一種利用水產蛋白和中草藥高溫發酵制備綠色飼用抗菌促生長劑的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用水產蛋白和中草藥高溫發酵制備綠色飼用抗菌促生長劑的方法，屬于飼料添加劑制備的技術領域。
【背景技術】
[0002]自20世紀50年代以來，在動物飼養和飼料中廣泛使用抗生素、化學合成藥物、激素、β-興奮劑、重金屬、鎮靜劑等促生長保健劑。抗生素等促生長保健劑在飼料中的應用歷史由來已久，它創造了養殖業和飼料工業的革命，使得規模養殖在全世界范圍內得到了迅速發展，動物的生產數量和飼料轉化率得到大幅度提高。但是，正如所有工業文明的成果都有它的負面影響一樣，長期以來使用抗生素等非綠色飼料添加劑，導致了如下的問題:畜禽和水產產品中藥物殘留嚴重，直接危害人體健康；畜禽和水產產品品質下降，缺乏市場競爭力和信任感;細菌耐藥性增強、耐藥菌株增多，威脅人類安全;破壞生態環境等。隨著飼料工業和畜牧水產業的迅猛發展，目前我國的畜產品和水產品已從短缺轉變為階段性過剩，人們更關心食品是否安全、衛生，因而綠色消費已成為今后的發展趨勢，加之我國已加入WT O，發達國家對我國出口的農產品要求越來越嚴格，目前藥物殘留問題成為我國畜產品和水產品走出國門的主要障礙之一。因此加速開發、推廣和應用新型綠色飼料添加劑勢在必行。
[0003]綠色飼料添加劑，最基本要求是無毒副作用、無殘留，并且還要能促進動物生長。目前國際公認的促生長綠色飼料添加劑主要有以下幾種:小肽、酶制劑、植物源產品及其提取物、微生態制劑、寡糖和酵母類產品等。
[0004]酶制劑作為一種飼料添加劑具有無殘留、無污染，提高飼料的利用價值，改善動物生產性能和產品品質等作用。飼用酶制劑大致可以分為消化酶和非消化酶兩類，通常在營養層面發揮作用。比如提高畜禽消化道內源酶活性，補充內源酶的不足;破壞植物細胞壁，提高飼料的利用效率;消除飼料中的抗營養因子，促進營養物質的消化吸收。目前，酶制劑已經廣泛應用于飼料工業，主要有蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等酶制劑。然而，市場上現有的飼用酶制劑多不耐高溫，在飼料高溫造粒過程中活性損失非常大。
[0005]近年來，小肽作為一種綠色促生長飼料添加劑在飼料工業備受關注。目前小肽的制備方法有酶解法和微生物發酵法。酶解法生產活性肽是以蛋白原料為底物，運用蛋白酶的酶解作用，生產小分子肽。酶解法易于控制，作用條件溫和適合活性肽的生產。但酶解法需要大量的蛋白酶，生產成本高。因此，酶解法制備活性肽多用于食品與醫藥行業，低端的飼用活性肽產品很少采用酶解的方法。微生物發酵法是以大分子蛋白質為原料，接入產蛋白酶的微生物，利用微生物發酵過程產生的蛋白酶的酶解作用，生成小分子肽。發酵法把蛋白酶的發酵生產和酶解過程有機結合在一起，降低了活性肽的生成成本，更適合活性肽的生產。專利CNZL200410029787.0 “一種活性肽飼料添加劑及制備方法和用途”公開了一種發酵發制備小肽飼料添加劑的方法，它是以植物蛋白和動物蛋白的一種或幾種的混合物，經芽孢桿菌等發酵降解，使其水解度控制在20?35%，然后經過后處理可得到小肽飼料添加劑。小肽作為一種新型綠色促生長飼料添加劑在飼料工業有著很好的應用前景，然而目前小肽并沒有在飼料工業得到廣泛的應用。無論是酶解法生產的小肽，還是發酵法生產的小肽，高昂的生產成本制約了小肽在飼料工業的廣泛應用。另外，現有技術制備的小肽產品其促生長成分只有小肽一種成分，過于單一，促生長性能不夠突出。
[0006]中草藥是中國醫學寶庫中的瑰寶，且中草藥作為飼料添加劑，在我國古代已經開始。中草藥具有無毒副作用、不易引發細菌抗藥性、無殘留等特性，作為一種飼用抗生素的綠色替代品在飼料工業得到了廣泛的認可。從20世紀80年代起，中草藥已被用于作飼用抗生素替代品，且取得了一定的應用效果。中草藥經過微生物發酵后，其有效成分被充分釋放，使其更具生物活性和療效近年來更是研究熱點。中國飼料〔2010，419( 15): 13-17〕文獻公開了從不同中草藥原料中分離得到的米曲霉對中草藥進行發酵，發酵料蒸煮液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性分別較對照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%。目前，中草藥發酵主要采用的菌種有地衣芽孢桿菌和米曲霉等菌種。主要利用這些微生物產生的非淀粉多糖酶將中草藥的細胞壁主要成分降解，從而使得中草藥有效成分釋放出來。然而，現有的中草藥發酵菌種都是常溫的菌種，其在發酵過程中產生的非淀粉多糖酶的活性在產品干燥和飼料的高溫造粒過程中會損失殆盡。因而，現有的中草藥發酵技術制備的發酵中草藥在動物體內僅僅只能發揮中草藥的功效，并不能發揮酶制劑的功效。
【發明內容】
[0007]針對目前酶制劑、小肽和發酵中草藥等制備技術中存在的問題，本發明提供了一種利用水產蛋白和中草藥高溫發酵制備綠色飼用抗菌促生長劑的方法。本發明方法可制備得到一種富含小肽、中草藥有效成分、耐高溫蛋白酶、耐高溫非淀粉多糖酶和益生菌這幾種成分的綠色飼用抗菌促生長劑。
[0008]為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:一種利用水產蛋白和中草藥高溫發酵制備綠色飼用抗菌促生長劑的方法，包括如下步驟:
(1)將斜面保藏的耐高溫地衣芽孢桿菌(BaciIIuslicheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻
的LB液體培養基中，于55 °C、150r/min培養12h，制備成地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HL_3 種子液備用；
(2)將新鮮的低值水產蛋白絞碎后備用或將水產品加工廢水蒸發濃縮至蛋白質含量為15%?20%備用；
(3)將中草藥粉碎后過60目篩備用；
(4 )將步驟(2 )絞碎的低值水產蛋白或濃縮的水產品加工廢水和步驟(3 )粉碎的中草藥按質量比為0.5?1.5:1的比例混合；
(5)往步驟(4)得到的混合物中添加營養物和水，并混勻，獲得最終水分含量控制在40%?80%范圍內的發酵培養基；
(6)往步驟(5)得到的發酵培養中接入步驟(I)所制備的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HL_3 種子液，并混勾； (7)原料的發酵:將步驟(6)獲得的加入菌的發酵培養基按照下列方法進行發酵:發酵培養基分裝在已消毒的發酵淺盤中，裝料厚度為4cm?8cm，淺盤中發酵培養基表面覆蓋滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發酵房內的擱架上發酵，控制環境溫度在55°060°C，發酵時間為48h?60h;
(8)成品處理:發酵結束，將發酵后獲得的產品經干燥、粉碎和包裝后，即制得了一種本發明所述的復合型綠色促生長飼料添加劑成品。
[0009]所述步驟(I)中所用的耐高溫地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)HL_3已于2016年I月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60003，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所。
[0010]所述步驟(2)中低值水產蛋白為羅非魚下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚下腳料、魷魚下腳料、青鱗魚下腳料、青魚下腳料、鰱魚下腳料、草魚下腳料和鰹魚下腳料中的一種。所述步驟(2)中的水產品加工廢水為魚粉加工廢水、甲殼素加工過程的堿洗廢水、對蝦蒸煮廢水和魚糜加工廢水中的一種。
[0011]所述步驟(3)中的中草藥為甘草、連翹、車前草、蘇子、五味子、馬鞭草、黃芪、金銀花、石榴皮、地榆、黃連、魚腥草、苦參和土茯苓中的一種或其中兩種以上的混合物。
[0012]所述步驟(5)中的營養物為麩皮、氯化鈣、氯化亞鐵和磷酸氫二鉀所組成的混合物。所述步驟(5)中的營養物的加入量以添加的營養物的質量占發酵培養基總質量百分比計，分別為:麩皮0.01%?15%，氯化鈣0.01%?5%，氯化亞鐵0.01%?5%，磷酸氫二鉀0.01%?5% ο
[0013]所述步驟(6)中地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3的接種量以接入種子液的質量占發酵培養基總質量百分比計，為I %?9%。
[0014]本發明與現有的技術相比，有如下優點。
[0015](I)發酵產品可以在飼養動物體內發揮酶制劑的功效。現有的中草藥發酵菌和小肽的發酵制備采用的都是常溫的菌種，其在發酵過程中產生的非淀粉多糖酶和蛋白酶的活性在產品制備的干燥過程和用于飼料的高溫造粒過程中會損失殆盡。因而，現有技術制備的發酵中草藥和小肽產品用于飼料在動物體內并不能發揮酶制劑的功效。而本技術采用耐高溫的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)進行發酵，發酵過程產生耐高溫的蛋白酶和非淀粉多糖酶，這些耐高溫的蛋白酶和非淀粉多糖酶的活性在產品制備的干燥和用于飼料的高溫造粒過程中基本沒有損失，因而本技術制備的飼料添加劑可在動物體內發揮酶制劑的功效。
[0016](2)發酵效果好。與現有的中草藥發酵和發酵法制備小肽相比，本發明采用的是高溫發酵，酶在高溫的條件下活性顯著增強，這也會大大提高中草藥發酵和發酵法制備小肽的發酵效果；另外，本發明技術中，原料沒有滅菌，可以充分發揮水產蛋白內源蛋白酶的活性，這會進一步提高小肽的含量。
[0017](3)成本低。與現有的發酵法制備小肽相比，本發明提供的技術方案中，原料不用滅菌，可降低能耗和成本。另外，本