利用基于熱熔法的流化床包覆機進行包覆。為了此目的，在40°C下將氫化植物油 噴涂到吸收了微生物的MCC基質上以獲得40%的重量增加。調低入口空氣流量。
[0107] 3.第二包覆層-腸溶涂層
[0108] 海藻酸鈉被用作腸溶聚合物。制備海藻酸鈉的水溶液（2%w/w)。將海藻酸鈉溶 液噴涂到得到的被包覆的微生物上，直到獲得25%的的重量增加。
[0109] 4.第三包覆層-耐熱涂層
[0110] 殼聚糖被用作第三包覆層的耐熱聚合物。首先，利用HC1制備pH5的殼聚糖水溶 液（4%w/w)。將得到的溶液噴涂到得到的被包覆的微生物上，直到獲得20% (w/w)的重量 增加。
[0111] 實施例7
[0112] 測試封裝的益生菌微生物顆粒的耐熱性。因此，將來自實施例6的得到的封裝的 微生物顆粒暴露于85°C下45分鐘。然后，利用如下描述的計數程序確定CFU/g。
[0113] 嗜酸乳桿菌和雙歧乳桿菌計數程序：
[0114] 將10g樣品懸浮于90ml磷酸鹽緩沖液中并放置于胃托（Stomacher)中10分鐘。 然后，將得到的懸浮液搖動90分鐘。然后將混合物連續地（十倍地）稀釋，且最后倒入合 適的板培養基中。含有半胱氨酸或麥芽糖的MRS生長介質分別用于嗜酸菌（acidophilus) 和兩叉菌（bifidus)。然后將得到的板在厭氧條件下溫育3天。最后對微生物計數，并因此 計算CFU/g。
[0115] 結果：
[0116]
[0117] *最終產品中兩種微生物類型之間的重量比是1:1。
[0118] **微生物共混物構成最終產品的10 % (w/w)。
[0119] ***加熱過程在80°C下進行45分鐘。
[0120] 實施例8
[0121] 益牛菌餅干
[0122] 該益生菌餅干由0. 3g填充物和30g餅干組成。填充物：將以下成分在室溫下混合 (百分比是基于總填充物重量的重量百分比）：餅干配方：與1 %益生菌粉末混合的1份糖、 2份人造黃油、3份面粉。
[0123] 微牛物成活率
[0124] 最高溫度為約200°C，應用多達4. 5分鐘；其適合大多數工業餅干生產。烘焙后維 持約50 %活微生物。
[0125]實施例9
[0126] 益牛菌面包
[0127] 該益生菌面包由0. 3g填充物和30g面包組成。
[0128] 微牛物成活率
[0129] 在模擬中獲得的微生物成活率水平在50%至80%之間。以109微生物每克的起 始點在200°C下烘焙10分鐘后獲得了多達83%活微生物。
[0130]實施例10
[0131] 在干燥條件下枏據本發明的封裝的益牛菌微牛物的耐熱件評估
[0132] Jii
[0133] 評估利用基于本發明的技術封裝的益生菌微生物在干燥條件下與未包覆的益生 菌微生物相比的耐熱性和成活率。
[0134]
[0135] 將封裝的益生菌微生物和未封裝的益生菌微生物（嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌）兩者 均放置于預熱至80°C的烘箱中30分鐘或45分鐘。然后將益生菌取出并進行CFU測試以確 定微封裝的微生物與未封裝的微生物對比的成活率。結果顯示未封裝的益生菌暴露于如此 熱的條件可能是災難性的，其中不能計算CFU/g，這表明未封裝的微生物發生全部破壞。相 反，基于根據本發明的微囊化過程的封裝的益生菌在這樣的熱處理條件之后在生活力測試 中未顯示顯著的減少。基于這些結果，可推斷，利用基于本發明的多層包覆的微囊化過程在 以上所述的條件下對益生菌提供耐熱性。
[0136] Mfi
[0137] 2克根據本發明的被包覆的益生菌混合微生物（嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌）。表1 中呈現了包覆層的組成。
[0138] 2克未包覆的混合細菌（嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌）
[0139] 7ffe
[0140] 根據制造者加工記錄批號RDEN904051和RDEN904051進行微囊化過程。
[0141] 表1 :微囊化過程的不同步驟的組分
[0142]
[0143]加熱測試
[0144] 將微封裝的和未封裝的（對照）益生菌兩者引入預熱至80°C的烘箱中，持續30分 鐘或45分鐘。
[0145]CFU測試
[0146] 利用如下描述的方法在加熱過程之前和之后對細菌進行CFU測試；
[0147] 1) 10g樣品與90ml磷酸鹽緩沖液。
[0148] 2)胃托10分鐘。
[0149] 3)搖動樣品90分鐘。
[0150] 4)十倍地稀釋。
[0151] 5)傾注培養法。
[0152] 6)對于嗜酸菌，利用具有半胱氨酸的MRS。
[0153] 7)對于兩叉菌，利用具有麥芽糖而不是乳糖的MRS。
[0154] 8)在厭氧條件下溫育3天。
[0155] 9)對細菌計數并計算CFU/g。該方法已在別處詳細地描述（K.G.deC.Lima等人 /LWT-FoodScienceandTechnology42 (2009)，491-494)。
[0156] 對于封裝的益生菌細菌，首先，在應用以上CFU方法之前利用研缽和杵破壞包圍 微生物的多層殼。
[0157]
[0158] 表2.囊化過程對CFU的影響
[0159]
[0160] *最終產品中兩種微生物之間的重量比是1:1。
[0161] **微生物共混化合物構成最終產品的10 % (w/w)。
[0162] 表3.干燥條件下熱處理對益生菌微生物的成活率的影響
[0163]
[0164] 結論
[0165] 基于表3的結果，可推斷，利用根據本發明的多層包覆過程的微囊化過程在干燥 條件下對益生菌提供耐熱性。
[0166] 實施例11
[0167] 在半烘焙條件下枏據本發明的封裝的益牛菌微牛物的耐熱件評估
[0168] Jii
[0169] 評估利用根據本發明的技術封裝的益生菌微生物在半烘焙條件下與未包覆的益 生菌微生物相比的耐熱性和成活率。
[0170]
[0171] 將封裝的益生菌微生物和未封裝的益生菌微生物（嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌）兩者 均與白面包成分混合并在180°C、70%濕度下經受烘焙40分鐘。為了能夠從烘焙的面團中 收集微生物，利用被稱為"干酪包布（Cheesecloth)"和"餛飩（Ravioli)"的兩種不同的方 法將封裝的微生物和未封裝的微生物兩者均放入面團中。因此，間接地通過利用干酪包布 將微生物加入面團中以分離微生物與面團（干酪包布方法實驗I)，或直接地通過產生由預 先含有微生物的相同面團構成的分離的袋（餛飩方法實驗II)將微生物加入面團中。根據 干酪包布方法，微生物被預先裝入干酪包布中，然后在烘焙過程之前將干酪包布放入面團 中（實驗la)，或將微生物放置于干酪包布薄片上，通過在面團塊的中心產生小碗狀物并由 干酪包布薄片填充小碗狀物而將干酪包布薄片預先放入面團中（實驗lb)。根據"餛飩"方 法，首先由面團形成小袋樣餛飩，在餛飩中放置2克被包覆的混合微生物并封閉餛飩。然后 將袋放置在面團塊的中心。通過這些方式，還可阻止烘焙過程之后面團粘附到微生物。阻 止面團粘附到微生物是重要的，因為在這樣的實驗中，面團在壓碎過程中作為"減震器"可 構成對抗壓碎力的機械屏障。通過這種方式，可確保在測試CFU之前涂層在壓碎過程期間 被完全破壞。烘焙后，分開微生物并確定每種微生物菌株以及封裝的微生物和未封裝的微 生物的CFU/g。
[0172]CFU結果清楚地顯示未包覆的微生物不能在烘焙條件下存活，而封裝的微生物證 明了在烘焙過程期間的耐熱性及在烘焙過程后高成活率值。
[0173] Mfi
[0174] 3杯面粉
[0175] 10克酵母
[0176] 2湯匙橄欖油
[0177] 1/8茶匙鹽
[0178] 水
[0179] 2克被包覆的益生菌混合微生物（嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌）
[0180] 2克未包覆的混合細菌（嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌）
[0181] 方法
[0182] 烘焙討稈
[0183] 將面包成分混合在一起，且捏和幾分鐘后使面團發起。然后將面團分成單獨的塊。 通過利用如以下所述的兩種不同的"干酪包布"和"餛飩"方法（分別由實驗I和實驗II陳 述）將微生物放入面團塊中。
[0184] 實驗I- "干酪包布"方法
[0185] 實驗la-封裝的微生物和未封裝的微生物預先裝入"干酪包布"中后，將封裝的和 未封裝的微生物兩者均放入面團中。將2g封裝的微生物或未封裝的微生物放置于每個面 團塊的中部。
[0186] 實驗lb-將2g封裝的微生物放置于干酪包布薄片的表面上，通過產生碗狀物并用 干酪包布薄片填充而將干酪包布薄片預先放入面團塊的中部。然后用剩余的面團覆蓋碗狀 物。
[0187] 實驗II- "餛蝕"方法
[0188] 首先由面團形成小袋樣餛飩，在餛飩中放置2克封裝的混合微生物并封閉餛飩。 然后將袋放置在面團塊的中心。
[0189] 使面團發起另外的15分鐘。
[0190] 在180 °C下進行烘焙40分鐘。
[0191] 在烘箱的底架上放置帶有1/2升水的金屬托盤以在將面包塊放入烘箱中之前在 烘箱內部產生濕度。在將面包塊放入烘箱中之前測量烘箱內部產生的濕度。為了達到最佳 的烘焙濕度標準，當濕度達到60% -70%之間時將面包塊放入烘箱中。面團塊被烘焙后將 微生物容易地分出并送至CFU測試。
[0192] CFU測試
[0193] 利用如下描述的方法在烘焙過程之前和之后對微生物進行CFU測試；
[0194] 1. 10g樣品與90ml磷酸鹽緩沖液。
[0195] 2.胃托10分鐘。
[0196] 3.搖動樣品90分鐘。
[0197] 4.十倍地稀釋。
[0198] 5.傾注培養法。
[0199] 6.對于嗜酸菌，利用具有半胱氨酸的MRS。
[0200] 7.對于兩叉菌，利用具有麥芽糖而不是乳糖的MRS。
[0201] 8.在厭氧條件下溫育3天。
[0202] 9.對微生物計數并計算CFU/g。
[0203] 該方法已在別處詳細地描述（K.G.deC.Lima等人/LWT-FoodScienceand Technology42(2009)，491-494)。
[0204] 對于封裝的益生菌細菌，首先，在應用以上CFU方法之前利用研缽和杵破壞包圍 微生物的多層殼。
[0205] 結果
[0206] 表4:在烘焙條件之前和之后封裝和未封裝的CFU/g
[0207]
[0209] 結論
[0210] 以上獲得的結果顯示，利用根據本發明的技術的封裝益生菌微生物在烘焙過程期 間在暴露于面團中存在的濕度時是耐烘焙熱的。
[0211] 實施例12
[0212] 在全烘焙條件下枏據本發明的封裝的益牛菌微牛物的耐熱件評估
[0213] Jii
[0214] 利用商業程序，評估利用根據本發明的技術封裝的益生菌微生物在全烘焙條件下 的耐熱性和成活率。該研究被設計為顯示根據本發明的耐烘焙過程的封裝益生菌的概念的 可行性，在烘焙過程中封裝益生菌經受剪切力、濕度和熱。
[0215] 摘要
[0216] 該研究的目的是評估根據本發明的封裝益生菌在商業使用的烘焙過程中的抵抗 力。因此，封裝益生菌直接加到面團中，面團首先遭受捏和的剪切力且隨后遭受烘焙過程的 熱和濕度。設計該過程以便模擬商業程序中進行的烘焙過程。為了此目的，將根據本發明的 封裝益生菌直接加入面粉和其它成分中，然后在其上加入水（直接加入法），且隨后捏和并 烘焙。因此，將封裝益生菌直接加入面團制作成分中，且然后通過捏和而均勻地分布在面團 中，封裝益生菌在面團中遭受在面團制作步驟期間的潮濕環境，隨后遭受烘焙過程的加熱。 烘焙過程之后，進行CFU測試以確定封裝微生物的成活率。CFU結果明顯地顯示，烘焙過程 后封裝的微生物證明