一種高純度大米谷蛋白的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種大米谷蛋白的提取方法。
【背景技術】
[0002]大米蛋白主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白四種蛋白組成。其中的谷蛋白主要存在于二型蛋白體(PB-1I )，谷蛋白分子基本上由22KDa、37?39KDa、57KDa三個亞基組成。
[0003]研究表明，富含谷蛋白的大米蛋白具有降低膽固醇的良好功效，因此，大米谷蛋白的有效提取，將為我國大力開發功能性大米蛋白的應用提供理論依據，具有廣泛、深遠的應用意義。
[0004]傳統的方法大多是用稀堿提取谷蛋白，但堿法提取對氨基酸有破壞作用，同時存在抽出物中淀粉含量高，抽提液固比大，等電點沉淀要消耗大量酸，脫鹽純化難度大，提取液中的蛋白質濃度低等缺點，且提取時需要消耗大量的堿和水，因而難以應用于工業生產。盡管堿法提取蛋白的抽提率可達到90%以上，但是高堿條件下會導致蛋白質的變性和水解；美拉德反應加劇，產生黑褐色物質；提取物中非蛋白物質含量增加，分離效果降低等許多不良反應。此外，堿法提取還會引起蛋白一些性質變化，破壞氨基酸的結構，降低蛋白的營養價值，甚至形成有毒物質如Lysinoalnine等，損壞腎臟的功能。
[0005]有學者研究了小麥谷蛋白亞基的快速分離方法，他們利用70%的乙醇和50%的異丙醇去除了醇溶蛋白，然后在含50%異丙醇的Tris-HCl緩沖液中抽提谷蛋白，最后利用丙酮將谷蛋白沉淀析出。之后進行了 SDS-PAGE分析，雖然醇溶蛋白的干擾減少了很多，但是清、球蛋白的雜帶還能顯示出，因此該方法并不是一種有效的提取谷蛋白的方法。由此，研究和改善大米谷蛋白分離提取和純化工藝，對于開發利用大米蛋白質，促進我國大米深加工，提尚糧食廣品附加值都具有深遠意義。
【發明內容】
[0006]本發明是要解決現有用稀堿提取谷蛋白的方法導致蛋白質的變性和水解，美拉德反應加劇，產生黑褐色物質的問題，提供一種高純度大米谷蛋白的提取方法。
[0007]本發明高純度大米谷蛋白的提取方法，按以下步驟進行:
[0008]一、將大米研磨成米粉；
[0009]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得到脫脂米粉；
[0010]三、將脫脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；
[0011]四、對步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白3?5次；
[0012]五、合并每次浸提收集的上清液，用濃度為8%?12% (w/v)的TCA溶液將上清液進行蛋白沉淀；
[0013]六、用PBS緩沖液清洗沉淀3?5次，將清洗后的沉淀真空冷凍干燥，即得到大米谷蛋白。
[0014]步驟二中將米粉用正己烷脫脂3次的具體方法為:
[0015]A、將米粉與正己烷按照lg:4?6mL的比例混合，室溫攪拌lh，靜置lh，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0016]B、向步驟A得到的沉淀中加入正己烷，混勻，室溫攪拌Ih，靜置Ih，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；其中步驟B中正己烷的體積與步驟A中正己烷的體積相同；
[0017]C、向步驟B得到的沉淀加入正己烷，混勻，室溫攪拌器攪拌lh，靜置lh，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；其中步驟C中正己烷的體積與步驟B中正己烷的體積相同；
[0018]D、將步驟C得到的沉淀于30°C水浴中晾干，得到脫脂米粉。
[0019]步驟四中對步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白3次的具體方法為:
[0020]①向步驟三收集的沉淀中加入濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸，沉淀與乳酸的比例關系是lg: 10?12mL，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀和上清；
[0021]向步驟①收集的沉淀中加入與步驟①中相同體積的濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀和上清；
[0022]向步驟②收集的沉淀中加入與步驟①中相同體積的濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩4h，離心后收集沉淀和上清；其中所述離心的條件均為:1 ?6°C，10000g，20min。
[0023]本發明的有益效果:
[0024]本發明是利用了谷蛋白的溶解特性而建立的方法。谷蛋白除了可以溶解于稀堿溶液，還可以溶解于稀酸溶液中。因此，本發明主要采用乳酸能打破谷蛋白內的強鍵，不破壞氨基酸，同時還起到溶解谷蛋白的作用，并且采用TCA將乳酸溶解蛋白沉淀。這種方法可以有效避免美拉德反應，減少損失，同時還省去了傳統稀堿提取時需要調PH的步驟。提取出的谷蛋白通過SDS-PAGE分析，無醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白的干擾，沒有蛋白雜帶，是一種簡單、精確、經濟、快速、高純、高效的大米谷蛋白提取方法，本發明方法所提取的谷蛋白純度可高達93.67%?96.16%，能夠充分得到高純度大米谷蛋白。可廣泛應用于工業化大批量提取大米谷蛋白。
【附圖說明】
[0025]圖1為實施例1中3次提取的谷蛋白電泳圖；圖2為實施例1經三步提取大米谷蛋白的提取率；圖3為堿法提取的谷蛋白電泳圖。
【具體實施方式】
[0026]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0027]【具體實施方式】一:本實施方式高純度大米谷蛋白的提取方法，按以下步驟進行:
[0028]一、將大米研磨成米粉；
[0029]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得到脫脂米粉；
[0030]三、將脫脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；
[0031]四、對步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白3?5次；
[0032]五、合并每次浸提收集的上清液，用濃度為8%?12% (w/v)的TCA溶液將上清液進行蛋白沉淀；
[0033]六、用PBS緩沖液清洗沉淀3?5次，將清洗后的沉淀真空冷凍干燥，即得到大米谷蛋白。
[0034]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中將大米研磨成米粉的具體方法為:用粉碎機粉碎新鮮大米，每次15-20S，總共30-40次。其它與【具體實施方式】一相同。
[0035]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟二中將米粉用正己烷脫脂的具體方法為:
[0036]A、將米粉與正己烷按照lg:4?6mL的比例混合，室溫攪拌lh，靜置lh，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0037]B、重復步驟A2?4次，將收集的沉淀于30°C水浴中晾干，得到脫脂米粉。其它與【具體實施方式】一相同。
[0038]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟三中將脫脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的具體方法為:
[0039]A、將脫脂米粉與去離子水按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀；
[0040]B、將步驟A的沉淀加入與步驟A中相同體積的去離子水，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀；
[0041]C、將步驟B的沉淀加入與步驟A中相同體積的去離子水，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩4h，離心后收集沉淀，即為去除了清蛋白的沉淀；
[0042]D、然后將去離子水換為濃度為5% (w/v)的NaCl溶液，每次加的5% (w/v)NaCl溶液體積與步驟A中去離子水體積相同，重復進行步驟A?C，收集沉淀，即為去除了清蛋白和球蛋白的沉淀；
[0043]E、然后將去離子水換為58% (v/v)的正丙醇溶液，每次加的58%的正丙醇溶液體積與步驟A中去離子水體積相同，重復進行步驟A?C，收集沉淀，即為去除了清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的沉淀；其中所述離心的條件均為:1?6°C，10000g，20min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0044]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟四中對步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白的具體方法為:
[0045]①向步驟三收集的沉淀中加入質量濃度為I %的乳酸溶液，沉淀與乳酸的比例關系是lg: 10?12mL，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀和上清；
[0046]重復步驟①2?4次，每次離心后均收集沉淀和上清，其中所述離心的條件均為:I?6°C，10000g，20min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0047]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟五中用TCA溶液將浸提得到的上清液進行蛋白沉淀的具體方法為:
[0048]將步驟四中收集得到的上清液加入濃度為8%?12 % (w/v)的TCA溶液，上清液與TCA溶液的體積比為1:3?5，避光條件下于O?4°C冰浴15?20min ;然后離心棄掉上清液，取沉淀，其中所述離心的條件為:1?6°C，10000g，20min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0049]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟六中用PBS緩沖液清洗沉淀的具體方法為:
[0050]將步驟五中每次收集的沉淀與PBS緩沖液混合，于25°C 130rpm振蕩0.5h，離心后收集沉淀，所述PBS緩沖液為0.05M且pH6.5的磷酸鹽緩沖液，每次使用的量與每次使用I %乳酸的量相等，其中所述離心的條件為:1?6°C，10000g，20min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0051]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟六中真空冷凍凍干的條件為:真空度< 15Pa，冷阱溫度為50°C?60°C，樣品溫度為_30°C?-20°C，凍干時間為20h?24h。其它與【具體實施方式】一相同。
[0052]為驗證本發明的效果，進行以下試驗:
[0053]實施例1:
[0054]本實施例高純度大米谷蛋白的提取方法，按以下步驟進行:
[0055]—、將大米研磨成米粉:用粉碎機粉碎新鮮大米，每次20s，總共30次；
[0056]二、將米粉用正己烷脫脂3次，得到脫脂米粉，具體方法為:
[0057]A、將米粉與正己燒按照lg: