一種金黃色葡萄球菌抑制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及的是一種食品用防腐劑，更具體的說是一種由芳香醒類食用香料復(fù)配 而得的金黃色葡萄球菌抑制劑，可用于抑制肉制品、湯、肉味香精等食品與食品原料中的金 黃色葡萄球菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在，是一種球狀細(xì)菌，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)它 們聚集成簇，像葡萄一樣。不管有沒有氧氣的存在，它們都可W生長。由于金黃色葡萄球菌 能夠分泌毒素，而運(yùn)些毒素一旦達(dá)到一定劑量，且進(jìn)入人的胃腸道，可引起惡屯、、嘔吐、胃疫 李和腹瀉等癥狀。運(yùn)種中毒是急性的，一般在巧化小時(shí)之內(nèi)發(fā)作，最快的甚至半小時(shí)就出現(xiàn) 癥狀。有文獻(xiàn)報(bào)道，1997年，美國佛羅里達(dá)有一個(gè)125人的聚會(huì)中有31人被感染，癥狀持續(xù)了 大約24小時(shí)；原因是聚會(huì)所吃的8公斤火腿在烤好之后，用了一個(gè)沒有充分洗干凈的刀來 切，切好的火腿片沒有及時(shí)充分地防腐保鮮，導(dǎo)致了金黃色葡萄球菌大量增殖從而產(chǎn)生了 大量的毒素。2000年6月底到7月中，日本有14555人被感染，感染源來自日本當(dāng)時(shí)最大的牛 奶生產(chǎn)商雪印乳業(yè)，事故原因是生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生條件很差，金黃色葡萄球菌大量增殖產(chǎn) 生了大量的毒素。2002年，澳大利亞有一個(gè)600人參加的公眾活動(dòng)，許多人在現(xiàn)場(chǎng)吃飯，結(jié)果 200多人出現(xiàn)了惡屯、、嘔吐、胃疫李的癥狀;那些飯菜是前一天準(zhǔn)備的，第二天熱了之后提供 給就餐者;根據(jù)癥狀及食物，推測(cè)也是金黃色葡萄球菌感染所致。2011年在我國個(gè)別品牌的 風(fēng)味慢頭、花生糕、速凍水皎等食品中檢出金黃色葡萄球菌超標(biāo)。由于金黃色葡萄球菌在自 然界中廣泛存在，其分泌的毒素危害人的健康，因此食品中對(duì)金黃色葡萄球菌有著嚴(yán)格的 限量要求。為了防止食品在儲(chǔ)存過程中被污染，延長食品的保存時(shí)間，食品加工過程中常使 用防腐劑。
[0003] 我國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB2760-2011)中批準(zhǔn)允許使用的防腐劑有30多種，包 括化學(xué)合成的防腐劑和天然防腐劑。由于有的天然防腐劑來源有限和提取工藝成本較高， 難于推廣;有的天然防腐劑含有大量蠟、祗締及有害成分，使其應(yīng)用受限；目前我國批準(zhǔn)允 許使用的防腐劑中仍W化學(xué)防腐劑為主，且品種較少，開發(fā)新型效果好而又無毒害的防腐 劑是我國食品防腐劑行業(yè)亟待解決的問題。
[0004] 發(fā)明人通過對(duì)我國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB2760-2011)中已經(jīng)批準(zhǔn)允許使用的30 種芳香醒類食用香料的防腐抑菌作用進(jìn)行研究，從中篩選出了四種抑制金黃色葡萄球菌效 果較好的芳香醒類食用香料，對(duì)它們進(jìn)行復(fù)配，得到了一種金黃色葡萄球菌抑制劑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是采用國內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)允許使用的芳香醒類食用香料， 提供一種金黃色葡萄球菌抑制劑。
[0006] 首先吸取經(jīng)過活化的金黃色葡萄球菌液接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培 養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期作為原菌液；吸取ImL原菌液用無菌生理鹽水倍比稀釋成104- 105c化/mL的菌懸液待用。然后用體積濃度為2%的吐溫-80水溶液作溶劑，將30種芳香醒類 食用香料配成濃度為O.lg/mL的稀釋液備用;運(yùn)30種芳香醒類食用香料分別是苯甲醒、鄰甲 基苯甲醒、對(duì)甲基苯甲醒、間甲基苯甲醒、4-乙基苯甲醒、對(duì)異丙基苯甲醒、對(duì)甲氧基苯甲 醒、鄰甲氧基苯甲醒、3,4-二甲氧基苯甲醒、2-徑基苯甲醒、4-徑基苯甲醒、4-徑基-3,5-二 甲氧基苯甲醒、洋萊莉醒、香蘭素、乙基香蘭素、苯乙醒、2-苯基丙醒、苯丙醒、兔耳草醒、肉 桂醒、α-甲基肉桂醒、α-己基肉桂醒、α-戊基肉桂醒、3-(2-巧喃基）丙締醒、2-甲基-3(2-巧 喃基)丙締醒、2-苯基-2-下締醒、4-甲基-2-苯基-2-戊締醒、5-甲基-2-苯基-2-己締醒、慷 醒、5-甲基慷醒。
[0007] 在無菌條件下，向無菌培養(yǎng)皿中傾倒約25-30mL的滅菌固體培養(yǎng)基，靜置待其冷 卻，制備固體平板。吸取1(Κ)化稀釋好的菌懸液，按照無菌操作步驟，接入固體平板培養(yǎng)基中 均勻涂布。使用打孔器將新華1號(hào)定性濾紙制成直徑為7mm的藥片，高溫滅菌后貼在含菌平 板上，每皿貼3片，任意兩片藥片圓屯、距不小于24mm。向每片藥片上滴加化L濃度為O.lg/mL 上述香料溶液，另設(shè)兩組平行實(shí)驗(yàn)組。藥片上滴加2%的吐溫-80水溶液和無菌水的含菌固 體平板作為陽性對(duì)照組，W未接入菌懸液的固體平板作為陰性對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 平板放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，37Γ下倒置培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定濾紙片的抑菌圈直徑，結(jié)果取重 復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值，根據(jù)抑菌圈直徑的大小比較判斷30種芳香醒類食用香料抑菌能力的強(qiáng)弱。 運(yùn)30種芳香醒類食用香料的抑菌圈直徑大小見表1。
[0008] 表1 30種芳香醒類食用香料的抑菌圈直徑 Γ00091
[0010] 注:a.結(jié)果表示為:抑菌圈直徑平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(3組平行實(shí)驗(yàn)組）
[0011] b.濾紙片直徑包括在測(cè)量數(shù)據(jù)內(nèi)，如果抑菌圈直徑小于7mm定義為無抑菌圈，記為 0
[0012]由所得結(jié)果可W知道肉桂醒、α-甲基肉桂醒、鄰甲氧基苯甲醒、2-徑基苯甲醒、3- (2-巧喃基)丙締醒、2-苯基-2-下締醒、苯丙醒、4-甲基-2-苯基-2-戊締醒、4-乙基苯甲醒、 苯乙醒10種芳香醒類食用香料對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力很強(qiáng)，抑菌圈直徑均大于 23mm，表現(xiàn)為非常敏感;苯甲醒、鄰甲基苯甲醒、對(duì)甲基苯甲醒、間甲基苯甲醒等14種芳香醒 類香料的抑菌能力較強(qiáng)，抑菌直徑均在12-20mm;而4-徑基苯甲醒、下香醒、洋萊莉醒、兔耳 草醒、日-己基肉桂醒和5-甲基慷醒的抑菌直徑均在7-12mm，其抑菌能力較弱，表現(xiàn)為弱度敏 感。
[0013] 采用二倍稀釋法進(jìn)一步測(cè)定運(yùn)30種芳香醒類食用香料的最小抑菌濃度。首先取9 支5mL試管編號(hào)1-9，第2-9管中加入2mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，1號(hào)管中加入3.8mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基;再向1號(hào)管中加入2(Κ)化濃度為O.lg/mL的香料溶液（即加入20mg芳香醒類食用香料），混 勻后吸取2mL含香料培養(yǎng)基加入2號(hào)管中，使得2號(hào)管培養(yǎng)基中香料濃度為1號(hào)管的一半，W 此類推，對(duì)各管依次進(jìn)行二倍稀釋。然后向每管中加入20化稀釋好的菌懸液，另設(shè)2組平行 實(shí)驗(yàn)組W及對(duì)照組；用常用的防腐劑山梨酸鐘和苯甲酸鋼作為陽性對(duì)照組，陰性對(duì)照組只 加入培養(yǎng)基和菌液。在37Γ條件下振蕩培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基，如其變渾濁則說明此濃度的 香料無法抑制金黃色葡萄球菌生長；臨界濃度的透明試管用營養(yǎng)平板進(jìn)行涂布檢驗(yàn)，將完 全抑制菌落生長所需香料最低濃度定義為最小抑菌濃度，所得結(jié)果見表2。
[0014] 表2 30種芳香醒類食用香料的最小抑菌濃度
[0015]
[0016] 結(jié)合30種芳香醒類食用香料的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度，對(duì)金黃色葡萄球菌抑 制效果較好的芳香醒類食用香料有2-徑基苯甲醒、苯丙醒、肉桂醒、α-甲基肉桂醒、3-(2-巧 喃基)丙締醒、2-苯基-2-下締醒和4-甲基-2-苯基-2-戊締醒。為了考察它們的抑菌穩(wěn)定性， 研究了溫度、紫外線照射和pH值對(duì)運(yùn)巧巾芳香醒類食用香料的抑菌穩(wěn)定性的影響。
[0017] 在考察溫度對(duì)它們的抑菌穩(wěn)定性的影響時(shí)，將7種芳香醒類香料分別置于8(TC、 100°C和12rC下受熱20min，將未經(jīng)熱處理的芳香醒類香料作為對(duì)照組;在考察紫外線照射 對(duì)它們的抑菌穩(wěn)定性的影響時(shí)，將7種芳香醒類食用香料置于紫外燈下分別照射20min、 40min和60min，將未經(jīng)紫外線照射的香料作為對(duì)照組;在考察pH值對(duì)它們的抑菌穩(wěn)定性的 影響時(shí)，首先確定金黃色葡萄球菌能夠生長的環(huán)境的抑值范圍(pH值為5-9)，將未經(jīng)抑調(diào)節(jié) 的培養(yǎng)基作為對(duì)照組;得到的所有結(jié)果見表3-表5。
[0018] 表3不同溫度處理的芳香醒類食用香料的最小抑菌濃度(mg/mU
[0019]
[0024] 綜合考慮運(yùn)7種芳香醒類食用香料對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用的穩(wěn)定性、運(yùn)些 香料對(duì)其他微生物的抑制作用穩(wěn)定性、W及運(yùn)些香料本身的香氣特征與穩(wěn)定性，選用2-徑 基苯甲醒、苯丙醒、肉桂醒和3-(2-巧喃基）丙締醒進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配過程中采用正交試驗(yàn)，正 交試驗(yàn)因素水平見表6。
[0025] 表6正交試驗(yàn)因素水平表
[0026]
[0027] W表7所示的正交試驗(yàn)16組配方為母液進(jìn)行二倍稀釋，配制出16組不同比例與濃 度梯度的系列含四種香料的培養(yǎng)基，測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度，另設(shè)陰性 和陽性對(duì)照組;所得結(jié)果如表7所示。
[002引表7正交試驗(yàn)表
[0029]
[0030] 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和極差分析，比較四種芳香醒類食 用香料復(fù)配后對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度的差異顯著性。
[0031] 通過直觀分析可W看出，在16組中15號(hào)芳香醒類食用香料復(fù)配組合對(duì)金黃色葡萄 球菌的抑菌活性最強(qiáng)，最小抑菌濃度為117mg/L，