一種利用水產品下腳料生產抗菌營養復合型飼料添加劑的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及飼料添加劑技術領域，更具體地，涉及一種利用水產品下腳料生產抗菌營養復合型飼料添加劑的方法。
【背景技術】
[0002]我國水產品加工下腳料數量龐大，再利用水平低，浪費和環境污染嚴重，探尋高附加值和低排放再加工新方法成為當務之急。飼用活性肽是一種高值、低門檻產品，成為海洋低值蛋白開發和利用的新途徑。抗菌肽和營養小肽作為飼用活性肽主要成員被認為是目前最具潛力的飼用抗生素替代品。
[0003]芽孢桿菌抗菌脂肽是抗菌肽家族中的一類，其成員通常有表面活性素(surfactin)、芬養素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)、桿菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。這類抗菌肽具有顯著的抗細菌、霉菌、病毒和原蟲等功效，對酸堿和熱處理有非常好的穩定性，且口服是安全的；以上這些特性有助于其在飼料添加劑行業的廣泛應用。芽孢桿菌抗菌脂肽的部分成員已被應用于動物養殖的抗病、促生長，其效果顯著。但在應用的過程中還存在菌種產脂肽能力相對偏低；產物抗菌譜相對較窄，抗菌針對性單一；發酵產率偏低等難題。尤其是液態發酵生產芽孢桿菌抗菌脂肽，由于會產生大量泡沫，罐效低，成為產業化的瓶頸。
[0004]飼用營養小肽是蛋白質水解的中間產物，是由2個或2個以上氨基酸殘基組成的化合物。營養小肽因具有高吸收性、高轉化率和免疫刺激作用，添加于詞料中能顯著提高動物存活率，促進飼料中礦物質元素吸收利用和飼料轉化，促進動物體內蛋白質的合成，并增強動物體自身免疫力，從而實現養殖大幅度增產及增效。目前，飼用活性營養小肽主要原料采用豆柏、羽毛粉、魚粉等蛋白質資源，采用酶解法、微生物發酵法或酶解法和微生物發酵法聯合進行生產。國內外參與此方面研究的企業較多，其產品已在一定范圍內得到應用，但還存在產率偏低、成本較高和功能相對單一等缺點，限制了進一步大范圍推廣。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種利用水產品下腳料生產抗菌營養復合型飼料添加劑的方法。
[0006]本發明的第二個目的是提供上述方法獲得的抗菌營養復合型飼料添加劑。
[0007]本發明的第三個目的是提供所述添加劑的應用。
[0008]本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的:
一種利用水產品加工下腳料生產抗菌營養復合型飼料添加劑的方法，包括以下步驟:
51.制備發酵配料:水產品下腳料絞碎，添加植物飼料蛋白、麩皮、甘蔗渣或稻殼，按質量比4?8:1:1:0.1?0.4混合得基料，再加入輔料和水；通過蒸煮、降溫后得發酵配料；
52.固體發酵:當S1所述發酵配料溫度為40°C時，接種納豆芽孢桿菌NT-6種子液，在25?35°C下發酵，空氣濕度控制在75?85%，36?72h后停止發酵；
S3.二次酶解:將發酵后的物料轉至保溫設備中，以3?5°C /30min的升溫速率將溫度升至45?55°C，并保溫2?5h，最后進行烘干，烘干后物料水分控制在12%以內，粉碎后即得。
[0009]現有技術中抗菌脂肽的發酵與營養小肽的發酵是分開的，目前利用水產品下腳料生產飼用活性肽工藝，產率低、成本高，產品功能相對單一；抗菌脂肽的生產成本高，抗菌譜窄，由于現有技術中上述兩種物質的生產工藝都存在一些缺點，如果能將抗菌脂肽發酵生產和營養小肽的酶解工藝相結合，不僅可以利用水產品下腳料低值蛋白作為芽孢桿菌的營養底物生產抗菌脂肽，還可以利用發酵過程中芽孢桿菌產生的復合蛋白酶酶解下腳料低值蛋白生產營養小肽；在以上思想的基礎上，申請人提出了一種生產復合有抗菌脂肽和營養小肽的生產方法，即對固態發酵進行優化，并在固態發酵的基礎上進行二次酶解，二次酶解后的產物富含抗菌脂肽、營養小肽、復合酶及芽孢桿菌益生菌。
[0010]優選地，S1所述蒸煮降溫為:在0.2Mpa壓力下通蒸汽蒸煮15?20min，蒸料后物料溫度降到25?40°C。
[0011]需要強調的是，本發明所述固體發酵與二次酶解聯合在一起，才能保證最終得到的產物富含抗菌脂肽、營養小肽、復合酶及芽孢桿菌益生菌。
[0012]優選地，所述納豆芽孢桿菌NT-6種子液的接種量為發酵配料質量的0.1?5 %。
[0013]優選地，S1所述水產品下腳料為羅非魚、鱈魚、扇貝裙邊、鰱魚、青鱗魚、草魚、鰹魚或蝦。
[0014]本發明所用的發酵菌種是納豆芽孢桿菌NT-6，又稱枯草芽孢桿菌納豆亞種(Bacillus subtilis subsp.natto) NT-6菌株，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8121，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期是2013年9月3日。
[0015]所述納豆芽孢桿菌NT-6種子液制備過程如下:
(1)種子培養基(g/L):胰蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 5.0，水1000mL，ρΗ7.2 ；
(2)種子的擴大培養:納芽孢桿菌ΝΤ-6菌株逐步擴大培養，接種于種子培養基通氣培養18h后，備用。
[0016]本發明所用的抗菌脂肽生產菌株納豆菌NT-6相對于其他芽孢桿菌產生的抗菌脂肽，其抗菌活性和抗菌譜具有明顯的優勢。該菌株產生的脂肽組分較目前報道的產抗菌脂肽相關菌株豐富得多，產生的抗菌脂肽組分中含有多達二十多種脂肽類同系物，這在現有脂肽產生菌株的報道中極為罕見。三組脂肽同系物的完美協同作用，使得該菌株產生的復合脂肽對多數供試的革蘭氏陰性、陽性細菌、霉菌具有顯著的抑制作用。此外，由于抗菌脂肽具有良好的表面活性作用，使得微生物難以產生耐藥性，并具有很好的抗病毒和抗原蟲作用。可用于防治動物養殖過程中的多種疾病(如耐藥細菌性腹瀉、球蟲病、豬細小病毒病、禽流感等)，使本發明所制得的飼料添加劑的使用范圍大大拓展。
[0017]優選地，S1所述植物飼料蛋白為豆柏、脫毒菜籽柏、脫毒棉籽柏、花生柏中的一種或兩種。
[0018]優選地，所述輔料為糖蜜或葡萄糖、谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀、MgS04.7H20o具體地，所述輔料含量為基料重量的1?5%糖蜜(或葡萄糖)、0.1?0.5%谷氨酸鈉、0.05?0.5% 磷酸氫二鉀、0.1 ?0.3% MgS04.7H20o
[0019]本發明提供上述方法獲得的抗菌營養復合型飼料添加劑；所述飼料添加劑含有復合抗菌脂肽、粗蛋白、多肽、納豆芽孢桿菌、木聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶。
[0020]具體地，所述復合抗菌脂肽的含量為2?20mg/g，多肽含量10?30%，納豆芽孢桿菌含量1.0?5.0 X 109cfu/g,木聚糖酶活5000?8000U/g，蛋白酶活600?1000U/g，淀粉酶活4000?8000U/g。
[0021]更優選地，本發明所用的下腳料獲得的復合型飼料添加劑中粗蛋白含量30?60%。
[0022]以抗菌脂肽高產優良納豆菌進行固態發酵生產飼用活性肽，產物不僅富含高活性抗菌脂肽，還含有大量營養小肽，同時終產物中還存在豐富的復合酶系和有益生作用的納豆芽孢桿菌。將復合抗菌脂肽、營養小肽、復合酶及芽孢桿菌益生菌等四種飼用防病促生長劑合并生產，不僅可以得到高濃度的抗菌脂肽產品，還可以解決營養小肽生產中蛋白質酶解所需的生物酶源問題，生產出的產品既具有抗菌脂肽的功能，又具有營養小肽的效果；同時由于基質中抗菌脂肽的存在還可以避免下腳料原料酶解過程的腐敗問題，可以采用原料免殺菌生產方式創新酶解工藝。
[0023]本發明所述復合抗菌脂肽是由iturins、fengycins和surfactins三類抗菌脂肽同系物中的部分或全部組分組成。其中iturins含有分子量為1043.2、1057.2、1071.0、1071.0Da 的同系物組分；Fengycins 含有分子量為 1491.7、1492.5、1505.7、1519.7Da 的同系物組分；Surfactins 含有分子量為 994.3、1009.0、1008.8、1009.9、1008.7、1022.7、1022.6、1036.8、1036.5、1036.6、1051.8、1050.6、1051.2、1051.6、1065.8、1080.2Da 的同系物組分。
[0024]本發明還提供所述抗菌營養復合型飼料添加劑在動物抗病中的應用。
[0025]本發明還提供所述抗菌營養復合型飼料添加劑在促進動物生長中的應用。
[0026]本發明所述飼料添加劑可以在飼料中直接添加或制成顆粒料，用于豬、牛、羊、禽和水產動物抗病促生長。
[0027]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
本發明提供了一種利用水產品加工下腳料生產抗菌營養復合型飼料添加劑的方法，即以水產品加工下腳料為主要原料，輔以飼用植物蛋白、麩皮、甘蔗渣(或稻殼)，接入納豆芽孢桿菌NT-6菌株，進行固態發酵并結合二次酶解調控技術，生產富含高活性復合抗菌脂肽、營養小肽、復合酶及芽孢桿菌益生菌的復合型飼用添加劑，本發明所用的抗菌脂肽生產方法與液態發酵相比優勢明顯，生產所用的原料為水產品加工副產物、飼用植物低值蛋白、麩皮和甘蔗渣等，可以顯著降低生產成本；此外，發酵設備簡單，單位基質濃度高，產量較高，且在生產中還可以避免出現大規模液體發酵生產抗菌脂肽過程中難以解決的泡沫問題；所述方法簡化工藝，大幅度降低成本，拓展產品的使用范圍，增強產品競爭力；還可以顯著提高下腳料的附加值，實現無渣排放高效環保型工業化生產，推動水產養殖業的可持續發展。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。