溶蛋白膠束中阿霉素的增強的水溶解性，負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白的吸光度比溶解在90％v/v乙醇中的阿霉素的吸光度要高。圖25分別說明磷酸鹽緩沖液pH7.4、90％乙醇中的阿霉素(10μg/mL)、和PBSpH7.4中負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的熒光光譜。由于阿霉素的顯著增強的水溶解性，在PEG化的玉米醇溶蛋白膠束捕獲之后PBSpH7.4中的阿霉素熒光顯著增加(約50倍)。圖26說明玉米醇溶蛋白、阿霉素、空白PEG-玉米醇溶蛋白、mPEG-酯、和負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的差示掃描量熱法(DSC)熱分析圖。圖27說明阿霉素從檸檬酸鹽緩沖液pH7.4中的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外釋放曲線(n＝3；±SEM)。將負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(1mg/mL)在離心管中1mL檸檬酸鹽緩沖液pH7.4中孵育并將懸浮液在水平水浴搖床中以50rpm保持在37℃。將樣品在12,000rpm離心12分鐘。使用HPLC分析分析上清液中阿霉素從PEG-玉米醇溶蛋白膠束的釋放。使用了C18色譜柱(WATERSTMCorporation,MA,USA)及以1mL/min流速的由三氟乙酸(0.1％v/v)和乙腈5％v/v(～3min,80％v/v～11min和5％v/v～22分鐘)組成的流動相。使用熒光檢測器(分別是505nm作為激發且550nm作為發射波長)。實施釋放研究24小時。每一個數據點是三次實驗的平均值±SD。圖28說明阿霉素基(base)(溶解在90％v/v乙醇中)和PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外細胞毒性曲線。用15.62nM至1000nM的濃度范圍的阿霉素溶液(Dox-soln)和負載阿霉素的膠束(DoxM)處理MCF-7人乳腺癌細胞(2000個細胞每孔)4天。在第5天時使用MTT分析執行細胞毒性分析。數據點代表平均值±SE(n＝4)。阿霉素和阿霉素膠束的IC50值分別為148nM和30nM。圖29說明阿霉素基(溶解在90％v/v乙醇中)和負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外細胞毒性曲線。用濃度范圍為31.25nM至1000nM的阿霉素溶液(Dox-soln)或阿霉素膠束(Dox-M)處理抗藥性的NCl/ADR-RES抗藥性人卵巢癌細胞(2000個細胞每孔)4天。在第5天時使用MTT分析測量細胞毒性分析。數據點代表平均值±SE(n＝4)。阿霉素和阿霉素膠束的IC50值分別為126nM和29nM。圖30說明溫度對NCl/ADR-RES細胞系中負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的細胞攝入的影響。將細胞在4℃預培養2小時。2小時后用PBSpH7.4沖洗細胞兩次，用負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(相當于5μg/mL的阿霉素)處理。兩小時后，將處理去除并用冰冷的PBSpH7.4沖洗細胞兩次，并使用HPLC分析評價細胞裂解物中阿霉素含量的量。在對照組，將細胞在37℃孵育。每一個值代表平均值±SE(n＝3)。與在37℃的細胞攝入相比，在4℃的細胞攝入顯著較低(p<0.05；學生t-檢驗)。圖31說明NCl/ADR-RES細胞系(50000細胞/板)中負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束和阿霉素溶液(51Lig/mL)的細胞攝入動力學。數據點代表三次實驗的平均值±SE。圖32說明抗性的人癌細胞中PEG-玉米醇溶蛋白膠束的細胞攝入的機制。將NCl/ADR-RES細胞(5000細胞/孔)用PLURONICF68(1mg/mL；陽性對照；已知的抑制P-糖蛋白(P-gp)的嵌段共聚物)、和空白PEG-玉米醇溶蛋白膠束(0.050mg/mL)處理。在37℃孵育30分鐘之后，添加50μL的0.25μM/L的鈣黃綠素AM。在室溫下使用酶標儀(485/589激發/發射波長)每5分鐘測量熒光持續1小時。P-gp抑制按照以下計算：％相對熒光＝100×(FL處理-FL未處理)/FL未處理)。數據點代表平均值±SE(n＝8)。對于空白PEG-玉米醇溶蛋白膠束觀察到較高的P-gp抑制。圖33說明小鼠同種異體移植乳腺腫瘤小鼠模型中阿霉素溶液和負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(在鹽水中)的體內生物分布。通過JC小鼠乳腺癌細胞的皮下注射形成腫瘤模型。通過尾靜脈注射給予阿霉素溶液或膠束(4.5mg/kg)。在施用處理后3小時處死動物。收集腫瘤和器官。使用基于熒光的梯度HPLC方法確定腫瘤和器官中的阿霉素濃度。將阿霉素含量歸一化到器官重量(n＝3-4，±SEM)。膠束導致較高的至腫瘤的分布和在其他器官中的顯著較低的分布。阿霉素已知造成心臟毒性和腎毒性。結果顯示膠束導致阿霉素的增強的效力和降低的毒性。圖34說明抗藥性腫瘤同種異體移植小鼠腫瘤模型中阿霉素溶液和負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體內抗癌效力。將具有皮下JC小鼠乳腺癌細胞的雌性BALB/C用于研究。在第0天和第7天時通過靜脈(i.v.)注射將小鼠注射阿霉素溶液或膠束(3mg/kg)。隔天測量腫瘤體積。使用公式(處理后的腫瘤體積/處理前的腫瘤體積)×100計算腫瘤體積減小的百分數。數據表示為平均值±SEM，n＝4-5每組；*指示與其他處理相比，該值在p<0.05時是顯著的。除了阿霉素膠束組之外，所有其他處理組中的小鼠在7天后都沒有存活。當施用阿霉素膠束時，腫瘤生長緩慢，預示膠束制劑的較大的效力。BM指的是空白膠束；Dox-Soln指的是阿霉素溶液；且Dox-M指的是負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束。圖35說明具有同種異體乳腺腫瘤的BALB/C小鼠的Kaplan-Meier存活圖。通過靜脈注射(6mg/kg)，在第0天和7天以分劑量用阿霉素溶液或阿霉素膠束注射具有皮下JC腫瘤的雌性BALB/C。使用GraphPad5軟件繪制動物的存活百分數。數據是每組4-5只動物的平均值。小鼠的死亡率以Dox膠束(Dox-M)<Dox-溶液(Dox-Soln)<鹽水<空白膠束(BM)的遞增的順序。數據顯示因為制劑的增強的效力，阿霉素膠束導致更大的存活。圖36根據實施方案說明使用透析方法制備負載尼羅紅的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的步驟。圖37說明表皮和角質層中尼羅紅的量(n＝3)。使用被夾在垂直擴散池(PERMEGEARTM,Hellertown,PA)的兩個室之間的皮片(dermatomed)的豬皮膚實施體外研究。將100μL的5％v/vTween-80溶液中的尼羅紅(250ng)或水中的負載尼羅紅的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(250ng)添加至供應室。由PBSpH7.4組成的接受室被維持在37℃并用磁力攪拌棒攪動。6小時后將皮膚移出并使用共聚焦激光掃描顯微術(FLUOVIEWFV300TM,Olympusix70,Olympus,CenterValley,PA)測量熒光像素。使用FLUOVIEWTM軟件(Olympus,CenterValley,PA)分析光學切片(xyz)的角質層(0-15μm)和有活力的表皮(20-100μm)中的熒光強度。圖38根據一個實施方案通過流程圖說明使用透析方法制備負載視黃醇的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的一般步驟。在圖38-39和43-46中，BHT指的是丁化羥基甲苯(2,6-二-叔丁基-4-甲基苯酚)。圖39根據一個實施方案通過流程圖說明使用膜方法制備負載視黃醇的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的一般步驟。圖40從左至右說明游離的視黃醇和負載視黃醇的納米膠束的水分散性。圖41說明視黃醇從磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束的體外釋放。通過UV-可見光分光光度法在320nm處測量視黃醇的濃度。每一個數據點是平均值±SD(n＝3)(平均值±SEM；n＝3)。圖42從左至右說明游離的視黃醇、冷凍干燥的和視黃醇膠束。該圖顯示純視黃醇的吸濕性和視黃醇膠束是未吸濕的自由流動粉末。圖43說明當儲存在正常的室內光線下時負載視黃醇納米膠束的固態穩定性。將游離的視黃醇和視黃醇膠束存放在透明的玻璃小瓶中并暴露于室內光線一周。通過UV-可見光分光光度法在320nm處測量了不同時間點的剩余的視黃醇(平均值±SD；n＝3)。圖44說明當儲存在儲存在不存在光時，負載視黃醇的納米膠束的固態穩定性。將游離的視黃醇和視黃醇膠束存放在透明的玻璃小瓶中并儲存在暗箱中一周。通過UV-可見光分光光度法在320nm處測量了不同時間點的剩余的視黃醇(平均值±SD；n＝3)。圖45說明當儲存在正常的光線下時，負載視黃醇的納米膠束的液態穩定性。將游離的視黃醇和視黃醇膠束分散在磷酸鹽緩沖液中(pH7.4)并在室內光線中儲存在透明的玻璃小瓶一周。通過UV-可見光分光光度法在320nm處測量了不同時間點的剩余的視黃醇(平均值±SD；n＝3)。圖46說明當在暗箱避光儲存時，負載視黃醇的納米膠束的液態穩定性。將游離的視黃醇和視黃醇膠束分散在磷酸鹽緩沖液中(pH7.4)并在暗箱中儲存在透明的玻璃小瓶一周。通過UV-可見光分光光度法在320nm處測量了不同時間點的剩余的視黃醇(平均值±SD；n＝3)。圖47說明用游離的視黃醇和被包封在PEG-玉米醇溶蛋白膠束中的視黃醇處理后，在48小時結束時豬皮膚中和接受介質中的應用的視黃醇的百分數。切除的豬皮膚被夾在垂直擴散池的兩個室之間。由磷酸鹽緩沖液(pH7.4)組成的接受介質維持在37℃并使用磁珠攪動。將游離的或被包封的視黃醇在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的分散體裝載在供應室中。在研究結束時，通過使用3H標記的視黃醇的放射化學方法測量皮膚和接受室中的視黃醇濃度。用0.1M氫氧化鈉消化皮膚以確定視黃醇濃度(平均值±SD；n＝6)。圖48說明用游離的視黃醇和包封視黃醇的膠束處理后，在48小時結束時豬皮膚中和接受介質中的應用的視黃醇的百分數。被切除的豬表皮(Epi)被放置在垂直擴散池的兩個室之間。在第二組實驗中，將角質層從豬表皮移出并隨后物理放置(被莢在)豬表皮(Sand)上并被用于研究。將游離的視黃醇和視黃醇膠束應用在皮膚上并將研究進行48小時。由磷酸鹽緩沖液(pH7.4)組成的接受介質維持在37℃并使用磁珠攪動。將游離的或被包封的視黃醇在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的分散體裝載在供應室中。在研究結束時，通過使用3H標記的視黃醇的放射化學方法測量皮膚和接受室中的視黃醇濃度。用0.1M氫氧化鈉消化皮膚以確定視黃醇濃度(平均值±SD；n＝6)。圖49說明儲存在室溫和49℃一個月時間段的具有鋁箔覆蓋的玻璃小瓶中的視黃醇膠束乳膏制劑的穩定性。定期將等分的制劑移出并使用HPLC分析視黃醇的含量。制劑保持穩定并在室溫中沒有顯示任何顯著的降解。每一個小瓶是平均值±SD；n＝3。圖50說明游離的視黃醇(實心圓形)和視黃醇膠束(實心三角形)從pH7.4的乳膏制劑中的體外釋放。圖51說明視黃醇乳膏制劑在人皮膚中的體外皮膚滲入。圖52說明在應用游離的和被包封的視黃醇膠束乳膏制劑之后小鼠中經表皮水分丟失(TEWL)值。十二烷基硫酸鈉(SLS)，已知的皮膚刺激劑，被用作陽性對照，且陰性對照組不經過任何處理。圖53說明在SKH-1無毛的小鼠中處理6小時后，游離的和納米粒子包封的視黃醇的體內局部生物利用率。圖54說明制備負載尼羅紅的酪蛋白膠束的步驟。圖55說明用游離的尼羅紅和被包封在酪蛋白膠束中的尼羅紅處理6小時后不同的皮膚層中的熒光像素。使用了關于角質層(SC)0-20μm和關于表皮20-100μm的XZ光學切片用于定量熒光像素。發明詳述疏水性植物蛋白玉米醇溶蛋白，屬于谷醇溶蛋白家族并是水不溶性的。玉米醇溶蛋白已被研究作為用于藥物、食品、和美容行業中的多種劑的緩釋的聚合物(Shukla和Cheryan(2001),IndCropsProd13:171-192)。玉米醇溶蛋白還被用于使涂層材料成膜和形成粒子系統諸如微米粒子或納米粒子。聚乙二醇(PEG)是水溶性的、生物相容的、FDA批準的由多個乙二醇單元通過酯鍵連接組成的聚合物。申請人已發現多種兩親的蛋白綴合物能夠自組裝以形成穩定的、生物相容的、且生物可降解的膠束組裝物，如圖1中示意性說明的。膠束可在膠束核中具有或不具有貨物分子的情況下被形成。還發現玉米醇溶蛋白如圖2和3中描述的共價附著于聚乙二醇(PEG)。空白(未負載藥物)或負載藥物的PEG化的玉米醇溶蛋白在水環境中自組裝以形成具有疏水性核和親水性殼的納米膠束(～100nm)。可使用其他疏水性蛋白替代玉米醇溶蛋白，例如，源自多種來源包括植物、動物和合成的來源的蛋白。相似地，其他水溶性聚合物諸如本文描述的聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸、及其他，可綴合至疏水性蛋白以制備納米膠束。多種水不溶性的疏水性分子(例如，治療劑或“藥物”)可被包封在納米膠束的核內，且在膠束的冠(corona)處的親水性聚合物鏈有助于將溶解藥物在水環境中，諸如人體。另外，用抗衡離子中和的帶電分子可被包封在本文描述的膠束的疏水性核內。可選地，當帶電的官能團被引入疏水性核或親水性殼時，帶電分子可通過靜力相互作用絡合至核和/或殼。例如，陽離子聚合物諸如聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、和類似的，附著至膠束核和/或殼可被用于絡合帶負電荷的DNA或寡核苷酸。相似地，親水性分子可被化學修飾(例如，成為前體藥物或鹽的形式)以提供用于在膠束的核中包封的疏水性實體(entity)。在實施方案中，蛋白上的總電荷可通過調節pH在谷醇溶蛋白的pI以上或以下(例如，玉米醇溶蛋白的pI在約5和9之間；麥醇溶蛋白的pI約6.8)被改變。定義：如本文所用的，敘述的術語具有以下的含義。本說明書中使用的所有其他術語和短語具有如本領域技術人員將理解的它們的通常含義。此通常含義可通過參考技術詞典獲得，諸如Hawley'sCondensedChemicalDictionary第14版,R.J.Lewis,JohnWiley&Sons著,NewYork,N.Y.,2001。本說明書中涉及的“一個實施方案”、“實施方案”等，指示描述的實施方案可包括特定的方面、特征、結構、部分、或表征，但不是每個實施方案都必然包括那個方面、特征、結構、部分、或表征。此外，此類短語可以，但不必然，指的是涉及本說明書的其他部分的相同的實施方案。而且，當描述與實施方案有關的特定的方面、特征、結構、部分、或表征時，影響或連接此方面、特征、結構、部分、或表征與其他實施方案在本領域技術人員的知識內，無論是否明確被描述。術語“包括(comprising)”、“包括(including)”、“具有”、“包含(containing)”、“特征在于”和其語法上等同物，是包含的或開放式的術語，其不排除另外的、未列舉的要素或方法步驟，但還包括更多限制性的術語“由…組成”和“基本上由…組成”。單數形式“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”包括復數所指除非上下文另有清楚規定。因此，例如，提及“化合物”(例如，藥物)包括多個此類化合物，所以化合物X包括多個化合物X。作為另外的實例，提及“膠束”可包括多個此膠束、且提及“分子”是提及多個分子、和其等同物。進一步注意的是權利要求可以被設計以排除任何任選的要素。正因如此，該申明意圖用作使用與權利要求要素的列舉有關的排外的術語諸如“單獨地”、“僅僅”、和類似的或使用“否定(negative)”限制的前期基礎。術語“和/或”意思是條目(item)的任一個、條目的任何組合、或所有與該術語相關的條目。短語“一個或多個”容易被本領域技術人員理解，特別是當在上下文中閱讀它的用法。例如，苯基環的一個或多個取代基指的是一個至五個、或一個至四個，例如如果苯基環是雙取代的。術語“約”可以指指定值的±5％、±10％、±20％、或±25％的變化。例如，一些實施方案中“約50％”可攜帶從45％至55％的變化。關于整數范圍，術語“約”可包括大于和/或小于所列舉的整數的一個或兩個整數。除非本文另有說明，術語“約”意圖包括臨近所列舉范圍的在單個成分、組合物、或實施方案的功能方面等同的值，例如，重量百分數。另外，除非本文另有說明，所列舉的范圍(例如，重量百分數或碳基團)包括范圍內每個特定值或恒等式(identity)。將被技術人員理解的是，所有的數字，包括表達成分的量、特性諸如分子量、反應條件等等的那些，是近似值并被理解為在一切情況下任選通過術語“約”被修飾。這些值可取決于旨在通過本領域技術人員利用本文描述的教導獲得所需的特性而不同。同樣被理解的是此類值固有包含必然由在它們的各自的測試測量結果中發現的標準差產生的可變性。將被本領域技術人員理解的是，用于任何和所有的目的，特別是根據提供的書面描述，本文所列舉的所有范圍還包含任何和所有的可能子范圍和其子范圍的組合，和組成范圍的單個值，特別是整數值。所列舉的范圍(例如，重量百分數或碳基團)包括范圍內的每一個特定值、整數、小數、或恒等式。任何所列出的范圍能夠容易被識別作為充分描述并使相同的范圍能夠分解為至少相等的兩等份、三等份、四等份、五等份、或十等份。作為非限制性實例，本文討論的每一個范圍都可容易被分解為下部三分之一、中部三分之一和上部三分之一，等。還將被本領域技術人員理解的是，所有語言諸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或更多”、和類似的，包括所列舉的數量且此類術語指的是能夠如以上討論的被隨后分解為子范圍的范圍。以相同的方式，所有本文列舉的比率還包括落入較寬的比率內的所有子比率。因此，所列舉的自由基、取代基的特定的值，僅用于說明；它們不排除其他被定義的值或在自由基和取代基的被定義的范圍內的其他值。本領域技術人員還將容易認識其中以共同的方式將成員集合在一起，諸如Markush組，本發明不僅包含所列出的作為整體的全部組，還單獨包含該組的每一個成員和主要組的所有可能的亞組。另外，為了所有目的，本發明不僅包括主要組，還包括缺少一個或多個組成員的主要組。本發明因此設想所列舉的組的任何一個或多個成員的明確排除。因此，限制性條款可適用于任何公開的類別或實施方案，據此任何一個或多個所列舉的要素、物種、或實施方案可從此類別或實施方案中被排除，例如，如在明確否定限制中使用的。術語“玉米醇溶蛋白”指的是一類谷醇溶蛋白。谷醇溶蛋白在多種谷物諸如玉米、小麥、大麥、水稻、和高粱，及其他植物和動物中被發現。谷醇溶蛋白的其他實例包括麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白。在本文描述的多個實施方案中，這些谷醇溶蛋白可更換為玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白由高比例的非極性氨基酸諸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺組成，并具有約22-27kDa的分子量(Shukla,Zein:theindustrialproteinfromcorn.Ind.Crops.Prod.13,171-92；2001)。玉米醇溶蛋白的典型的樣品可具有約20％亮氨酸、10％脯氨酸、21-26％谷氨酰胺、5％天冬酰胺、和10％丙氨酸，因此其氨基酸組成的至少約61％是疏水性氨基酸。這些疏水性氨基酸使得蛋白是水不溶性的。玉米醇溶蛋白是生物可降解的US-FDA批準的GRAS聚合物(Fed.Register(1985)50:8997-8999)。玉米醇溶蛋白可從玉米蛋白粉中被加工為粉末。純的玉米醇溶蛋白是無氣味的、無味的、水不溶性的、且可食用的、使得其成為用于加工食品和藥品的重要成分的特性。用于分離、加工、和使用玉米醇溶蛋白的方法是本領域眾所周知的。見例如，Lawton,CerealChem2002,79(1):1-18，和WO2009/137112(Perumal等人)，其通過引用并入本文。玉米醇溶蛋白的“等級”指的是玉米醇溶蛋白的多種類型或形式，包括通過多種方法衍生的白玉米醇溶蛋白和黃白玉米醇溶蛋白，諸如美國專利號5,254,673(Cook等人)中公開的，其內容通過引用并入本文。術語“PEG”或“聚乙二醇”指的是水溶性的、生物相容的、FDA批準的由多個乙二醇單元通過酯鍵連接組成的聚合物。PEG鏈或部分的分子量可從約1kDa至約220kDa而不同，例如，約1kDa至約15kDa，取決于鏈中乙二醇單元的數量。PEG部分可被表示為-(OCH2CH2)nOH或-(OCH2CH2)nOR基團，其中n為2至約1,000且R為烷基、芳香基、或芳烷基(arylalkyl)諸如甲基、乙基、叔丁基、苯基、或芐基。PEG部分可通過末端羥基附著至蛋白，例如，當用琥珀酸酯活化時。在多種實施方案中，PEG鏈的分子量可以約1kDa至約220kDa。在某些實施方案中，PEG基團可具有約1000至約20,000、約4,500至約20,000；約5,000至約18,000、約5,000至約12,000；或約4,000至約9,000的分子量。在其他實施方案中，PEG基團可具有約4,000、5,000、6,000或約7,000的分子量。PEG基團還可在其末端用保護基團封端，諸如乙酰基基團或烷基基團，例如甲基或乙基基團。具有不同的末端基團的PEG異雙官能團也可被用于PEG化。PEG異雙官能團的實例包括HO2C-PEG-OH；HC(＝O)-PEG-SH，和類似的。除了線性PEG部分之外，包括PEG鏈的分支部分也可被用于谷醇溶蛋白的PEG化。能夠綴合至玉米醇溶蛋白的多種PEG部分的實例被Roberts等人描述(Adv.DrugDeliv.Rev.54:459-476,2002)并在以下說明。基于PEG2三嗪的分支的PEG基團：其中R-NH2的氨基是谷醇溶蛋白側鏈上的或末端基的氨基。能夠綴合至谷醇溶蛋白的其他PEG部分包括：1)分支的PEG(PEG2)；2)線性叉狀PEG；和/或3)分支叉狀PEG：其中Y是具有碳分支部分的基團且X是谷醇溶蛋白的原子、至谷醇溶蛋白的接頭、或谷醇溶蛋白的官能團。聚乙二醇部分或其他聚(烯化氧)可通過本領域眾所周知的多種技術綴合至玉米醇溶蛋白(見例如，Francesco等人(2005),DrugDiscovToday10,1451-1458)。綴合物形成的一個實例包括將谷醇溶蛋白諸如玉米醇溶蛋白與活化的單烷基取代的PEG酯諸如甲氧基PEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯反應以形成酯或酰胺連接，如以下方案A中闡述的。方案A.玉米醇溶蛋白(的谷氨酰胺側鏈)的PEG化如以上方案A中顯示的，m-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺酯可通過酰胺鍵的形成綴合至谷醇溶蛋白諸如玉米醇溶蛋白中的谷氨酰胺殘基(和/或天冬酰胺殘基)的一個或多個末端胺基(Sessa等人，(2007)JApplPolySci105,2877-2883)。在其他實施方案中，精氨酸和組氨酸中的胺基可通過酰胺或氨基甲酸酯連接綴合至PEG。另外，N-末端氨基酸可被PEG化。本領域已知的多種PEG衍生物可被用于PEG化胺基，包括PEG羧酸、酯、碳酸鹽、醛、和類似的。天冬氨酸和谷氨酸中的羧酸、和玉米醇溶蛋白中的C-末端羧酸，還可使用具有胺、羥基、或本領域已知的用于連接羧酸至PEG基團的其他官能團的PEG綴合至PEG。還可使用例如吡啶硫、乙烯砜、馬來酰亞胺、或碘乙酰胺功能化的PEG將玉米醇溶蛋白中的半胱氨酸的硫醇綴合至PEG。使用本領域眾所周知的技術還可將玉米醇溶蛋白中的蘇氨酸和絲氨酸PEG化。可使用酶獲得玉米醇溶蛋白中位點特異性的PEG化。例如，可將轉谷氨酰胺酶用于選擇性PEG化谷氨酰胺中的側鏈胺基，如以下方案B中顯示的。通過使用乙酰基半乳糖胺轉酶(acetylgalactosaminetransferase)選擇性糖基化絲氨酸或蘇氨酸中的羥基及隨后使用唾液酸轉移酶綴合PEG-唾液酸可獲得相似的選擇性PEG化(Veronese等人(2005),DrugDiscovToday10,1451-1458)。方案B.酶的PEG化.在多種實施方案中，其他烯化氧可被用于替代聚乙二醇，諸如每一個亞烷基中包含2至4個碳原子的烯化氧鏈。烷氧基-封端的聚(烯化氧)是適合的實例，諸如甲氧基-封端的聚(烯化氧)，且隨后可用基團諸如琥珀酰亞胺酯活化游離的羥基端。在一些實施方案中，聚(烯化氧)鏈可具有從約2至約110的重復單元，且典型具有從約50至約110的重復單元。術語“生物相容的”意味著涉及到的聚合物或綴合物當被體內施用至受試對象時不會造成或引起顯著的負作用。可能的負作用的實例包括，但不限于，嚴重發炎和/或過度或不良免疫應答、和毒性。玉米醇溶蛋白和聚乙二醇是生物相容的成分。術語“水醇溶劑”指的是包括水和醇系溶劑，諸如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、或丁醇(包括1-丁醇、2-丁醇(仲丁醇(sec-butanol))、異丁醇、和叔丁醇)的溶劑系統。常見的水醇溶劑系統包括50％、70％、90％、和92％的乙醇在水中。術語“穩定”指的是其中核沒有接觸水的膠束的核(見例如，PEG-玉米醇溶蛋白的核-殼結構，實施例1)。術語“接觸”指的是觸碰、使接觸、或引起直接或近距離的臨近的行為，包括，例如，在溶液中、在反應混合物中，體外、或體內在細胞或分子水平，例如引起生理反應、化學反應、或物理改變。術語“施用(administered)”或“施用(administration)”當在膠束的治療和診斷用途的上下文中使用時，指的是并包括為了例如遞送治療劑至靶向位點的目的引入所選擇的膠束量進入體內或體外環境。“有效量”指的是有效治療疾病、障礙、和/或狀況、或引起所列舉的效果的量。例如，有效的量可以是有效減少被治療的狀況或癥狀的進展或嚴重程度的量。治療上有效量的確定充分在本技術領域的技術人員的能力范圍內。術語“有效量”意在包括例如，有效治療或預防宿主中疾病或障礙，或治療疾病或障礙的癥狀的本文描述的空白或負載藥物的膠束的量。因此，“有效量”通常意味著提供期望效果的量。術語“治療(treating)”、“治療(treat)”和“治療(treatment)”可包括(i)防止疾病、病理或醫療狀況形成(例如，預防(prophylaxis))；(ii)抑制疾病、病理或醫療狀況或阻止其發展；(iii)減輕疾病、病理或醫療狀況；和/或(iv)減少與疾病、病理或醫療狀況相關的癥狀。因此。術語“治療(treating)”、“治療(treat)”和“治療(treatment)”可延伸至預防(prophylaxis)并可包括預防(prevent)、預防(prevention)、預防(preventing)、減少、停止或逆轉被治療的狀況或癥狀的進展或嚴重程度。正因如此，術語“治療”可包括醫療、治療、和/或預防施用，視情況而定。術語“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”、和“抑制(inhibition)”指的是減慢、停止、或逆轉疾病、感染、狀況、或細胞組的生長或進展。與在不存在治療或接觸時發生的生長或進展相比，抑制可大于例如約20％、40％、60％、80％、90％、95％、或99％。術語“體內”意味著受試對象的身體內部，諸如患者的身體內部，并包括通過多種方式包括但不限于口的、頰的、靜脈內的、肌內的、腹膜內的、腸胃外的、皮下的、局部的、眼睛的、肺部和鼻腔途徑的施用的膠束施用。術語“體外”指的是受試對象或患者的身體外部的環境。術語“受試對象”或“患者”都指的是個體復雜的生物體，例如，人或非人動物。術語“治療劑”和涉及治療或醫療功能的相似的術語意味著所提及的小分子、大分子、蛋白、核酸、生長因子、激素、藥物、其他物質、細胞、或其組合可有益影響受試對象中的疾病或狀況的發生、進程、和/或一個或多個癥狀，并可與制造用于治療疾病或其他狀況的藥劑中的膠束聯合起來被使用。用于在本文描述的膠束中包封的適合的治療劑包括疏水性治療劑，例如，但不限于，姜黃素、阿霉素、和顯像劑諸如尼羅紅。疏水性劑：可采用另外適于本發明實行的幾乎任何疏水性劑用于多種應用。本文描述的兩親的聚合物還可被用作增稠劑、潤滑劑、洗滌劑、表面活性劑、和防污劑。兩親的聚合物可被用作染料、化妝品、色素和醫藥產品的乳化、分散或穩定劑。兩親的聚合物作為紡織品的染色中的乳化、分散或穩定劑和用于美容的包封染料可以是特別有用的。兩親的聚合物作為化妝品、藥品、保健品、殺蟲劑、紡織品、和香料的潤滑劑和包封劑可以是有用的。因此，除了生物或藥學上有活性的疏水劑，可被本文描述的兩親的聚合物包封的其他疏水性分子包括診斷劑、殺蟲劑(insecticide)、殺蟲劑(pesticide)、除草劑、防腐劑、食品添加劑、芳香劑、染料、診斷用輔助藥(diagnosticacid)和類似的。可被本文描述的兩親的聚合物包封的疏水性分子的實例包括，但不限于：松香酸、醋葡醛內酯、二氫苊、苊香豆醇、乙酰六酰胺、乙酰汞辛酚、甘草次酸醋酸酯、乙酰毛地黃毒苷、二溴乙炔、二氯乙炔、乙酰水楊酸、土木香內酯、艾氏劑、鋁糖醇鈉、丙烯菊酯、烯丙雌醇、烯丙基硫醚、阿普唑侖、阿司匹林鋁(乙酰水楊酸鹽)、氨由醋胺、氨氯苯惡嗪、氨魯米特、戊基氯、雄烯二醇、茴三硫、敵菌靈、地蒽酚、抗霉素A、除瘧霉素、偶胂乙酸、積雪草皂苷、阿司咪唑、奧迪霉素、金硫乙酰苯胺、8-氮鳥嘌呤、偶氮苯；貝加因、秘魯香脂、塔魯香脂、燕麥靈、東菱克栓酶(baxtrobin)、芐達酸、地巴唑、芐氟噻嗪、苯菌靈、芐星青霉素、苯雌酚、芐替哌、苯醌、甲基苯異丙基芐胺、芐噻嗪、苯甲酸芐酯、肉桂酸芐酯、鉍溴酚、治草醚、樂殺螨、菊精、紅沒藥醇、比沙可啶、二(對氯苯氧基)甲烷、碘次五倍子酸鉍、堿式棓酸鉍、鞣酸鉍、雙酚A、硫雙二氯酚、冰片基、溴代異戊酸(bromoisovalerate)、冰片基氯、異戊酸冰片酯、水楊酸冰片酯、大隆(brodifacoum)、溴鼠胺、二溴羥喹、丁苯羥酸、丁胺酯、正丁巴比妥、丁硫啶(buthiobate)、丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯；碘硬脂酸鈣、己醣酸鈣、硬脂酸鈣、卡泊酸、克菌丹、卡馬西平、卡波氯醛、卡波硫磷、卡波醌、胡蘿卜素、香芹酚、吐根酚堿、腦磷脂、大風子油酸、鵝膽酸、甲殼素、氯丹、三氯苯乙酸、殺螨醇、百菌清、三對甲氧苯氯乙烯、氯普噻噸、氯喹那多、卡波羅孟、西洛他唑、辛可尼丁、檸檬醛、克利貝特、氯法齊明、安妥明、氯氟苯脲(cloflucarban)、氯硝甘油、氯吡多(clopidol)、氯茚二酮、氯惡唑侖、香豆磷(coroxon)、皮質酮、氯殺鼠靈、蠅毒磷(coumaphos)、畜蟲磷甲酚酯(coumithoatecresylacetate)、鼠立死(crimidine)、育畜磷、福美銅氯、氰美馬嗪、環扁桃酯、環拉氨酯、磁麻甙、cypernethril；氨苯砜、磷胺氮芥、嗅氰菊酷、醋酸脫氧皮質酮、去羥米松、右馬拉胺(dextromoramide)、diacetazoto、氯亞磷、地百里砜、異氯硫磷、抑菌靈、二氯芬、二氯苯二磺胺、三氯殺螨醇、地快樂除草劑(dicryl)、雙香豆素、雙烯雌酚、己烯雌酚、雙苯米唑、雙氫可待因酮烯醇乙酸酯、雙氫麥角胺、二氫嗎啡、雙氫速甾醇、二甲己烯雌酚、地美炔酮、敵殺磷、地芬南、N-(1,2-二苯基乙基)煙酰胺、地匹乙酯、二磺法胺、二噻農、去氧苯妥英、敵菌酮、多晶型磷灰石、克瘟散、大黃素、苯乙氨茴酸、抑草蓬、麥角異柯寧堿、丁四硝酯、紅霉素硬脂酸酯、雌三醇、乙基罌粟堿、脫水羥基孕酮、雙香豆乙酯、乙氫去甲奎寧、乙基薄荷烷甲酰胺、丁香油酚、尤普羅辛、依沙酰胺；非巴氨酯、苯丙酰胺酯、芬苯達唑、非尼戊醇、殺螟硫磷、非諾貝特、芬喹唑、倍硫磷、非普拉宗、菲律賓菌素、綿馬酸(filixicacid)、夫洛非寧、氟阿尼酮、氟甲喹、氟可丁丁酯、氟甲睪酮、氟替爾、flutazolamn、煙曲霉素、5-糖基-5-異丙基巴比妥酸(5-furfury1-5-isopropylbarbituricacid)、鐮孢真菌素、格拉非寧、胰高血糖素、苯乙哌啶酮、格列丁噻唑、灰黃霉素、愈創木酚碳酸酯、愈創木酚磷酸酯、哈西縮松、血卟啉、六氯酚、己烷雌酚、雙辛氫啶、環己烯巴比妥、氫氯噻嗪、氫可酮、異丁普生、艾地苯醌、吲哚美辛、煙酸肌醇酯、碘苯扎酸、碘醋胺酸、膽影酸、碘美拉酸、碘泊酸鹽、異美汀(isometheptene)、isonoxin、2-異戊酰茚滿-1,3-二酮(2-isovalerylindane-1,3-dione)；交沙霉素、11-酮孕酮、月桂氮卓酮、3-O-月桂酰吡哆醇二乙酸酯(3-O-lauroylpyridoxoldiacetate)、利多卡因、林丹(lindane)、亞麻酸、碘塞羅寧、光明霉素、代森錳鋅、苦杏仁酸、異戊酯、氯苯咪吲哚、甲苯咪唑、美海屈林、甲鉍喹、美拉胂醇、美法侖、甲萘醌、戊酸薄荷酯、美芬諾酮、美芬丁胺、美芬妥因、美普卡因、美他諾龍、炔雌醇甲醚、甲硫芬、甲麥角林、美沙拉妥、美雄醇、安眠酮、3-甲基膽蒽、哌醋甲酯、17-甲基睪酮、美替洛爾、苯噠嗎啉、金硫乙酸鈣、萘酞磷、萘哌地爾、萘、2-乳酸萘酯、2-(2-奈氧基)乙醇(2-(2-naphthyloxy)ethanol)、水楊酸萘酯、萘普生、烯丙新戊巴比妥、奈馬克丁、氯硝柳胺、煙氯苯丁酯、尼可嗎啡、硝呋喹酸、硝呋齊特、二胺硝吖啶、硝甲酚汞、諾加霉素、去甲西泮、諾乙雄龍、諾孕烯酮；奧他維林、歐夾竹桃甙、油酸、去甲羥基安定、奧沙唑侖、奧昔拉定、奧昔卡因、氧可酮、羥甲睪酮、雙醋酚丁、郝青酰胺、對硫磷、匹莫林、季戊四醇四硝酸酯、戊基苯酚(pentylphenol)、奮乃靜、芬卡米特、苯吡胺、2-苯-6-氯酚、苯基甲基巴比妥酸、苯妥英、伏殺磷、鄰苯二甲酰磺胺噻唑、葉綠醌、哌嗪荒酸、哌法寧、吡酮洛芬(piketopfen)、哌普唑啉、吡扎地爾、普拉貝脲、普勞諾托、聚普瑞鋅、泊利噻嗪、丙磺舒、孕酮、普美孕酮、丙泮尼地、克螨特、苯胺靈、普羅喹宗、丙硫異煙胺、乙嘧啶、嘧啶磷、恩波維銨；槲皮素、奎勃龍、喹禾靈、雷復尼特、瑞西那明、羅西維林、runnel、席夫堿(salen)、猩紅、癬可寧、西瑪津、西美曲特、索布佐生、蔬草滅(solan)、安體舒通、鯊烯、雄諾龍、硫糖鋁、磺胺苯、磺胺胍諾、柳氮磺胺吡啶、亞砜、舒必利、琥保松、他布酮、特麥角脲、睪酮、四溴甲酚(tetrabromocresol)、粉防乙堿、氨硫尿、硫代秋水仙堿、硫辛酸、克殺螨、甲硫噠嗪、福美雙、麝香異戊胺酯(thymylN-isoamylcarbamate)、噻昔達唑、噻克索酮、生育酚、托西拉酯、托萘酯、三氯生、三氟醋鉚酸、三苯乙醇；烏索酸、纈氨霉素、維拉帕米、長春花堿、維生素A、維生素D、維生素E、聯苯丁酸、甲苯噻嗪、扎托洛芬、和玉米烯酮。具有適于本發明使用的生物活性的一類特定的疏水性分子是細胞間調節因子和介質諸如干擾素、生長因子、激素、和類似的，包括它們相應的受體。本文描述的兩親的綴合物預期對于干擾素的有效施用是特別有效的，干擾素的有效施用已證明是有問題的因為干擾素的水不溶性。本文描述的膠束制劑的局部劑型因為通過兩親的聚合物膠束包封疏水性物質可呈現經皮遞送的出乎意料的加速比率。因此，聚合物包封的具有生物或醫藥活性的疏水性物質可被制備作為局部劑型諸如洗劑、凝膠、藥膏、乳膏、鎮痛軟膏、軟膏和類似的。這些組合物可以以水溶液的形式，或以水包油或油包水乳液的形式。這些組合物可被制備用于通過多種途徑施用至患者，包括通過注射施用、肺部施用、和通過口服或經鼻途徑的施用。包括本文描述的膠束的這些制劑可以是另外的傳統制劑，任選包含眾所周知的添加劑、并可使用領域公認的技術制備。溶解技術：已使用許多方法溶解疏水性藥物用于改善它們至患者的遞送。現有的溶解技術的綜述在以下表A中闡述。該表僅顯示在市場產品中和在臨床開發中使用的溶解技術的代表性列表。表A.不同的溶解技術.a.Lipinski(2002),Am.Pharm.Rev.5:82-85；Neervannan(2006),ExpertOpinDrugMetabToxicol2:715-731.b.Miller等人(2006),JPharmSci,96:1691-1707；Redenti等人(2000),JPharmSci89:1-8；Redenti等人(2001),JPharmSci90:979-986.c.Yalkowsky等人(1998),JPharmSci87:787-796；Portmann和Simmons(1995),JPharmBiomedAnalysis13,1189-1193；Johnson等人(2003),JPharmSci92:1574-1581d.Torchillin(2007),PharmRes24:1-16；Vries等人(1996),DrugDevIndPharm,22:475-494；Tije等人(2003),ClinPharmacokinet42:665-685.e.Pasut和Veronese(2009),AdvDrugDelivRev,61,1177-1188；Greenwald等人(2000),CritRevTherDrugCarrierSyst17,101-161；Veronese等人(2005),DrugDiscovToday10,1451-1458.PEG綴合物在臨床開發中或用作抗癌劑的綜述：研磨活性劑(藥物)提供一些優勢，包括可測量性、低的批可變性、和處理大量藥物的高的靈活性。研磨活性劑的劣勢是該過程可能只適用于晶體藥物，可能需要列出空間位阻/離子穩定劑的GRAS、可能發生Ostwald成熟、且延長的研磨可引起非晶形組合物的形成，導致不穩定性。改性的環糊精，諸如β-環糊精，是GRAS和FDA批準的賦形劑。然而，環糊精要求客體分子的結構和腔大小之間嚴格的相關性。如果相應的結合常數太高，環糊精還可顯著改變ADME參數。活性劑的鹽可被用于提供改善的水溶解性并可在某些情況下被用于有利地改變藥代動力學特征。鹽還可增加用于加工的藥物的熔點。然而，鹽的形成需要合適的離子化基團，且活性劑的鹽可能被FDA認為是新的藥物并需要單獨的批準。鹽還可導致與鹽酸鹽的常見的離子效應，并具有形成水合物和多晶型物的趨勢、和/或改變藥代動力學。表面活性劑和/或聚合物膠束在稀釋時具有較少的沉淀的傾向，不想要的副作用被最小化，并已被發現是有用的藥物遞送系統。然而，許多膠束系統具有與它們的組分表面活性劑相關的不同量的毒性，負載能力可能是不夠的，且溶解能力可能太低。因為它們的表面活性，表面活性劑分子還具有滲入并破壞生物膜的潛力并可能是溶血的。膠束的臨界膠束濃度(CMC)決定了它們在體內施用之后的結構穩定性，且聚合物膠束具有比表面活性劑膠束更高的結構穩定性。然而，在文獻中報道的大部分聚合物膠束是通過冗長的且復雜的合成過程從個體單體單元制備的合成嵌段共聚物。小分子藥物的PEG化可能被藥物中的官能團數量限制。小分子藥物的PEG化還可造成構象限制并可影響藥物的結合和治療活性。此外，因為被限制的PEG的綴合(即，每個藥物分子一個PEG)和聚合物藥物-綴合物的被限制的負載，高度疏水性藥物的水溶解性的增加充其量是適度的。因此，需要改善的藥物遞送系統以克服目前使用的藥物遞送技術的許多劣勢。膠束和其應用：本發明涉及使用疏水性水不溶性蛋白和水溶性聚合物制備膠束的方法。例如，合成的聚合物聚乙二醇(PEG)可共價綴合至疏水性水不溶性植物蛋白玉米醇溶蛋白。當以約0.025g/L的CMC分散在水中時，兩親的PEG化的玉米醇溶蛋白可自發形成自組裝的具有疏水性核和親水性殼的膠束。膠束的直徑可以是，例如，約10nm至約450nm、約10nm至約300nm、約75nm至約450nm、約75nm至約300nm、約10nm至約200nm、或約80nm至約200nm。發現納米膠束僅在用約3kDa或更大的聚乙二醇共價修飾玉米醇溶蛋白之后才形成。發現約5kDa的PEG部分當綴合至玉米醇溶蛋白時特別適于膠束形成。因為玉米醇溶蛋白是高分子量蛋白(約22-27kDa)，PEG化的玉米醇溶蛋白形成比大部分其他已知的聚合物膠束更穩定的膠束。用于膠束形成要求的濃度稱為臨界膠束濃度(CMC)。在用水或血清稀釋時，CMC決定膠束的穩定性。就這一點而言，CMC越低，膠束穩定性越高。例如，十二烷基硫酸鈉具有約2.304g/L的CMC。PEG化的玉米醇溶蛋白的CMC，在一些實施方案中為0.025±0.0095g/L，其比商業可得的從聚環氧乙烷和聚環氧丙烷聚合物制備的嵌段共聚物膠束的CMC值低，后者CMC值取決于聚合物的分子量在0.3和190g/L之間變化。PEG-玉米醇溶蛋白膠束可與其他表面活性劑或聚合物結合以形成混合的膠束系統，例如，以加強包封或穩定性，或提供另外的或不同的功能性。可被用于形成混合的膠束的表面活性劑可包括非離子表面活性劑諸如BRIJ35、BRIJ58P、TRITONX-100、TRITONX-114、TWEEN20、TWEEN40、TWEEN80、SPAN80、和類似的，或陰離子表面活性劑諸如膽鹽、十二烷基硫酸鈉，或陽離子表面活性劑諸如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)，和類似的。PEG-谷醇溶蛋白接枝共聚物或嵌段共聚物可被用于形成與包括以下的其他聚合物混合的膠束：PLURONICS(聚環氧丙烷-嵌段-聚環氧乙烷)、聚乳酸-嵌段-PEG、聚己酸內酯-嵌段-PEG、PEG-嵌段-聚(N-異丙基丙烯酰胺)、PEG-嵌段-聚(2-(二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)-嵌段-聚(-(二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)、PEG-嵌段-聚氨基酸、聚天冬氨酸-嵌段-PEG、PEG-嵌段-聚環氧丙烷-嵌段-聚環氧乙烷、聚乳酸-嵌段-聚環氧乙烷-嵌段-聚環氧丙烷、聚乙烯吡咯烷酮-嵌段-聚乳酸-嵌段-聚乙烯吡咯烷酮、聚(3-芐基天冬氨酸)-接枝-PEG、殼聚糖-接枝-聚己酸內酯-接枝-PEG、和類似的。相似地，脂類諸如磷脂、磷脂酰乙醇胺、PEG-二酰基脂和類似的也可被用于形成與玉米醇溶蛋白-PEG綴合物混合的膠束。天然的聚合物諸如酪蛋白也可被結合以形成與PEG-玉米醇溶蛋白混合的膠束。以上描述的表面活性劑、脂類、天然的和合成的聚合物僅是代表性的實例并可改變膠束中的表面活性劑、聚合物或脂類的組成以形成不同的與PEG-玉米醇溶蛋白混合的膠束。可溶性差的化合物進入PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的包封可通過將兩種組分共溶解在水醇溶劑中，諸如90％v/v乙醇、隨后孵育足以允許將疏水性化合物(“貨物分子”)分配進入疏水性玉米醇溶蛋白核中的時間量(例如，過夜)獲得。孵育之后，可通過蒸發將水醇溶劑去除以形成薄膜。可在緩沖液中重構膜以恢復負載藥物的膠束。可溶性差的化合物進入兩親的PEG-玉米醇溶蛋白的包封還可通過將兩種組分共溶解在水醇溶劑(例如，90％v/v乙醇)中、隨后孵育以允許疏水性化合物分配進入疏水性玉米醇溶蛋白核中獲得。孵育之后，可通過例如針對水的廣泛的透析去除水醇溶劑。乙醇的完全去除導致負載藥物的膠束的形成。可選地，冷凍干燥方法也可被用于制備PEG-玉米醇溶蛋白膠束。可溶性差的化合物和PEG-玉米醇溶蛋白可溶解在水/叔丁醇溶劑混合物中并隨后通過冷凍干燥去除溶劑。當冷凍干燥產物在水媒介物(vehicle)或緩沖液中重構時，膠束自發形成。PEG化的谷醇溶蛋白膠束具有許多重要的應用。例如，它們可被用于增強藥學上和相關行業的感興趣的疏水性化合物的溶解性，諸如具有從約1至6.5(辛醇/水)或更大的范圍的LogP的那些疏水性化合物。在一些實施方案中，可使用本文描述的膠束獲得約60％至約95％的包封率。本文描述的膠束可提供被包封的貨物分子在體外或體內環境中的緩釋持續直至約一周、或直至約兩周。膠束的CMC、大小和包封率還可通過改變PEG化的程度、被使用的PEG部分的分子量(m.w.)、和在制備膠束中使用的藥物與聚合物的比率而不同。例如，通過使用較高分子量的PEG可降低CMC。相似地，通過優化PEG-玉米醇溶蛋白綴合物中的PEG鏈的數量可減少CMC。藥物與PEG-玉米醇溶蛋白的較低的比率還可導致較小的尺寸的膠束。另一方面，藥物/PEG-玉米醇溶蛋白比率的增加可增加膠束中的包封率和負載率。交聯玉米醇溶蛋白疏水性核或PEG殼也可增加負載率。交聯還可被用于貨物分子從膠束的進一步緩釋。另外，靶向配體的表面綴合可被用于專門靶向膠束至機體內特定組織，例如，癌組織。當制備膠束時，可通過溶解感興趣的抗癌劑與被溶解的PEG化的玉米醇溶蛋白制備負載抗癌藥物的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束。這些負載藥物的膠束可顯著改善抗癌藥物的細胞攝入并比游離藥物更有效。抗癌藥物的細胞攝入可通過使用HPLC分析測量細胞內藥物濃度確定。見圖30和31和它們的描述。通過測量抗藥性人癌細胞的細胞活性和確定殺死50％該細胞所需的濃度(即，確定IC50值)可評價與游離藥物相比的負載藥物的膠束的效力。負載藥物的膠束具有比游離藥物顯著較低的IC50。見，例如，圖17、28、和29，和它們的描述。還出人意料地發現被包封在PEG化的玉米醇溶蛋白膠束中的抗癌藥物針對抗藥性癌癥是有效的。該發現通過使用作為P-糖蛋白外排泵的底物的熒光標記鈣黃綠素乙酰氧基甲基酯(鈣黃綠素AM)分析抗藥性人癌細胞被發現。在一些癌癥中過量表達P-gp外排泵導致藥物抗性。膠束能夠抑制P-gp外排泵并增加通過熒光光譜測定法測量的鈣黃綠素的細胞內濃度。見圖32和它的描述。因此，PEG-玉米醇溶蛋白膠束可抑制P-gp外排泵并增強抗藥性癌癥諸如乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌和惡性膠質瘤的抗藥性種類(strain)中抗癌藥物的細胞攝入。膠束核中疏水性化合物的包封還針對來自環境因素的降解穩定了不穩定化合物，如通過測量儲存在室溫光下的游離藥物溶液或負載藥物的膠束分散體在不同時間段(例如，直至12小時)的藥物濃度確定的。通過UV-可見光分光光度計測量藥物濃度。另外，PEG化的玉米醇溶蛋白膠束還可被用于形成疏水性藥物的水溶解/水分散制劑。因為膠束尺寸較小(例如，直徑約100nm至約300nm)，它們可被用于例如疏水性藥物的IV施用。它們還可被用于通過腸胃外的、口的、頰的、經皮的、眼睛的和其他的藥物施用途徑改善水不溶性藥物的生物利用度。負載冷凍干燥的藥物(水不溶性藥物)的膠束在注射之前用水可容易被稀釋。負載冷凍干燥的藥物的膠束可隨后被并入膠囊或其他適合的制劑基質(matrix)中。膠束施用之后可形成胃腸腸液，導致水不溶性藥物的增強的溶解性和吸收。此外，PEG化的玉米醇溶蛋白膠束是生物相容的并是生物可降解的，因此增加它們在人中的安全特性。在本發明的一個方面中，可采用膠束作為治療和/或診斷膠束制劑，例如，包含抗癌劑的膠束。此類膠束可提供活性劑的靶向遞送和時序控釋，其通常是治療劑諸如小分子藥物、核酸、蛋白、疫苗、受體、激素、細胞、抗體、化學或其他劑或物質。除了描述的治療方法之外，本發明提供了用于生產具有診斷劑諸如染料、顯像劑、探針和類似物的膠束的方法。可對谷醇溶蛋白-聚合物綴合物作出進一步修飾以用于特定應用，諸如將靶向配體附著在親水性殼上用于靶向遞送至腫瘤。例如，葉酸、抗體、和類似的可被附著至PEG殼用于過量表達用于特定靶向配體的受體的靶向癌細胞。使用本文描述的方法形成的玉米醇溶蛋白膠束可具有其他用途，特別是身體外部。例如，負載藥物的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束可被用作心血管的和其他生物醫學裝置的涂層材料。盡管本文描述的是關于藥物遞送，但膠束還可被用于食品、奶制品和美容行業的感興趣的分子的包封和緩釋。除了人用藥物，獸用藥物也可被包封在膠束中。PEG化的玉米醇溶蛋白膠束還可被用于保護分子免于通過諸如水解作用、氧化作用、光降解、和其他降解反應的降解。這種利用可包括藥學、食品、奶制品、農業、保健品和美容行業的感興趣的分子。式I的變化：式I-V可被進一步修改以提供另外的實施方案。在列舉玉米醇溶蛋白作為實例的任何實施方案中，另外類型的谷醇溶蛋白可取代玉米醇溶蛋白以提供單獨的實施方案。例如，除了玉米醇溶蛋白(Z)和PEG之外，其他疏水性(X)或親水性聚合物(Y)也可綴合至任何式I-V以形成接枝共聚物或ABC類型的多嵌段共聚物，其中A、B和C是不同的單體單元的聚合物嵌段部分。這些變化的實例包括式VI-IX：Z-b-PEG-b-X(VI)Z-b-PEG-b-Y(VII)PEG-b-Z-b-Y(VIII)PEG-b-Z-b-X(IX)其中X是疏水性聚合物部分、Y是親水性聚合物部分、且Z和PEG如式I所定義的。通式I的親水性聚合物PEG可被其他親水性聚合物(Y)取代，諸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、殼聚糖、聚乙烯亞胺(PEI)、聚丙烯酸(PAA)、聚唾液酸(PSA)、多糖諸如右旋糖苷、和類似的。相似地，疏水性聚合物(X)可綴合至谷醇溶蛋白(例如，玉米醇溶蛋白)。此疏水性聚合物(X)可包括，例如，聚己酸內酯、聚乳酸-乙醇酸、聚環氧丙烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、精胺、聚賴氨酸、或聚丙烯酸酯諸如聚甲基丙烯酸酯、聚二甲氨基乙基丙烯酸酯(polydimethylaminoethylacrylate)、和類似的。脂肪酸也可綴合至谷醇溶蛋白以形成疏水性核。此類脂肪酸的實例包括，例如，硬脂酸、棕櫚酸、磷脂酰乙醇胺、和油酸。可針對谷醇溶蛋白疏水性核和/或親水性PEG殼作出其他和/或另外的修飾。這些修飾可包括綴合刺激響應元件諸如聚甲基丙烯酸羥乙酯至核，以制備pH敏感的膠束，或聚(N-異丙基丙烯酰胺)以制備熱敏膠束。另外，谷醇溶蛋白疏水性核或親水性殼可被交聯(例如，使用交聯劑諸如戊二醛、京尼平、或檸檬酸、和類似的)以控制藥物釋放并增加藥物包封和負載率。膠束的藥物制劑：本文描述的膠束可被用于制備治療的藥物組合物。膠束還可以以水分散體或作為冷凍干燥的膠束的干粉形式被添加至組合物。本文描述的膠束可被配制為藥物組合物并以多種形式施用至哺乳動物宿主，諸如人患者。形式可特定適應于所選擇的施用途徑，例如，口的或腸胃外的施用，通過靜脈內的、肌內的、局部或皮下的途徑。本文描述的膠束可與藥學上可接受的媒介物諸如惰性稀釋劑或可吸收可食用的載體結合被全身性施用。關于口服施用，膠束分散體可被封閉在硬或軟殼明膠膠囊中，或冷凍干燥的膠束可被壓縮為片劑，或直接摻入患者的/受試對象的飲食的食物中。膠束分散體或冷凍干燥的膠束還可與一種或多種賦形劑結合并以可攝取的片劑、口含片劑、糖劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、圓片(wafers)、和類似的形式使用。此類組合物和制劑典型包含至少0.1wt％的活性治療劑或診斷劑。組合物和制劑中的劑的重量百分數可以不同并還可方便地是從給出的單位劑型的重量的約2％至約60％。此類包含膠束的治療上有用的組合物中的活性化合物的量是此可獲得的有效的劑量水平。片劑、糖劑、丸劑、膠囊、和類似的還可包含下面的一種或多種：黏合劑諸如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑諸如磷酸氫鈣；崩解劑諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸和類似的；和潤滑劑諸如硬脂酸鎂。可添加甜味劑諸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；或增香劑諸如薄荷油、冬青油、或櫻桃香精(cherryflavoring)。當單位劑型是膠囊時，除了以上類型的材料之外，它可包含液態載體、諸如植物油或聚乙二醇。多種其他的材料可作為包衣存在或另外修改固體單位劑型的物理形態。例如，片劑、丸劑、或膠囊可涂有明膠、蠟、蟲膠或糖和類似的。糖漿或酏劑可包含膠束，除了蔗糖或果糖作為甜味劑之外，甲基和丙基對羥基苯甲酸酯作為防腐劑，染料和調味諸如櫻桃或橙味。制備單位劑型中使用的任何物質應該是藥學上可接受的并所采用的量是本質上無毒的。另外，膠束分散體或冷凍干燥的膠束可被并入另外的緩釋制品和裝置。膠束分散體可被靜脈內、皮下、肌內、瘤內、瘤周施用，或通過輸注或注射。膠束分散體可被制備在水中，任選與緩沖液混合，或在其他藥學上可接受的溶劑中、或其混合物。在儲存和使用的常規條件下，制劑可包含防腐劑以預防微生物的生長。適于注射或輸注的藥物劑型可包括無菌水溶液、分散體、或包含適于無菌可注射或可輸注(infusible)的溶液或分散體的臨時制備的膠束的無菌粉末。最終劑型應該在制造和儲存條件是無菌的、液體的并穩定的。液態載體或媒介物可以是液態分散介質包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液態聚乙二醇、和類似的)、植物油、無毒甘油基酯、和其適合的混合物。微生物作用的預防可通過多種抗細菌和抗真菌劑引起，例如，對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thiomersal)、和類似的。在許多情況下，將優選包括等滲劑，例如，糖、緩沖液、或氯化鈉。注射的組合物的延長吸收可通過延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和/或明膠引起。無菌注射溶液可通過將膠束以所需的量并入具有按照所需要的以上列舉的多種其他成分的合適的溶劑中、隨后過濾滅菌制備。在無菌粉末用于制備無菌注射溶液的情況下，制備的方法可包括真空干燥和冷凍干燥技術，其產生膠束加任何另外的所需的存在于先前無菌過濾的溶液中的成分的粉末。關于局部給藥，通常將膠束作為例如與皮膚病學上可接受的載體結合的組合物或制劑施用至皮膚將是理想的，皮膚病學上可接受的載體可以是固體、液體、凝膠、乳膏、軟膏、或膏劑。有用的固體載體包括精細分割的固體諸如滑石、黏土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁、和類似的。有用的液體載體包括水、或水-乙醇/乙二醇/二甲基亞砜(DMSO)共混物、其中膠束可以以有效的水平分散，任選在無毒表面活性劑的幫助下。可添加佐劑諸如增香劑和另外的抗菌劑以優化所給出的用途的特性。可從用于浸透繃帶和其他敷料劑的吸水墊應用液體組合物，或使用泵型或煙霧劑噴射器噴在受影響區。增稠劑諸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、被改性的纖維素、或被改性的礦物質也可與液態載體一起被采用以形成容易被涂開的糊劑、凝膠、軟膏、肥皂、和類似的，用于直接應用至使用者的皮膚。用于遞送活性劑(例如，負載劑的膠束)至皮膚的皮膚用組合物的實例是本領域已知的；例如，見美國專利號4,608,392(Jacquet等人)、4,992,478(Geria)、4,559,157(Smith等人)、和4,820,508(Wortzman)，通過引用以其整體并入本文。此類皮膚用組合物可與本文描述的膠束制劑結合被使用。本文描述的負載藥物的膠束的有用的劑量可通過比較它們的體外活性和在動物模型中的體內活性確定。用于推測小鼠、和其他動物中的有效劑量至人的方法是領域已知的；例如，見美國專利號4,938,949(Borch等人)，通過引用以其整體并入本文。在治療中使用所需的負載到膠束中的化合物、或活性鹽、前體藥物、或其衍生物的量將不僅根據所選擇的特定的化合物或鹽而且根據施用途徑、被治療的狀況的本質、和患者年紀及狀況而不同，并將最終聽憑監護醫生或臨床醫生的決定。負載治療劑的膠束可以以單位劑型方便施用，例如，每單位劑型包含5至1000mg/m2、方便地10至750mg/m2、最方便地，50至500mg/m2的活性成分。所需的劑量可方便以單次劑量或作為以適當的時間間隔施用的分開的劑量存在，例如，作為每天兩次、三次、四次或多次的子劑量。子劑量本身例如，可進一步被分開為不連續的松散的間隔施用的數量。本文描述的負載藥物的膠束可以是有效的抗腫瘤劑并與非膠束包封的抗腫瘤劑相比具有較高的效力和/或減少的毒性。本發明提供了治療哺乳動物中的癌癥的治療方法，其包括將本文描述的組合物的有效量施用至患有癌癥的哺乳動物。哺乳動物包括靈長類動物、人、嚙齒動物、犬、貓(feline)、牛(bovine)、綿羊(ovine)、馬(equine)、豬(swine)、牛(bovine)和類似的。癌癥指的是任何不同類型的惡性新生物，例如，結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤和白血病，并通常特征為不期望的細胞增殖，例如，無節制的增長、缺少分化、局部組織入侵、和轉移。本發明的化合物治療癌癥的能力可通過使用本領域眾所周知的分析確定。例如，治療方案的設計、毒性評價、數據分析、殺死的腫瘤細胞的定量、和使用移植瘤篩選的生物學意義是已知的。以下的實施例意在闡述本發明的以上部分并不應被解釋為使它的范圍變窄。本領域技術人員將容易認識實施例表明了其中可實行本發明的許多其他方式。應該理解的是可作出許多變化和修改同時保持在本發明的范圍內。實施例實施例1.PEG化的玉米醇溶蛋白和膠束制劑的制備按照本文描述的制備了具有在約80nm和約200nm之間的尺寸范圍分布的PEG化的玉米醇溶蛋白納米膠束。圖2和3闡述根據多種實施方案的PEG-玉米醇溶蛋白的逐步制備。通過添加0.1g的甲氧基PEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(分子量1000、2000、或5000Da)至5mL的90％乙醇中的0.1g的白玉米醇溶蛋白制備PEG化的玉米醇溶蛋白。將以特定比率(1:1,w/w)的混合物在37℃孵育三個小時(以50rpm攪動)。3小時后，添加1mL甘氨酸水溶液(1M)以猝滅任何過量的PEG酯。隨后添加5mL的檸檬酸鹽緩沖液pH7.4以沉淀PEG化的玉米醇溶蛋白。隨后于室溫(～23℃)在磁力攪拌器(100rpm)中針對去離子水直接透析(分子量截留＝～10,000Da)PEG化的玉米醇溶蛋白的沉淀的分散體24小時以去除游離的PEG、甘氨酸、和乙醇。將產生的產物冷凍至-80℃，隨后在-47℃以60mTorr的真空冷凍干燥12至14小時。將m-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺酯(5kDa)用于與玉米醇溶蛋白中的氨基形成酰胺鍵。使用FTIR確認綴合物。分別在1650和1500-1540cm-1處觀察到玉米醇溶蛋白的酰胺I和II蛋白峰。在1740cm-1處觀察到PEG的NHS酯峰，其在與玉米醇溶蛋白綴合之后消失(圖4)。而且，綴合物通過尺寸排阻色譜(SEC)被表征。如在圖4中可以看出的，PEG-玉米醇溶蛋白綴合物在7分鐘時被洗脫且玉米醇溶蛋白在23分鐘時被洗脫。另一方面，PEG在29分鐘時被洗脫。對綴合玉米醇溶蛋白的不同分子量PEG觀察到的PEG化效率在以下表1中顯示，其中使用三硝基苯磺酸(TNBS)測定確定效率百分數。發現玉米醇溶蛋白中的表面氨基參與PEG化。將TNBS測定用于在PEG化之前和之后評價玉米醇溶蛋白中的游離氨基。用純的玉米醇溶蛋白和PEG化的玉米醇溶蛋白的遞增濃度對在440nm波長處的吸光度產生標準曲線。使用以下式計算PEG化效率：％PEG化效率＝[a-b/a]×100其中a＝未PEG化的玉米醇溶蛋白的濃度對吸光度的斜率，且b＝PEG化的玉米醇溶蛋白的濃度對吸光度的斜率。用于構建標準曲線的玉米醇溶蛋白的濃度范圍為0.357mg/mL至12mg/mL，且相關系數為0.9994。表1.玉米醇溶蛋白的PEG化效率.樣品PEG分子量(Da)PEG化效率(％)1100074±72200060±43500052±6結果表示一式三份樣品(平均值±SD)。使用PEG>3000Da形成較小尺寸的PEG-玉米醇溶蛋白膠束，如通過表2中顯示的數據說明的。PEG化的玉米醇溶蛋白在水環境中自組裝以形成具有疏水性核和親水性殼的納米膠束(～100nm)，如在圖1中示意性說明的。表2.膠束形成所需的PEG分子量.樣品PEG分子量(Da)粒徑(nm)PDI11000970±1250.69±0.1222000902±1070.65±0.083500095±1.70.21±0.02結果表示一式三份樣品(平均值±SD)。PEG-玉米醇溶蛋白的核-殼結構：在二甲基亞砜(DMSO)中，1HNMR諧振峰對應于玉米醇溶蛋白和PEG5000Da的疏水性和親水性部分并在NMR譜中清楚地觀察到(圖5)：PEG亞甲基諧振為3.56ppm且蛋白/酰胺諧振為3.36ppm。相比之下，在D2O中只檢測到PEG諧振峰且沒有觀察到玉米醇溶蛋白峰。該結果確認了PEG-玉米醇溶蛋白膠束的核-殼結構。因為玉米醇溶蛋白不溶于水，在氘化水(D2O)沒有觀察到玉米醇溶蛋白的蛋白峰。然而，在D2O中觀察到PEG峰因為PEG是水溶性的。關于PEG-玉米醇溶蛋白膠束，由PEG嵌段組成的殼在D2O很好地溶劑化并因此顯示清楚的NMR譜峰，盡管因為缺少溶劑和膠束核內的溶劑化，組成膠束的核的玉米醇溶蛋白的諧振峰沒有觀察到。然而，DMSO溶解并分解膠束并因此能夠溶劑化PEG和蛋白，允許對應于待被記錄的分子的兩個部分的峰(圖5)。用于膠束形成要求的濃度稱為臨界膠束濃度(CMC)。當用水稀釋時，CMC值決定膠束的穩定性。PEG化的玉米醇溶蛋白的CMC為0.025±0.0095g/L，其使用芘作為探針被確定(圖7)。因為玉米醇溶蛋白分子量相對高，它們形成比其他聚合物膠束更穩定的膠束(見，例如，圖6)，如通過玉米醇溶蛋白膠束的較低的CMC值所指示的。圖6說明在339nm和334nm的激發波長(發射波長為390nm)時芘的吸光度(0.6ILIM)的比率對PEG化的玉米醇溶蛋白對數濃度(g/L)的繪圖。因為PEG化的玉米醇溶蛋白的濃度是增加的，芘在CMC(即，形成膠束的濃度)處的吸光度的強度具有顯著改變。在用緩沖液稀釋的時候膠束的粒徑沒有顯著改變，顯示膠束的穩定性(圖6)。如由在小鼠中皮下施用之后不存在任何玉米醇溶蛋白的特異性抗體所確定的，所制備的PEG-玉米醇溶蛋白膠束不是免疫原性的(圖8)。在PEG-玉米醇溶蛋白膠束中負載不同的疏水性化合物的粒徑和包封率的總結在以下表3中顯示。表3.不同的化合物的PEG-玉米醇溶蛋白膠束包封數據.樣品化合物LogPM.W.(Da)粒徑(nm)PDI包封率(％)1姜黃素2.5368.3124±4.10.25±0.0395±42阿霉素1.20543.5153±30.18±0.0692±63尼羅紅5318.3165±70.21±0.0877±11結果表示一式三份樣品(平均值±SD)；PDI＝多分散指數。實施例2.包封阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束阿霉素是用于治療，除了其他癌癥以外，乳腺癌和卵巢癌的廣泛使用的抗癌藥物。然而，阿霉素的臨床使用被嚴重的副作用限制，諸如骨髓抑制和慢性心臟毒性，其可導致充血性心力衰竭(Hortobagyi(1997),Drugs54Suppl4:1-7)。阿霉素的另外的限制是抗化療的形成(Gottesman等人(2002),NatRevCancer2:48-58)。阿霉素具有543.5的分子量(m.w.)、1.2的LogP，幾乎不溶于水，并溶于甲醇、乙醇和DMSO。與低分子量的表面活性劑膠束相比，聚合物膠束通常是更穩定的，具有低的臨界膠束濃度(CMC)和較低的解離，允許所負載的阿霉素保留較長的時間段，并最終，獲得藥物在靶向位點的較高的積累。此選擇性被動靶向的能力是因為增強的滲透性和保留效果，源于腫瘤組織中滲漏的血管和淋巴引流的缺少(Maeda等人(2000),JControlRelease65:271-284)。水不溶性的阿霉素基從它的鹽酸鹽中被提取。將阿霉素鹽酸鹽(0.012g)溶解在100mL的去離子水(0.22μm過濾)中，并磁力攪動10分鐘以允許阿霉素的完全溶解。10溶液的pH為7.2。添加三乙胺(0.2mL)之后通過磁力攪動30分鐘以允許均一的混合。產生的溶液的pH為12。將100mL的氯仿添加至該水溶液中并磁力攪動15分鐘。在分液漏斗中劇烈搖動產生的乳液，并回收氯仿層。重復該過程三次以完全回收基。合并氯仿層部分并在減壓下濃縮至干燥(在旋轉蒸發器上)。將干燥的殘余物重新溶解在氯仿中并用氯化鈉的飽和水溶液沖洗。將氯仿層分開進入圓底燒瓶中并在旋轉蒸發器上完全濃縮至干燥。將圓底燒瓶中的阿霉素基于37℃保持在烘箱(在黑暗條件下)中48小時以允許完全干燥。將產物儲存在4℃直到被使用。圖20和21說明分別使用膜和透析方法逐步制備負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束。在膜和透析方法中，都將0.1g的PEG-玉米醇溶蛋白和0.001g的阿霉素溶解在20mL的90％乙醇中。將混合物在37℃孵育過夜(磁力攪拌棒，以50rpm攪動)以允許阿霉素分配進入疏水性玉米醇溶蛋白核中。過夜孵育之后，在減壓條件下通過旋轉蒸發將水醇溶劑完全去除以形成薄膜。將負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的干燥的膜在檸檬酸鹽緩沖液pH7.4中重構并聲處理5分鐘以形成均勻懸浮液。隨后在磁力攪拌器中針對水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物。關于透析方法，過夜孵育后，于室溫下在磁力攪拌器(100rpm)中針對水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物24小時以去除任何殘留的物質。隨后將產生的產物冷凍至-80℃之后在-47℃以60mTorr的真空冷凍干燥12至14小時(圖21)。將冷凍干燥的產物儲存在4℃冷藏條件下的干燥器中。以下的表4說明分別使用膜方法和透析方法制備的負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的不同的表征。表4.結果表示一式三份樣品(平均值±SD)；PDI＝多分散指數。使用具有由三氟乙酸(0.1％v/v)和5％v/v～3min、80％v/v～11min和5％v/v～22分鐘的乙腈組成的流動相、使用熒光檢測器(505nm作為激發且550nm作為發射波長)以1mL/min的流速的梯度HPLC定量游離的阿霉素、被包封的阿霉素的量、在體外釋放研究中釋放的量、和細胞攝入的量。圖22和23分別顯示負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的透射電子顯微術(TEM)和原子力顯微術(AFM)圖像。阿霉素幾乎不溶于水(15ng/mL)。然而，當被并入PEG化的玉米醇溶蛋白膠束中時，溶解性增加了約1000倍(10μg/mL)。圖24分別說明磷酸鹽緩沖液pH7.4、90％乙醇中的阿霉素、和PBSpH7.4中負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的UV-可見光光譜。負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白的吸光度高于溶解在90％(v/v)乙醇中的阿霉素的吸光度，其顯示負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的增強的水溶解性(1000倍增加)。圖25分別顯示磷酸鹽緩沖液pH7.4、90％乙醇中的阿霉素、和PBS7.4中負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的熒光光譜。因為阿霉素的增強的溶解性，在PEG化的玉米醇溶蛋白膠束捕獲之后PBSpH7.4中的阿霉素熒光顯著增加(約50倍)。負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的差示掃描量熱法(DSC)熱分析圖在圖26中顯示。不存在阿霉素的熔融峰顯示阿霉素被包封進入膠束的核內部。在圖27中說明阿霉素從PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外釋放。阿霉素的釋放持續約24小時。PEG化的玉米醇溶蛋白膠束因此是用于阿霉素的有前景的載體。針對阿霉素敏感的人乳腺癌細胞(MCF-7)和阿霉素抗性的人卵巢癌細胞(NCl/ADR/RES)、和阿霉素敏感的人乳腺癌細胞系(MCF-7)體外檢測根據本文描述制備的負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的治療活性。圖28說明MCF-7細胞中的阿霉素(溶解在90％乙醇中)和PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外細胞毒性曲線。將以2000每孔的接種密度的細胞暴露于7.8nM至500nM的濃度的阿霉素溶液和阿霉素膠束。24小時后，去除各自的藥物處理。用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細胞兩次并用新鮮的培養基替換。每48小時替換培養基。第5天時，使用MTT分析執行細胞毒性分析。阿霉素膠束的IC50值是純的阿霉素處理的IC50值的一半。圖29說明NCl/ADR-RES細胞系中的阿霉素基(溶解在90％v/v乙醇中)和PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外細胞毒性曲線。將以2000細胞每孔的接種密度的細胞暴露于31.25nM至1000nM的濃度的阿霉素基和阿霉素膠束。24小時后，去除各自的藥物處理。用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細胞兩次并用新鮮的培養基替換。每48小時替換培養基。第5天時，使用MTT分析執行細胞毒性分析。阿霉素膠束的IC50值是游離的阿霉素處理的IC50值4倍低。在人乳腺癌細胞系中的負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的體外細胞毒性分析的結果顯示負載在PEG化的玉米醇溶蛋白膠束中的阿霉素具有比游離的阿霉素溶液顯著更高的有效效價。效價的差異可能是因為與負載阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束相比，游離藥物的細胞攝入動力學的差異。游離阿霉素通過由濃度梯度決定的被動擴散被吸收，而負載阿霉素的膠束通過主動的內吞作用過程被吸收。圖30說明溫度對NCl/ADR-RES細胞系中負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的細胞攝入的影響。將細胞在4℃預培養2小時。2小時后，用PBSpH7.4沖洗細胞兩次并用膠束處理(對應于5μg/mL的阿霉素的量)。兩小時后，去除處理，用冰冷的PBSpH7.4沖洗細胞兩次，并使用HPLC分析評價在不同時間間隔時的細胞裂解物中阿霉素含量的量。細胞攝入在低溫時顯著降低預示著PEG-玉米醇溶蛋白膠束的細胞攝入是主動的內吞作用過程。圖31說明NCl/ADR-RES細胞系中負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束和溶液的細胞攝入動力學(5μg/mL的阿霉素或負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(5000細胞/孔))。與普通的阿霉素溶液相比，在所有的時間點都觀察到阿霉素膠束的較高的細胞攝入。此外，阿霉素膠束的內吞攝入克服了抗癌細胞中的藥物外排泵，因此增加了藥物效價。圖32說明了NCl/ADR-RES細胞中PLURONICF68處理(1mg/mL)、和空白PEG玉米醇溶蛋白膠束(0.050mg/mL)對P-gp活性(鈣黃綠素AM測定)的影響。鈣黃綠素AM是非熒光的并容易擴散進入細胞。鈣黃綠素AM而非鈣黃綠素，是P-gp的底物。在P-gp抑制劑存在時，鈣黃綠素AM進入細胞并通過細胞內酯酶轉變為鈣黃綠素。熒光隨著增加的細胞內鈣黃綠素濃度而增加。從圖32中說明的數據明顯看出，對空白的PEG-玉米醇溶蛋白膠束觀察到顯著的P-gp抑制。還可附著靶向配體以促進負載藥物的PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束體內遞送至靶向位點。圖33顯示同種異體移植小鼠的腫瘤模型中的負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體內生物分布。雌性裸鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)被用于該研究。將JC小鼠乳腺癌細胞(1x107細胞)重懸在PBS中并皮下注射。當腫瘤體積達到～150至200mm3時，動物接受阿霉素溶液和負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(3mg/kg)的靜脈注射。3小時后，處死小鼠并收集器官(肝、心臟、肺、脾、腦和腫瘤)并使用組織均質器在2mL的去離子水中勻質化。添加100ng的柔紅霉素(內標)之后，冷凍干燥組織勻漿。稱重并于室溫在黑暗中使用振動器用5mL的甲醇/氯仿混合物(65:35)提取干燥的組織持續5小時。將提取物于4℃在13,000rpm離心10分鐘。在氮氣條件下蒸發上清液并在甲醇/乙腈(50:50)中重構。使用利用熒光檢測器(激發波長505nm且發射波長550nm)的反相HPLC法(27(乙腈)：73(20mM磷酸氫鉀(一元的)緩沖液(pH：2.5))定量器官中阿霉素的量。將器官中的阿霉素的量表示為量(ng)每mg干燥的器官。如在圖30中可以觀察到的，在腫瘤中發現了較高的藥物積累而腫瘤中沒有游離的阿霉素溶液的藥物積累。與游離的阿霉素溶液樣品相比，使用阿霉素PEG-玉米醇溶蛋白膠束的心臟和腎組織中的藥物濃度顯著較低。阿霉素化療被心臟和腎毒性限制。這些結果說明負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的增強的腫瘤積累和減少的毒性。通過測量同種異體移植乳腺腫瘤小鼠模型中的腫瘤體積的改變研究阿霉素PEG玉米醇溶蛋白膠束的效力。雌性BALB/c小鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)被用于該研究。將JC小鼠乳腺腫瘤細胞(1x107細胞)重懸在PBS中并皮下注射。當腫瘤體積達到～150至200mm3時，動物接受兩次劑量的靜脈的阿霉素溶液或負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束(3mg/kg，在第0和第7天)。使用VernierCaliper測量腫瘤體積。圖34顯示在不同處理后腫瘤體積的增加。如圖34中可以看出的，使用阿霉素PEG-玉米醇溶蛋白膠束的腫瘤體積的增加顯著較低。使用阿霉素PEG-玉米醇溶蛋白膠束處理的小鼠同樣比其他處理組活的更久(圖35)。結果說明負載阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的增強的效力。實施例3.包封姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束姜黃素是印度香料姜黃的主要的姜黃素類化合物，其中姜黃是姜科(Zingiberaceae，姜科)成員。兩種其他的姜黃素類化合物為脫甲氧基姜黃素和雙-脫甲氧基姜黃素(bis-desmethoxycurcumin)。姜黃素可以以至少兩種互變異構形式存在，其中烯醇式在固相和溶液中是更能量穩定的。姜黃素具有368.4的分子量(m.w.)、2.5的LogP，幾乎不溶于水，并溶于甲醇。臨床試驗正研究姜黃素對多種疾病包括多發性骨髓瘤、胰腺癌、骨髓增生異常綜合征、結腸癌、牛皮癬、和阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)的影響。體外和動物研究顯示姜黃素具有抗腫瘤、抗氧化、抗關節炎、抗-淀粉樣蛋白、抗-局部缺血、和抗-炎的特性，和其他生物活性(Aggarwal等人，AdvExpMedBiol2007,595:1-75)。圖9和10分別說明使用膜水化和透析方法逐步制備負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束。在膜水化和透析方法中，都將0.1g的PEG-玉米醇溶蛋白和0.002g的姜黃素溶解在20mL的90％乙醇中。將混合物在37℃孵育過夜(以50rpm攪動)以允許姜黃素分配進入疏水性玉米醇溶蛋白核中。隨后使用旋轉蒸發裝置完全去除水醇溶劑以形成膜。在檸檬酸鹽緩沖液pH7.4中重構負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的干燥的膜并聲處理5分鐘以形成均勻懸浮液。隨后于室溫在攪動(100rpm)下針對水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物24小時以去除游離的姜黃素。在透析方法中，過夜孵育后，于室溫下在磁力攪拌器(以100rpm)中針對水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物24小時以去除游離的姜黃素。隨后將產生的產物冷凍至-80℃之后在-47℃以60mTorr的真空冷凍干燥12至14小時。將冷凍干燥的產物于4℃儲存在干燥器中。以下的表5和6分別說明使用薄膜方法和透析方法制備的負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的不同的表征。表5.樣品姜黃素(％w/w)粒徑(nm)PDI包封率(％)10.25166±100.4±0.192±3.520.5139±20.43±0.0576±1131176±90.4±0.1247±1742185±130.52±0.0638±4結果表示一式三份樣品(平均值±SD)；PDI＝多分散指數。表6.樣品姜黃素(％w/w)粒徑(nm)PDI包封率(％)11124±4.10.25±0.0395±421.25127±2.6031±0.0194±731.66148±70.34±0.0987±1542.5152±2.50.35±0.0374±0955154±10.45±0.0460±1364175±1.70.38±0.0363±11結果表示一式三份樣品(平均值±SD)；PDI＝多分散指數。使用C18色譜柱通過RP-HPLC測定游離的姜黃素和被包封的姜黃素的濃度。流動相由60％乙腈和40％檸檬酸緩沖液(使用50％(w/w)氫氧化鈉溶液被調節到pH3.0的1％(w/v)檸檬酸溶液)組成。流速為1.0mL/min且檢測波長為420nm。圖11和12顯示負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的透射電子顯微術(TEM)和原子力顯微術(AFM)圖像。姜黃素是幾乎不溶于水的(11ng/mL)(B.Aggarwal等人(2007),AdvExpMedBiol595:1-75)。然而，當并入PEG化的玉米醇溶蛋白膠束中時，溶解性增加了約2000倍(20μg/mL)。圖13是10％甲醇中的姜黃素和PBSpH7.4中負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的UV-可見光光譜。從光譜明顯看出負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白的吸光度與溶解在10％(v/v)甲醇中的姜黃素的吸光度是相似的。因此PEG-玉米醇溶蛋白顯著增強了姜黃素的水溶解性約2000倍。圖14是10％甲醇中的姜黃素和PBSpH7.4中負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的熒光光譜。姜黃素的發射光譜的Xmax從540nm至525nm的位移顯示姜黃素被捕獲在膠束中。此外，由于姜黃素增強的水溶解性，捕獲在PEG化的玉米醇溶蛋白膠束中之后水中的姜黃素熒光顯著增強(約4倍)。核中的包封穩定了姜黃素抗來自環境因素，諸如水解作用和光降解的降解。以下的表7說明負載姜黃素的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束在光和pH變化存在時的穩定性。與普通的溶液相比(半衰期4分鐘)(磷酸鹽緩沖液pH7.4)，當被包封在PEG-玉米醇溶蛋白膠束中時姜黃素的穩定性被改善(半衰期31.8分鐘)。磷酸鹽緩沖液pH5中穩定性顯著增強(半衰期＝6.9分鐘，與膠束t1/2＝366分鐘相比)。表7.*10％v/v甲醇被用于溶解姜黃素。圖15顯示負載姜黃素的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的差示掃描量熱法(DSC)熱分析圖。姜黃素的熔融峰的不存在顯示姜黃素被包封進入膠束的核內。圖16呈現姜黃素從PEG-玉米醇溶蛋白膠束的體外釋放。姜黃素的釋放持續約24小時。姜黃素是已知具有抗癌和抗炎活性，然而姜黃素的遞送被其差的水溶解性所限制。PEG化的玉米醇溶蛋白膠束可以是用于姜黃素的適合的載體。圖17說明藥物抗性的人卵巢癌細胞(NCl/ADR-RES細胞)中的姜黃素(溶解在10％DMSO中)和姜黃素膠束(在PBS7.4中)的體外細胞毒性。用7.8nM至500nM的姜黃素處理細胞(2000細胞/孔)4天。第五天時，使用MTT分析執行細胞毒性分析。負載姜黃素的膠束比純的姜黃素更有效(3倍多)。游離的姜黃素和被包封的姜黃素的體外皮膚滲入。如從圖18中可以看出的，姜黃素的皮膚滲入增強了5-20倍。不像游離的姜黃素，姜黃素膠束的皮膚滲入隨著處理時間而增加。被應用的劑量的顯著的量(5-20％)滲入皮膚并甚至發現姜黃素隨著較長的處理時間穿過并到達受體相。如從圖19中可以看出的，姜黃素膠束主要定位至毛囊(c)。從“b”也可明顯看出，其中從表面至皮膚內100μm深處的條痕中觀察到熒光。PEG-玉米醇溶蛋白膠束的定位對治療囊泡疾病諸如痤瘡、脫發、皮脂溢性濕疹、毛囊炎和一些皮膚癌特別有用。圖19(d)顯示角質層(0-15μm)中和有活力的表皮(20-100μm)中的熒光像素。包封在膠束中的姜黃素顯著增加了姜黃素的皮膚滲入，每一個值為平均值±SD(n＝4)。將被切除的豬皮膚夾在垂直擴散池的兩個室之間。由磷酸鹽緩沖液(pH7.4具有20％乙醇)組成的接受介質維持在37℃并使用磁珠攪動。將游離或被包封的姜黃素應用在皮膚上6小時。在研究結束時，沖洗皮膚并在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。使用IMAGEJ軟件定量熒光像素。實施例4.包封尼羅紅的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束尼羅紅被用作典型的疏水性染料(Sheihet等人(2008),Int.J.Pharm.350：312-319)以研究PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束作為皮膚遞送媒介物的應用。尼羅紅具有318.4的分子量、LogP:5、和203-205℃的熔點。它幾乎不溶于水，但溶于甲醇、乙醇、和DMSO。圖36說明根據一個實施方案使用透析方法逐步制備負載尼羅紅的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束。將PEG-玉米醇溶蛋白(0.1g)和0.5mg的尼羅紅溶解在20ml的90％的乙醇中。將混合物在37℃孵育過夜(以50rpm攪動)以允許尼羅紅分配進入疏水性玉米醇溶蛋白核中。隨后于室溫針對水(100rpm攪動)透析(分子量截留10,000Da)混合物24小時以去除任何殘留的物質。隨后將產生的產物冷凍至-80℃之后在-47℃以60mTorr的真空冷凍干燥12至14小時。將冷凍干燥的產物于4℃儲存在干燥器中。以下在表9中顯示負載尼羅紅的PEG-玉米醇溶蛋白膠束的表征。表9.典型化合物粒徑(nm)PDI包封率(％)尼羅紅165±70.21±0.0877±11結果表示為一式三份樣品(平均值±SD)；PDI＝多分散指數。尼羅紅是被用于研究皮膚滲入的典型的親脂性染料。制備的負載尼羅紅的PEG-玉米醇溶蛋白膠束具有165nm的平均粒徑和低的多分散指數(0.21)。PEG-玉米醇溶蛋白膠束提供了好的包封率(77％)。圖37說明PEG-玉米醇溶蛋白膠束增加疏水性化合物的皮膚滲入和皮膚保留的能力。數據還說明了PEG-玉米醇溶蛋白膠束作為用于治療劑和美容劑的皮膚遞送媒介物的應用。使用皮片的豬皮膚研究表皮和角質層(n＝3)中發現的尼羅紅的量。從南達科塔州立大學(SouthDakotaStateUniversity)的動物歸類科學系(theDepartmentofAnimalandRangeSciences)的屠宰場獲得豬耳朵。在屠宰后直接收集耳朵并在自來水下沖洗。用理發推子去除背面的毛。使用手術刀和鑷子從底層軟骨切下皮膚。使用鈍手術刀小心去除粘附在真皮側的脂肪并觀察皮膚任何可見的損傷。使用B型電子取皮機(PadgettTMInstruments,St.Louis,MO)將皮膚皮片至300μm厚。將被皮片的豬皮膚夾在Franz擴散池(PermeGearTM,Hellertown,PA)中的供應和接受室之間。用6mL的磷酸鹽緩沖液(PB,pH7.4)填充接受室并使用磁力攪拌棒攪動。將接受介質保持在37℃。將供應室裝載100μL的5％v/vTWEEN-80溶液中的尼羅紅(250ng)和水中的尼羅紅膠束(等同于250ng的尼羅紅)。6小時后，用PBS沖洗皮膚樣品并放置在顯微鏡用載玻片上用于通過共聚焦激光掃描顯微術(CLSM)分析。使用CLSM(FluoviewFV300TM,Olympusix70,Olympus,CenterValley,PA)檢查具有角質層(SC)朝上的皮膚。使用氬激光以488nm的激發波長激發尼羅紅。使用PLAN-NEOFLUAR40/0.85物鏡觀察圖像。以5μm/掃描的步長從表面(z＝0μm)至100μm掃描皮膚的xyz共聚焦圖像。用相同的光學孔徑、鏡頭和掃描速度獲得所有圖像。空白的皮膚沒有顯示任何的自發熒光。每一張代表性的圖像都選自三至四個皮膚樣品且每一個皮膚中掃描三至四個不同的區域。使用FluoviewTM軟件(Olympus,CenterValley,PA)分析光學切片(xyz)。通過整合總的像素定量共聚焦圖像中的熒光強度分布。分析了每一個皮膚的至少三至四個區域。單獨計算SC(0-15μm)和有活力的表皮(VE,20-100μm)中的像素。與游離的尼羅紅溶液相比，用尼羅紅膠束處理皮膚顯示皮膚滲入進入角質層和有活力的表皮中的顯著增加(圖37)。該數據顯示PEG-玉米醇溶蛋白膠束可被用于遞送治療劑或美容劑至角質層或有活力的表皮以有效治療多種皮膚狀況。實施例5.另外的綴合物和膠束實施方案還可制備本文描述的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的變化形式(Variation)。例如，其他疏水性谷醇溶蛋白，諸如麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白可替代玉米醇溶蛋白被用作用于膠束形成的PEG化的蛋白。因此，可制備PEG化的麥醇溶蛋白膠束、PEG化的大麥醇溶蛋白膠束、和PEG化的高粱醇溶蛋白膠束并與本文描述的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束類似被使用。另外，可通過用另外的水溶性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙烯醇(PVA)、殼聚糖、聚唾液酸(PSA)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚丙烯酸(PAA)、多糖諸如葡聚糖和類似的水溶性聚合物取代PEG化的谷醇溶蛋白聚合物的PEG部分制備其他兩親的蛋白綴合物。這些水溶性的聚合物可綴合至任何疏水性谷醇溶蛋白，諸如玉米醇溶蛋白、麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白，以形成自組裝進入膠束的兩親的蛋白綴合物。當膠束在存在被溶解的治療劑時形成時，可從這些不同的兩親的蛋白綴合物制備負載藥物的膠束并可如描述用于PEG化的玉米醇溶蛋白膠束那樣被使用。類似地，疏水性聚合物可綴合至谷醇溶蛋白。此類聚合物可包括，例如，聚己酸內酯、聚乳酸-乙醇酸、聚環氧丙烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、精胺、聚賴氨酸、或聚丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯、聚二甲氨基乙基丙烯酸酯(polydimethylaminoethylacrylate)、和類似的)。脂肪酸也可綴合至谷醇溶蛋白以形成疏水性核。此類脂肪酸的實例可包括硬脂酸、棕櫚酸、磷脂酰乙醇胺、或油酸。這些聚合物和/或脂肪酸可綴合至任何疏水性谷醇溶蛋白，諸如玉米醇溶蛋白、麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白，以形成自組裝進入膠束的蛋白綴合物。當膠束在存在被溶解的治療劑時形成時，可從這些不同的蛋白綴合物制備負載藥物的膠束并可如描述用于PEG化的玉米醇溶蛋白膠束那樣被使用。可針對谷醇溶蛋白疏水性核或親水性殼，諸如PEG殼，作出其他或另外的修飾。這些可包括綴合刺激響應元件諸如聚甲基丙烯酸羥乙酯至核，以制備pH敏感的膠束，或聚(N-異丙基丙烯酰胺)以制備熱敏膠束。另外，谷醇溶蛋白疏水性核或親水性殼可被交聯，例如，使用交聯劑諸如戊二醛、京尼平、檸檬酸、和類似的，以控制藥物釋放并增加藥物包封產量和效率。實施例6.用于局部遞送類視黃醇的谷醇溶蛋白膠束已開發了用于局部遞送視黃醇穿過皮膚用于治療多種皮膚狀況的新的納米載體。視黃醇(維生素A)和其衍生物(類視黃醇)參與機體內的多種生物學功能包括表皮細胞生長和分化、視力、免疫調節和抗炎效果(Summer,JNutr138:1835-1839,2008)。特別地，視黃醇和其衍生物被廣泛用于治療多種皮膚狀況包括痤瘡、牛皮癬、角質化障礙、皮膚色素減退、和皮膚惡性腫瘤(皮膚癌和黑色素瘤)、及用于創傷愈合和光老化(Orfanos等人,Drug53:358-388,1997)。視黃醇還被用于美容制劑中以減少皺紋和治療脂肪團(Orfanos等人，Drug53:358-388,1997)。然而，視黃醇用于美容和皮膚應用的用途被其差的理化特性和潛在的皮膚刺激可能性嚴重限制(Melo等人，JControlRelease138:32-39,2009；Kim等人，ToxicolLett146:65-73,2003)。視黃醇是親脂性分子(LogP6.20)，具有差的水溶解性和有限的皮膚滲透性。此外，在光和水分存在時是高度不穩定的(見美國專利號5,851,538(Froix等人))，通過引用整體并入本文。視黃醇的局部應用造成表現為輕度紅斑和角質層剝離的嚴重的局部刺激，在用戶中導致不順從(Kim等人，ToxicolLett146:65-73,2003)。申請人通過將視黃醇包封在用于局部應用的基于新的蛋白的膠束中已成功解決視黃醇的遞送問題。新的納米載體已從玉米蛋白玉米醇溶蛋白中被開發出，如本文描述的。一個納米載體包括綴合聚乙二醇(PEG)至玉米醇溶蛋白。PEG化的玉米醇溶蛋白形成自組裝的具有疏水性核和親水性殼的納米膠束。玉米醇溶蛋白顯示對皮膚角蛋白的疏水性(Deo等人，Langmuir19:5083-5088,2003)并因此是用于皮膚應用的有前景的載體。因為玉米醇溶蛋白是疏水性的，它可被用于包封疏水性類視黃醇進入納米粒子內(見，例如，WO2009/137112，其通過引用整體并入本文)、或本文描述的膠束可被用于包封疏水性類視黃醇以提供類視黃醇的可去除水的制劑。申請人已經制備了負載視黃醇的納米膠束的尺寸范圍為180-220nm，具有79-91％的包封率。在膠束中包封視黃醇導致水溶性制劑。PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束顯著增強了視黃醇抗水分和光誘導的降解的固態和液態穩定性。視黃醇從PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束的釋放持續直至2天。與游離的視黃醇水分散體相比，PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束增強了視黃醇的皮膚滲入。此外，PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束可被用于保持視黃醇在皮膚層中用于美容和皮膚病應用。納米載體的一個獨特的方面是納米膠束解決視黃醇的局部遞送的多個市場挑戰的能力。這些挑戰包括提供1)視黃醇的水溶性的和水可分散的制劑，2)增強的視黃醇抗光和水分誘導的降解的穩定性，3)視黃醇的自由流動、無色的且不吸濕的粉末，4)視黃醇的緩釋制劑，5)視黃醇的較高的皮膚滲入和較高的皮膚保留，和6)視黃醇的無刺激性制劑。玉米醇溶蛋白是生物可降解的US-FDA批準的具有與皮膚角蛋白相似的表征的蛋白聚合物并因此是皮膚相容的納米載體。PEG是US-FDA批準的水溶性聚合物。PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束因此提供用于視黃醇的水洗型的局部制劑(waterwashabletopicalformulation)。兩親的PEG-玉米醇溶蛋白膠束用作用于運輸疏水性藥物諸如視黃醇穿過皮膚中交替的疏水性和親水性環境的載體。在納米膠束中包封后視黃醇的水溶解性顯著增加。視黃醇從玉米醇溶蛋白納米膠束中的釋放可以是持續的，導致較低的劑量和減少的應用頻率。在玉米醇溶蛋白納米膠束中包封視黃醇顯著增加了視黃醇制劑的儲存期。PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束增加了視黃醇在固體和半固體制劑中的流動性和分散性。因為視黃醇是吸濕的粘性粉末，在納米膠束中包封視黃醇能夠克服與視黃醇相關的困難的處理和加工問題。PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束可增強視黃醇在皮膚層中的皮膚滲入和保留以用于美容和皮膚病應用。玉米醇溶蛋白納米膠束可增強視黃醇在皮膚層中的皮膚滲入和保留以用于美容和皮膚病應用。在納米膠束中包封視黃醇掩蓋了視黃醇的黃色。這改善了視黃醇制劑的美學訴求并預防了黃色染色。冷凍干燥的PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束可容易被并入多種局部制劑基質，諸如凝膠、乳膏、洗劑和軟膏。用切除的豬皮膚實施皮膚滲入研究，其與人皮膚在許多重要的方面是相似的(Simon和Maibach,SkinPharmacolApplPhysiol13:229-234,2000)。小鼠中的體內研究進一步說明納米膠束克服視黃醇的皮膚刺激的能力。使用納米膠束替代現有的商業制劑的優勢包括：1.增溶。視黃醇是水不溶性疏水性化合物。在PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束中包封視黃醇是水溶性的/可分散的。因此納米膠束可被用于形成水洗型視黃醇制劑用于局部應用。通常水洗型制劑優選用于美容和皮膚病應用。2.穩定。視黃醇在存在水分和光時是高度不穩定的。這限制了視黃醇制劑的儲存期和在應用過程中制劑的效力。在PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束中包封視黃醇可顯著增強視黃醇制劑的穩定性和儲存期。3.緩釋。視黃醇從PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束中的釋放可以是持續的。釋放可持續從2天至一周。這減少了應用視黃醇的劑量和頻率。4.皮膚滲入和保留。視黃醇具有差的皮膚滲入的特性。納米膠束導致增強的視黃醇的皮膚滲入。取決于應用，使用納米膠束可將視黃醇保留在皮膚層中用于多種皮膚病/美容應用。5.藥用化妝品應用。負載視黃醇的膠束可被用于美容應用諸如抗衰老、抗皺紋、和脂肪團的治療。6.皮膚病應用。負載視黃醇的納米膠束可被用于多種皮膚病狀況諸如牛皮癬、痤瘡、創傷治愈和皮膚惡性腫瘤，諸如皮膚癌和黑色素瘤。7.有效和安全的制劑。使用負載視黃醇的納米膠束導致更有效的治療。此外，納米膠束中包封視黃醇顯著減少了由視黃醇造成的皮膚刺激。視黃醇的皮膚刺激是視黃醇不符合美容和皮膚病應用的主要問題。8.用于包封其他類視黃醇的平臺技術。多種類視黃醇包括視黃醇、視黃酸、和它們的衍生物，可被包封在谷醇溶蛋白納米膠束中用于美容和皮膚病應用。適于包封的多種類視黃醇的實例包括，但不限于，視黃醇、視黃酸(諸如13-反式-視黃酸(維甲酸)、13-順式-視黃酸(異維甲酸)、9-順式-視黃酸(阿利維A酸))、視黃醛、阿維A酯、阿維A、視黃醇棕櫚酸酯、和類胡蘿卜素諸如胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素、和玉米黃質。9.組合治療。視黃醇納米膠束可與其他藥物一起被并入其他產品中，諸如防曬、抗牛皮癬、抗痤瘡和抗癌產品。因為視黃醇被包封，將預防與其他劑的互作。其他劑諸如抗氧化劑、自由基清除劑、抗炎劑也可與視黃醇一起被包封在納米膠束中。負載視黃醇的PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束。視黃醇(C20I-1300；286.45g/mol)具有61-63℃的熔點、3100單位/mg的活性、和6.2的LogP。視黃醇幾乎不溶于水，溶于或部分溶于乙醇、并與氯仿、乙醚和汽油(petroleumspirit)是可混溶的。視黃醇是用于多種皮膚狀況包括光老化、痤瘡、創傷愈合、黃褐斑牛皮癬、皮膚癌、黑色素瘤和其他皮膚狀況的藥用化妝品/治療劑(Orfanos等人,Drug53:358-388,1997)。視黃醇具有差的水溶解性和差的光穩定性(Melo等人，JControlRelease138:32-39,2009；美國專利號5,851,538(Froix等人)通過引用整體并入本文)。另外，其還造成皮膚刺激(Kim等人，ToxicolLett146:65-73,2003)。申請人已開發出新的基于玉米醇溶蛋白的視黃醇的納米粒子的局部制劑。因為玉米醇溶蛋白與皮膚角蛋白具有相似的特征，它被用作檢測用于局部制劑中的賦形劑的皮膚刺激的模式蛋白(玉米醇溶蛋白測試)。由于其與皮膚角蛋白的相似性，玉米醇溶蛋白納米載體是用于視黃醇的極佳的遞送媒介物。另外，PEG是在皮膚制劑中被廣泛使用的物質。因此，疏水性玉米醇溶蛋白和親水性PEG在PEG-玉米醇溶蛋白膠束中的結合是能夠運載分子經皮膚中交替的疏水性和親水性區域穿過皮膚的兩親的載體。該實施例說明負載視黃醇的玉米醇溶蛋白納米膠束的制備和表征，與視黃醇本身相比，使用PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束改善了視黃醇的溶解性、通過在PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束中包封改善了視黃醇的穩定性、視黃醇從玉米醇溶蛋白膠束的緩釋、玉米醇溶蛋白納米膠束增強視黃醇的皮膚滲入和皮膚保留的能力、和視黃醇膠束制劑無皮膚刺激或降低的皮膚刺激。1.負載視黃醇的納米膠束的制備。將PEG-玉米醇溶蛋白、視黃醇和BHT溶解在90％乙醇中并于37℃孵育過夜。隨后，將分散體針對去離子水透析以去除游離的視黃醇。隨后冷凍干燥負載視黃醇的膠束。放射性標記的(3H)視黃醇與‘冷’視黃醇一起被用于該研究。取決于PEG-玉米醇溶蛋白/藥物比率和BHT濃度，納米膠束的尺寸約180-220nm且包封率為79至91％。不存在BHT時，包封率<35％。表6(10)-1分別提供了使用透析方法(例如，見圖38)和薄膜方法(例如，見圖39)制備的負載視黃醇的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的表征的數據。表10-1：分別使用透析方法和薄膜方法制備的負載視黃醇的PEG化的玉米醇溶蛋白膠束的表征。結果表示一式三份樣品(平均值±SD)；PDI＝多分散指數。2.視黃醇在水溶液中增加的溶解性/分散性。游離的視黃醇不可分散于水中并在試圖分散該劑之后沉淀在小瓶的底部(圖40)。在另一方面，負載視黃醇的PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束容易分散在水中。在納米膠束中包封之后顯著增強了視黃醇在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的溶解性。10μg/mL的鹽酸鹽緩沖液(pH7.4)中的視黃醇(等量視黃醇)視黃醇膠束樣品顯示堪比于10μg/mL的20％甲醇中的游離視黃醇的UV吸光度(320nm)。在10μg/mL的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的視黃醇分散體中觀察到非常低的吸光度。3.視黃醇從PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束中的釋放。在磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS；pH7.4)中實施視黃醇從納米膠束中的釋放研究。使用UV分光光度計在320nm處分析視黃醇的濃度，并一式三份實施釋放研究。視黃醇從納米膠束的釋放持續直至48小時，如在圖41中顯示的。4.負載視黃醇的玉米醇溶蛋白納米膠束的穩定性。視黃醇是黃色顏色的粉末。它在環境條件下是吸濕的并快速變成粘性的。被包封的視黃醇是無色的并自由流動，且是遠遠較少吸濕的(圖42)。在圖42中顯示的視黃醇樣品是亮黃色且納米膠束制劑是白色，說明包封掩蓋了視黃醇的亮黃色顏色。納米膠束制劑還導致比純的視黃醇更自由流動的粉末。持續一周時間段研究了環境條件下和黑暗中的視黃醇納米膠束制劑的穩定性。持續一周還研究了視黃醇和負載視黃醇的納米膠束(冷凍干燥的粉末)的固態穩定性。關于液態穩定性，將游離的視黃醇或負載視黃醇的納米膠束分散在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中并持續一周使用UV光譜學方法(于320nm)測量視黃醇的濃度。發現視黃醇遵循一級動力學并測定了半衰期。獲得以下的結果，如表10-3和10-4及圖43、44、45、和46中顯示的。PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束保護視黃醇抗光降解和水分引起的降解。與游離的視黃醇相比，固態和液態中的被包封的視黃醇顯示增強的穩定性。包含BHT作為抗氧化劑進一步增強了被包封的視黃醇的穩定性。最終，通過納米膠束中的包封顯著增強了視黃醇的儲存期。表10-3：游離和被包封的視黃醇的固態穩定性.物質光(t1/2以小時計)黑暗(t1/2以小時計)視黃醇固體52.7563視黃醇膠束86.63112具有BHT的視黃醇膠束173.251155表10-4：游離和被包封的視黃醇在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的液態穩定性.物質光(t1/2以小時計)黑暗(t1/2以小時計)視黃醇16.1120.83視黃醇+BHT35.2543.42視黃醇膠束3794.88具有BHT的視黃醇膠束99219.55.視黃醇和被包封的視黃醇的皮膚滲入。使用Franz擴散池用被切除的豬耳朵皮膚研究視黃醇和被包封的視黃醇的皮膚滲入。放射性標記的(3H)視黃醇與‘冷’視黃醇一起被用于該研究。使用放射化學分析評價48小時結束時皮膚勻漿和接受介質中的視黃醇的量。重復實驗6次(±SD)。如在圖47中可以看出的，被包封的視黃醇導致皮膚中視黃醇的較大的保留。膠束導致約5倍增加的視黃醇的皮膚保留。游離的視黃醇和視黃醇膠束的“皮膚中的視黃醇與受體”的比率分別為3和6.5。結果顯示膠束增加了視黃醇的整體皮膚滲入和保留。為了說明視黃醇的囊泡靶向性，使用了皮膚三明治模型。在三明治皮膚中(見圖48)，囊泡途徑被夾在表皮上的角質層阻斷。與傳統的皮膚表皮滲入研究相比，三明治皮膚模型中游離的視黃醇和膠束包封的視黃醇被運轉進入接受室的視黃醇的量都是減少的。然而，從膠束運轉視黃醇的顯著減少顯示大部分視黃醇膠束是穿過毛囊被運轉的。考慮到視黃醇治療痤瘡的用途(痤瘡主要起源于毛囊)，視黃醇膠束將具有靶向視黃醇至毛囊中的疾病部位的優勢。總之，PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束顯著增加了視黃醇的水溶解性和分散性。在納米膠束中包封視黃醇導致自由流動的無色粉末，不像游離的視黃醇，游離的視黃醇是黃色、粘性且吸濕的粉末。玉米醇溶蛋白納米膠束有效維持視黃醇的釋放。通過在玉米醇溶蛋白納米膠束中的包封顯著增強了視黃醇的光穩定性和水解穩定性，其通過添加BHT作為抗氧化劑進一步被增強，且PEG-玉米醇溶蛋白納米膠束導致視黃醇的更高的皮膚保留。納米膠束還可減少視黃醇的皮膚刺激。視黃醇膠束的乳膏制劑的制備。為了說明用于遞送的皮膚制劑的商業發展的可行性，將商業膏基(MEDCOLabs)用于并入游離的視黃醇或被包封在玉米醇溶蛋白膠束中的視黃醇。膏基包含硬脂醇(14％，鯨蠟酯(cetylester)為(3.5％)、單硬脂酸甘油酯(2％)、聚氧乙烯硬脂醚(3％)、山梨醇(10％)、棕櫚酸異丙酯(2％)、對羥基苯甲酸甲酯(0.16％)、對羥基苯甲酸丙酯(0.4％)和純化水(65％)。稱重等同于0.1％的視黃醇并轉移至表面皿并通過幾何稀釋使用玻璃棒均勻混合。可使用其他制劑，包括但不限于，油-水乳膏、油包水乳膏、軟膏、凝膠、和類似的。將0.05μCi的3H-視黃醇摻入混合物中并在乳膏中徹底混合。最終，將制備的乳膏制劑轉移至玻璃小瓶并存儲直到使用。表11：視黃醇乳膏制劑持續一個月的時間段測量了視黃醇膠束乳膏制劑的穩定性(見圖49)。如圖中顯示的，制劑保持穩定并沒有在室溫中顯示任何降解。視黃醇從乳膏制劑中的體外釋放。約40mg的膏基和膠束乳膏被放置在垂直擴散池透析膜中(MWCO～8,000-10,000Da)用于釋放研究，接受介質由pH7.4的緩沖液組成。從接受介質中收集樣品并使用3H視黃醇通過放射化學方法分析。每一個數據點代表平均值±SD(n＝3)。如從圖50中可以看出的，與膠束乳膏相比，更多的視黃醇從普通乳膏中釋放。體外皮膚滲入。將被切除的人皮膚夾在垂直擴散池的兩個室之間。由磷酸鹽緩沖液(pH7.4)組成的接受介質維持在37℃并使用磁珠攪動。將游離的視黃醇或被包封在膠束中的視黃醇乳膏制劑裝載在供應室中。制劑被應用6小時并隨后去除制劑并繼續滲入研究48小時。在研究結束時，使用3H標記的視黃醇通過放射化學方法測量皮膚和接受室中的視黃醇濃度。用0.1M氫氧化鈉消化皮膚以確定視黃醇濃度。如從圖51中可以看出的，對于普通的乳膏，接受室中比皮膚中存在更多的視黃醇。相比之下，膠束乳膏顯示相反的，其中在皮膚中比接受室中發現更多的視黃醇。視黃醇和被包封的視黃醇乳膏制劑的皮膚刺激。可使用如表12中列出的處理組在SKH-1無毛小鼠中體內檢測標準的制劑對被包封的制劑的皮膚刺激。表12：皮膚刺激研究的處理組.組處理組1對照(無處理)組2視黃醇乳膏組3空白PEG-玉米醇溶蛋白膠束乳膏組4視黃醇納米膠束乳膏組5十二烷基硫酸鈉乳膏(陽性對照)將視黃醇乳膏制劑(0.5g的0.1％w/v視黃醇當量)每天施用至SKH-1無毛小鼠的背部持續五(5)天。在應用制劑之前，使用TEWA計(Delfin)每天測量經表皮水分丟失(TEWL)值。TEWL的增加是皮膚刺激的衡量并如圖52中可以看出的，被包封在膠束中的視黃醇沒有顯示皮膚刺激并堪比陰性對照(即，無處理)。另一方面游離的視黃醇乳膏顯示皮膚刺激。十二烷基硫酸鈉(SLS)，已知的皮膚刺激劑，被用作陽性對照。體內局部生物利用度。將乳膏制劑施用在異氟烷麻醉下的小鼠的背部皮膚上。安樂處死動物之后，使用SCOTCHTAPE膠帶剝離皮膚以去除角質層。通過放射化學分析使用3H視黃醇確定皮膚(角質層和表皮/真皮)和血液中的視黃醇的量。如圖53中可以看出的，膠束包封的視黃醇保留在皮膚中，沒有全身性吸收進入血液。值為平均值±SD(n＝3)。實施例7.酪蛋白膠束酪蛋白是在合適條件下可以形成膠束的牛奶蛋白。盡管一些研究已經描述了酪蛋白膠束作為遞送載體的用途，酪蛋白膠束沒有被用作用于皮膚應用的遞送劑。酪蛋白可與PEG-玉米醇溶蛋白膠束結合形成新的混合的膠束。制備負載視黃醇的β-酪蛋白膠束的一般步驟如下。可將β酪蛋白(20mg)和視黃醇(0.1mg于600μL的乙醇中)溶解在10mL的0.1M的PBSpH7.0中。在約37℃將混合物孵育過夜，之后于～100℃在100mTorr真空下冷凍干燥(例如，持續約24小時)。可將產生的膠束粉末儲存在于約2-8℃的干燥器中持續延長的時間段。以下的表13說明負載視黃醇的β-酪蛋白膠束的多種表征。關于負載視黃醇的β-酪蛋白膠束的制備，視黃醇的濃度可從約0.005至約0.05％w/w的范圍。β-酪蛋白濃度從約0.15-0.25％w/v的范圍。表13.負載視黃醇的β-酪蛋白膠束的表征.樣品號視黃醇(％w/w)BHT(％w/w)粒徑(nm)PDI包封率(％)10.005--207.40.6569.7420.015--109.10.61610.2830.0050.00576.90.62610.2540.0150.01568.90.51011.06酪蛋白還可被用于制備包含尼羅紅的膠束(見，圖54)。表14提供此類膠束的表征。表14.樣品名稱粒徑(nm)PI包封率(％)尼羅紅-酪蛋白膠束245±15nm0.38±0.4178±5％如在圖55中看出的，在酪蛋白膠束中包封尼羅紅顯著增強了尼羅紅的皮膚滲入。將被切除的豬皮膚夾在垂直擴散池的兩個室之間。由磷酸鹽緩沖液(pH7.4)組成的接受介質被維持在37℃并使用磁珠攪動。將游離的或被包封的尼羅紅應用在皮膚上6小時。在研究結束時，沖洗皮膚并在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。使用IMAGEJ軟件定量SC(0-15μm)和有活力的表皮(20-100μm)中的熒光。每一個值為平均值±SD(n＝4)。在p<0.05時差異顯著。實施例8藥物劑型以下的制劑說明可被用于本文描述的膠束制劑的治療或美容施用的代表性的藥物劑型，其可以是水分散體或冷凍干燥的粉末(在下文中被稱為‘組合物X’)：可通過藥學領域眾所周知的常規程序制備這些制劑。將被領會的是以上藥物組合物可根據眾所周知的制藥技術而變化以適應活性成分‘組合物X’的不同的量和類型。氣霧劑制劑(vi)可與標準的、計量劑量氣霧劑分配器聯合起來使用。另外，特定的成分和比例是為了說明性的目的。根據所需的感興趣的劑型的期望特性，可將成分換為適合的等同物并可改變比例。盡管以上參考公開的實施方案和實施例描述了特定的實施方案，此類實施方案僅是說明性的并不限制本發明的范圍。根據本領域的普通技術可作出改變和修改而在根據所附權利要求中所定義的其廣泛的方面不偏離本發明。所有的出版物、專利、和專利文件通過引用并入本文，就好像通過引用個別并入。已參考多個特定的和優選的實施方案和技術描述了本發明。然而，應當理解的是可作出許多變化和修改同時保持在本發明的精神和范圍內。盡管參考以上的實施例描述了本發明，將被理解的是修改和變化被包含在本發明的精神和范圍內。因此，本發明僅被所附的權利要求所限制。