一種克氏原鰲蝦非特異性免疫增強劑的制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及水產養殖技術領域，涉及鰲蝦等甲殼類水產動物增強機體免疫功能的 方法，尤其涉及一種克氏原鰲蝦非特異性免疫增強劑的制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 克氏原螯好（Procambarus clarkii)俗稱小龍好，是目前全世界分布最廣的淡水 螯蝦養殖種類，在我國長江中下游地區均有養殖。克氏原螯蝦味道鮮美，磷、鈣、鐵等元素含 量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，具有較高營養和食療價值，近年來國內外需求量不斷上 升，致使其養殖總量也逐年增大，2012年，我國克氏原螯蝦總產量為55. 48萬噸，比2011年 增加14.09%。近年來，隨著現代工業發展，環境污染加劇導致了養殖螯蝦蝦體免疫機能降 低、生長速度變緩、餌料效率下降及病原體疾病頻發等問題。
[0003] 螯蝦等甲殼類水產動物抵御外界脅迫因子的最好方法是增強動物機體的免疫功 能，如申請號為201310406260. 4 (申請公告號為CN103431244A)的中國發明專利《一種提供 克氏原鰲蝦幼蝦免疫力的維生素飼料及添加劑》公開了一種維生素飼料，該飼料包括如下 按質量百分比計的組分：小麥粉10-30%，玉米粉10-20%，礦物質1-2%，魚粉10-30%，黃豆粉 30-50%，魚油 1-3%，維生素 A0. 0048-0. 0060%，維生素 C0. 02-0. 08%，維生素 E0. 02-. 0. 06%， 余量為糊精。該飼料及添加劑能提高克氏原鰲蝦幼蝦的成活率、體重增長率及腮中酚氧化 酶的活性，并降低蝦肝胰腺中MDA含量，提高其免疫力。
[0004] 然而，由于鰲蝦等甲殼類水產動物的體液中不具有免疫球蛋白，因而其免疫主要 為非特異性免疫。蛋白水解肽可與機體必需微量金屬元素結合，形成蛋白肽-金屬配合物 (有機金屬化合物)，其在提高生物體的生長繁殖、增強抗病免疫力、調節生理代謝等方面都 有重要生理作用。Gelinsky等制備了谷胱甘肽及其衍生肽與Zn 2+的配合物，并證實螯合制 備的蛋白肽-Zn2+配合物可滿足人體對谷胱甘肽的需求。郭存榮等將蛋白肽-Zn 2+配合物進 行羅非魚養殖試驗，發現飼料中添加該配合物顯著提高了羅非魚的生長性能、飼料利用率、 血清溶菌酶及S0D活力。Deng等以低值魚類為原料，經酶解、金屬螯合制備了蛋白肽-Fe 2+ 配合物，經研究發現制備的配合物具有較強抗氧化和清除自由基活性。目前，關于帶魚加工 副產物水解肽-金屬配合物，對于克氏原螯蝦等甲殼類水產動物生長及非特異性免疫的影 響研究，尚未見報道。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對現有技術而提供一種利用蛋白水解肽-金屬 配合物的克氏原鰲蝦非特異性免疫增強劑的制備方法。
[0006] 本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種上述克氏原鰲蝦非特異性免疫增 強劑在增強克氏原鰲蝦非特異性免疫方面的應用。
[0007] 本發明解決第一個技術問題所采用的技術方案為：一種克氏原鰲蝦非特異性免疫 增強劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
[0008] (1)取帶魚加工副產物，加入磷酸緩沖液，40~50°C保溫10~15min，接著經組 織打碎、超聲處理后，加入2~8g/L復合水解酶，控制溫度為水浴恒溫37~60°C，水解度 為20~30%，前述磷酸緩沖液的濃度為0. 05~0. 20mol/L，pH值為6. 8~7. 6,磷酸緩沖 液與帶魚加工副產物的體積比為4~6:1，前述復合水解酶為質量比為1~3:1:1的風味 蛋白酶、木瓜蛋白酶以及堿性蛋白酶的混合物，前述超聲波處理條件為25~40KHZ，時間為 L 0 ~4. Omin ;
[0009] (2)繼續升溫至85~95°C，保持2. 0~3. Omin后，冰浴快速冷卻至0~4°C， 3000~4500r/min離心分離10~20min獲得上清液，即為帶魚加工副產物蛋白肽水解液；
[0010] (3)調節上述獲得的帶魚加工副產物蛋白肽水解液pH值至6. 9~7. 1，加入終濃 度為1. 0~3. Og/L的金屬元素，同時加入少量的Ve保護，形成螯合反應體系，調節螯合反 應體系pH為4. 0~7. 0,在20~35°C恒溫條件下進行水浴振蕩，螯合反應20~40min，前 述金屬元素為Fe2+、Ca 2+、Zn2+中的一種或幾種混合物；
[0011] (4)螯合反應結束后，8000~10000r/min離心分離15~25min，將獲得的上清液 采用超/納濾截留獲得分子量<1500Da水解肽-金屬元素配合物，經真空濃縮、真空冷凍干 燥后，得帶魚加工副產物蛋白水解肽-金屬元素配合物，即非特異性免疫增強劑。
[0012] 本發明解決另一個技術問題所采用的技術方案為：一種如權利要求1所述的克氏 原鰲蝦非特異性免疫增強劑的應用，其特征在于：所述非特異性免疫增強劑在提高克氏原 鰲蝦免疫指標的應用。
[0013] 所述氏原鰲蝦免疫指標包括血清以及肝胰腺組織中S0D、P0、LSZ和ACP酶活力，其 中S0D (超氧化物歧化酶)是生物體內重要的抗氧化酶，是生物體內清楚自由基的首要物質， 可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的 對細胞傷害；P0 (過氧化物酶)主要存在于細胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化 過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用；LSZ (溶 菌酶)主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的0-1，4糖苷鍵， 使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂，內容物逸出而使細菌溶解，還 可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活，具有抗 菌、消炎、抗病毒等作用；ACP(酸性磷酸酶）主要存在于巨噬細胞，定位于溶酶體內。
[0014] 本發明中該非特異性免疫增強劑在克氏原鰲蝦飼養中的具體應用為：在克氏原鰲 蝦常規基礎營養飼料中，以800~1500mg/kg的比例加入所述非特異性免疫增強劑，作為克 氏原鰲蝦日常飼喂餌料，通過混加入克氏原鰲蝦常規飼料的方式應用該非特異性免疫增強 劑，不僅操作簡單，并且可使蝦體更好地攝入和吸收，從而有效增強蝦體的免疫機能，更好 地抵御各種鰲蝦常見病的侵害。
[0015] 與現有技術相比，本發明的優點在于：利用帶魚加工副產物(如魚頭、魚骨、碎肉 等）獲取蛋白水解肽，再利用螯合反應結合金屬元素制備出具有增強克氏原鰲蝦免疫功能 的蛋白水解肽-金屬元素配合物。該發明利用帶魚加工副產物作為原料，不僅降低了成本， 提高了經濟效益，而且減少了帶魚加工產業對環境的污染，并且該制備方法操作簡單、易 控，產物得率高；同時該發明中通過添加如鰲蝦常規飼料的方式將非特異性免疫增強劑應 用于克氏原鰲蝦飼養中，不僅操作簡單，可使蝦體更好地攝入和吸收，從而有效增強蝦體的 免疫機能，更好地抵御各種鰲蝦常見病的侵害。
【具體實施方式】
[0016] 以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0017] 實施例1 :
[0018] 取帶魚加工副產物400g，加入1600ml磷酸緩沖液（0? lmol/L，pH7. 5)，45°C保溫 lOmin，接著組織打碎2. 0min，30KHz超聲處理2. Omin，加入12g復合酶（風味蛋白酶、木瓜 蛋白酶及堿性蛋白酶三者復合比例為1 : 1 : 1)，將該混合體系置于45°C恒溫水浴振蕩器 中，100以1^11充分酶解，控制水解度達到20%后，升溫至901：，保持2.0111111后，冰浴快速冷 卻，4000g離心12min，獲得上清液即為帶魚加工副產物蛋白肽水解液。
[0019] 調節蛋白肽水解液的pH值至7,加入FeCl2，使Fe 2+終濃度為1. 5g/L，同時加入少 量Ve保護，形成螯合反應體系，調節螯合反應體系pH為6. 0,在20°C恒溫條件下進行水浴 振蕩，螯合反應30min。螯合反應結束后，9000r/min離心分離20min，將獲得的上清液采用 實驗室納濾分離設備，納濾截留獲得分子量<1500Da水解肽-金屬元素配合物，經真空濃 縮、真空冷凍干燥后，得帶魚加工副產物蛋白水解肽-金屬元素配合物，即非特異性免疫增 強劑。
[0020] 實施例2 :
[0021] 取帶魚加工副產物300g，加入1500ml磷酸緩沖液（0? 2mol/L，pH7)，40°C保溫 15min，接著組織打碎2. 0min，40KHz超聲處理1. Omin，加入9g復合酶（風味蛋白酶、木瓜 蛋白酶及堿性蛋白酶三者復合比例為2 : 1 : 1)，將該混合體系置于37°C恒溫水浴振蕩器 中，100r/min充分酶解，控制水解度達到25%后，升溫至95°C，保持2. Omin后，冰浴快速冷 卻，3000g離心20min，獲得上清液即為帶魚加工副產物蛋白肽水解液。
[0022] 調節蛋白肽水解液的pH值至7,加入？冗12和211(：12 (質量比為1:1)，使Fe2+和 Zn2+終濃度為3g/L，同時加入少量V e保護，形成螯合反應體系，調節螯合反應體系pH為 4. 0，在30°C恒溫條件下進行水浴振蕩，螯合反應40min。螯合反應結束后，8000r/min離心 分離15min，將獲得的上清液采用實驗室超濾分離設備，超濾截留獲得分子量<1500Da水解 肽-金屬元素配合物，經真空濃縮、真空冷凍干燥后，得帶魚加工副產物蛋白水解肽-金屬 元素配合物，即非特異性免疫增強劑。
[0023] 實施例3:
[0024] 取帶魚加工副產物200g，加入1600ml磷酸緩沖液（0? 05mol/L，pH6. 8)，50°C保溫 lOmin，接著組織打碎2. 0min，25KHz超聲處理1. Omin，加入7. 2g復合酶（風味蛋白酶、木瓜 蛋白酶及堿性蛋白酶三者復合比例為3 : 1 : 1)，將該混合體系置于60°C恒溫水浴振蕩器 中，100r/min充分酶解，控制水解度達到30%后，升溫至85°C，保持3. Omin后，冰浴快速冷 卻，4500g離心10min，獲得上清液即為帶魚加工副產物蛋白肽水解液。
[0025] 調節蛋白肽水解液的pH值至7,加入CaCl2，使Ca 2+終濃度為lg/L，同時加入少量 保護，形成螯合反應體系，調節螯合反應體系pH為7. 0,在35°C恒溫條件下進行水浴振 蕩，螯合反應20min。螯合反應結束后，10000r/min離心分離40min，將獲得的上清液采用采 用實驗室納濾分離設備，納濾截留獲得分子量<1500Da水解肽-金屬元素配合物，經真空濃 縮、真空冷凍干燥后，得帶魚加工副產物蛋白水解肽-金屬元素配合物，即非特異性免疫增 強劑。
[0026] 實施例4:
[0027] 本實施例中克氏原鰲蝦的基礎飼料為：魚粉37. 0%、豆柏28. 0%、大豆油2. 5%、魚 油2. 5%、玉米粉10. 0%、小麥粉15. 0%、復合維生素及各種礦質元素3. 0%、羧甲基纖維素鈉 2. 0%。經測定，基礎飼料營養水平為粗蛋白28.