一種烏鱧的抗病免疫增強劑環-(苯丙氨酸-絲氨酸)的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水產養殖領域，是一種烏鱧的抗病免疫增強劑及其綜合飼養方法。
【背景技術】
[0002] 烏鱧（Oa/Maargys)隸屬鱸形目，鱧科，鱧屬。因烏鱧是適合東北特有的氣候和 水域特點且抗逆性強的品種，又因其營養價值高、味道鮮美，有各種吃法，是很受國內外市 場歡迎的品種。近年來，已對烏鱧進行馴化及人工繁育的突破，配合飼料的營養組成已有系 統研究。但在高密度集約化養殖中，面臨各種環境脅迫，進入高密度養殖水體中的消毒劑和 藥物能夠影響胃腸道微生物菌群的完整性，降低生產性能，抑制免疫反應。水產養殖中控制 疾病的最有效的方法之一就是通過免疫增強劑的預防管理增強魚的防御機制。從這方面 看，許多中草藥和其他天然免疫增強劑被篩選出并被認為是水產疾病管理中較有效的替代 方法，并且許多具有抗菌性能的天然免疫增強劑的應用已經被提出。通過微生態制劑處理 漁用飼料，可以改善飼料的品質，提高飼料的營養價值和飼料轉化效率，提高水產動物的免 疫力，促進動物生長。近來許多研究表明利用細菌細胞基質產品控制魚類疾病是由于它們 那獨一無二產生新奇的代謝物的能力。所以，根據科研和實踐的經驗總結和梳理，海洋細菌 代謝產物環-(苯丙氨酸-絲氨酸）可作為烏體的一種有前景的抗病 免疫增強劑。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的之一是提供一種烏鱧抗病免疫增強劑環_ (苯丙氨酸-絲氨酸）。
[0004] 環-(苯丙氨酸-絲氨酸）作為烏鱧飼料添加劑的應用。
[0005] 所述的烏鱧飼料添加劑為提高烏鱧抗病能力及促生長添加劑。
[0006] 一種烏鱧的配合飼料，按質量份： 進口魚粉15. 2~16. 0、國產魚粉15. 3~19. 0、環-(苯丙氨酸-絲氨酸）0. 5~2. 0、維 生素預混料1. 〇、蠶蛹3. 5~4. 5、血球蛋白粉2. 40~3. 2、礦物質預混料2. 0、豆柏16. 0~ 19. 00、花生柏7. 0~10. 0、面粉25. 40~31. 00、魚油2. 12~2. 6、玉米5. 5~6. 5、棉柏 5. 6~7. 5、菜柏5. 2~6. 3、墨魚粉2. 3~2. 5,混合后，膨化。
[0007] 優選：進口魚粉15. 23~15. 6、國產魚粉15. 38~15. 84、環-(苯丙氨酸-絲氨 酸）0. 5~2. 0、維生素預混料1. 0、蠶蛹3. 5~4. 4、血球蛋白粉2. 45~3. 2、礦物質預混 料2. 0、豆柏16. 5~18. 75、花生柏7. 0~8. 84、面粉25. 42~30. 2、魚油2. 2~2. 5、玉米 5. 5~6. 5、棉柏5. 6~7. 5、菜柏5. 2~6. 3、墨魚粉2. 3~2. 5,混合后，膨化。
[0008] 優選：進口魚粉15. 6、國產魚粉15. 84、環-(苯丙氨酸-絲氨酸）0? 5、蠶蛹3. 5、 豆柏16. 5、血球蛋白粉2. 45、花生柏7. 0、面粉30. 2、維生素預混料1. 0、魚油2. 2、玉米5. 5、 礦物質預混料2. 0、棉柏5. 6、菜柏5. 3、墨魚粉2. 3 ; 優選：進口魚粉15. 36、國產魚粉15. 38、環-(苯丙氨酸-絲氨酸）1.0、蠶蛹4. 25、棉 柏6.8、血球蛋白粉2. 56、菜柏5. 2、豆柏18. 75、墨魚粉2. 5、花生柏8.84、面粉26. 2、維生素 預混料I.O、魚油2. 5、礦物質預混料2.O、玉米6. 3 ; 優選：進口魚粉15.23、國產魚粉15. 6、棉柏7.5、環-(苯丙氨酸-絲氨酸）2.0、菜柏 6. 3、蠶蛹4. 4、墨魚粉2. 4、血球蛋白粉3. 2、豆柏18. 62、維生素預混料1. 0、花生柏9. 68、面 粉25. 42、魚油2. 4、玉米6. 5、礦物質預混料2. 0 ; 所述的維生素預混料： 鹽酸硫胺素，15mg;核黃素，20g;葉酸，I. 5g;鹽酸啦咳醇，4g;尼克酸，80g;泛酸I丐， 28g;肌醇，40g;生物素，0.6g;VitB3,30mg;VitB9,3.0mg;VitB12,0.01g;VitA，6000IU; VitD3,0.005g;VitC，200mg;VitD，2000IU;VitE，50mg;VitK，5.0mg，載體為脫脂米糠。
[0009] 所述的礦物質預混料： 磷酸二氫鈉，450g;氯化鉀，129g;七水硫酸鎂，102g;五水硫酸銅，0. 6g;檸檬酸鐵 150mg;七水硫酸鋅，80mg;-水硫酸錳，3. 25g;六水三氯化鋁，0. 15g;碘化鉀，0. 23g;亞硒 酸鈉，〇?Olg;七水硫酸鈷〇? 〇30g。
[0010] 一種烏鱧綜合飼養的方法如下： 1、 每10畝塘放養體長10-15cm左右的烏鱧魚種50000尾、搭配養殖的魚類有：鰱（30g /尾）2000尾，鳙（20g/尾）800尾，鯉（40g/尾）800尾，鯽（30g/尾）800尾，細鱗斜 頌鲴（20g/尾）500尾； 2、 先將鰱魚、鳙魚放養魚池中，適應3d，每畝施用光合細菌200g調水2d后放養鯉、鯽和 細鱗斜頌鲴； 3、 烏鱧魚苗饑餓2d，投喂上述一種烏鱧配合飼料馴食，待3~5d完全攝食后，再與鰱、 鳙、鯉、鯽和細鱗斜頌鲴混養； 4、 每天投喂上述一種烏鱧配合飼料，三個月后捕撈。
[0011] 本發明為烏鱧的一種免疫增強劑環-(苯丙氨酸-絲氨酸），添加海洋細菌 /wh辦代謝物可抵抗常見的淡水細菌性魚病的發生，與鰱、鳙、鯉、鯽和細鱗 斜頌鲴共同飼養，可充分利用水體的餌料資源和水體空間，綜合飼養經濟效益更高，適合東 北地區應用，商品魚肉質好、口味極佳。
[0012] 具體優點如下： 1、配方科學、營養均衡，搭配各種蛋白飼料，使得氨基酸互補，飼料和魚體必需氨基酸 平衡關聯程度最佳，確保飼料系數低，使得魚體生長快。
[0013] 2、飼料中含有海洋細菌代謝產物環_(苯丙氨酸-絲氨酸） 可作為免疫增強劑對烏鱧IL-IP基因表達、體液反應和抗病力等都有正面影響，可有效地 增強烏鱧的抗防病能力，提高養殖的成活率。
[0014] 3、精選的蠶蛹、血球蛋白粉、花生柏和墨魚粉的劑量和搭配比例使得飼料具有特 有的顏色和氣味，可使烏鱧迅速轉食和攝食，提高飼料的利用率。
[0015] 4、不同食性、不同水層的魚類進行搭配養殖，充分利用水體和空間，達到生態健康 養殖。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1環-(苯丙氨酸-絲氨酸）的提取 (1)發酵及發酵產物提取： 海洋細菌/wtit/a活化2~3天后，從平板上挑取適量單菌落接種到含有IOmLMB液體培養基的試管中，30°C、150r/min振蕩培養1.5天。然后將菌液以5%(V/ V)的接種量接種到裝有100mL培養基的錐形瓶中，30°C、150r/min振蕩培養1.5天。將菌 液以5%(V/V)的接種量接種至1000mL培養基的錐形瓶中，30°C、150r/min振蕩培養5 天。擴大培養后的細菌發酵液用等體積的含有5%丙酮的乙酸乙酯進行萃取，菌液與提取液 以一定比例混合，每瓶菌液萃取三次（第一次按菌液與混合液1 :1的比例萃取，第二次按 菌液與混合液2 :1的比例，第三次按菌液與混合液4 :1的比例）。收集上層有機相，然后將 萃取液在旋轉蒸發儀上水浴溫度37°C，真空度82mbar條件下蒸餾濃縮，濃縮到一定體積 后轉移到小體積的梨形旋蒸瓶中，再次進行濃縮，移入已稱重的小離心管，氮吹儀吹干后稱 重，記錄質量后4°C避光保存，備用。共得到粗提物約6.2g。
[0017] (2)薄層層析： 取GF254薄層層析硅膠板置于IKTC恒溫鼓風干燥箱中活化Ih，待降至常溫后開始進 行點樣。先用鉛筆在層析上距末端Icm處輕輕畫一橫線，然后用毛細管吸取樣液在橫線上 輕輕點樣，點的直徑在2 _以內。將點了樣的薄層板放入已預飽和展開劑的層析缸中，密 封展開缸頂的蓋。由于毛細管作用，展開溶劑在薄層板上緩慢前進，前進至距離頂端Icm 處時，取出薄層板，樣品組分因移動速度不同而彼此分離。展開后的薄層板經過干燥后，用 紫外光燈暗室中照射（A為254nm和365nm)觀察檢出斑點情況。展開分離后，化合物在 薄層板上的位置用比移值（Rf?值）表示。化合物斑點中心至原點的距離與溶劑前沿至原點 的距離的比值就是該化合物的Rf值。本實驗通過試驗不同的二氯甲烷+甲醇體系，選取比 值Rf介于〇. 2到0. 4之間的溶劑比例：二氯甲烷：甲醇的洗脫體系比例分別為70 :1、30 :1、 8 :1、2 :1、丙酮、甲醇。
[0018] (3)分離： 取粗提物6. 2g經200-300目減壓桂膠柱層析，以70 :1、30 :1、8 :1、2 :1、丙酮、甲醇七個 極性系統快速洗脫，共得七個組分：Fr.a、Fr.b、Fr.c、Fr.d、Fr.e、Fr.f、Fr.g、Fr.h。Fr.b 部分經ODS減壓柱色譜，流動相為甲醇：水比例依次為20: 80、40: 60、60: 40、80: 20、95: 5、甲醇，得到 6 個組分：Fr.b-l、Fr.b-2、F;r.b-3、F;r.b-4、F;r.b-5、F;r.b-6。
[0019] 其中Fr.b-1又經ODS加壓柱色譜，以甲醇：水比例為12:88~100梯度洗脫，最 后用HPLC(RP-18)分離與純化，得到化合物環-(苯丙氨酸-絲氨酸）（13mg)、環-(丙 氨酸-色氨酸）（12mg)、環-(羥脯氨酸-苯丙氨酸）10mg、環-(酪氨酸-纈氨酸）（6 mg)、環_(酪氨酸-丙氨酸）（2mg)、環-(酪氨酸-甘氨酸）（5. 5mg)和環-(酪氨酸-色 氨酸）（11.6mg)，收集環-(苯丙氨酸-絲氨酸）。
[0020] 環-(苯丙氨酸-絲氨酸）化學結構為：
白色無定型粉末；FABMS(positivemode)m/z235. 4 [M+H] + ; [a]25D-66. 7°(c0? 09， EtOHk1HNMR(500MHz，DMS0-d6) 5 8.03 (1H，s，NH)，7.91 (1H，s，NH)，7.28 (2H，t，J=7.5Hz，H-3'，5'），7.17 (2H，d，J=7.5Hz，H-2'，6'），7.22 (lH，t，J=7.5Hz，H-4'），4.04 (1H，m，H-3)，3. 65 (1H，m，H-6)，3. 28，2. 83(2H，m，CH2OH)，3. 08，2. 98 (2H，m，H-7); 13CNMR(125MHz，APT，DMSO)S167. 65 (s，C-2)，56. 61 (d，C-3)，166. 87 (s，C-5)，58. 26 (d，C-6)，41.03 (，tC-7)，137.76 (s，C-l，），131.10 (d，C-2'，6'），129.26 (d，C-3'， 5'），127. 65 (d，C-4'），64. 25 (t，CH2OH)。
[0021] 實施例2材料和方法 健康的烏鱧，80g左右，運到實驗室后隨機分布在200L流水式水槽內。正式試驗前馴 化14d以適應實驗室的條件(溶解氧5. 50 ± 0. 68mg/L;pH7. 2 ± 0. 5;亞硝酸鹽：0.022 ± 0.01mg/L;氨氮 0.14 ± 0.05mg/L;23 ± 2°C)，試