來自谷粒的谷蛋白的脫毒方法
【專利說明】來自谷粒的谷蛋白的脫毒方法
[0001]本發明提出了一種用于來自谷粒的谷蛋白，特別是來自小麥顆粒的谷蛋白脫毒的方法，目的在于從小麥獲得用于制備面包和意大利面食的脫毒面粉，優選適用于乳糜瀉病人的營養補給，但其感官特征和其他方面對于全體人群的營養補給也是合適的。
[0002]摶術說曰月
[0003]谷蛋白是主要由蛋白質組成的食品成分。醇溶谷蛋白占谷物穎果中存在的整個蛋白質部分的約80%并且主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成。
[0004]麥醇溶蛋白是通常歸類為α、β、γ和ω (根據電泳迀移率)的單體分子，單體條件是由于不存在半胱氨酸支架，如在ω -麥醇溶蛋白的情況中，或是由于僅存在分子內二硫鍵(剩余的麥醇溶蛋白)。
[0005]然而，麥谷蛋白是復雜的聚合物，由高(HMW-GS)和低(LMW-GS)分子量的亞基組成，通過分子間二硫化物橋接來穩定。麥醇溶蛋白和麥谷蛋白賦予面粉技術特性；麥醇溶蛋白有助于面團的粘性，而麥谷蛋白負責面團的彈性和韌性。
[0006]特別地，麥谷蛋白聚合物的數量和大小與面團的技術特性成正相關。
[0007]因此，麥谷蛋白聚合物的這些特征取決于單獨的亞基形成或多或少伸長的聚合物的能力。特別地，谷蛋白不存在于谷物穎果中，而是在稍后的時刻形成；作為蛋白質復合物的谷蛋白因面團的水合和捏合而形成，并且構成用于面粉和面包生產的必要成分，因為其賦予面團粘性和彈性。如已知的，當將水加入到面粉中時，麥醇溶蛋白(由單鏈蛋白質組成)開始彼此結合，形成細纖維(小而細的纖維)，其賦予谷蛋白物質可延展性。同時，麥谷蛋白(由不同的蛋白質亞基細成)也被此結合，形成較大尺寸的纖維并形成穩定且非常粘的結構，其賦予面團稠度和一定的耐延伸性。因此，面團的強度和發酵程度取決于面粉中麥醇溶蛋白和麥谷蛋白含量之間的比例。這兩類蛋白質之間的關系取決于谷物的品種并且賦予谷蛋白變形和抵抗膨脹的能力。
[0008]在捏合的機械作用過程中，麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的纖維的細纖維開始彼此纏繞，形成結合淀粉顆粒(圖1)、脂質、礦物質、水和氣泡的三維網，氣泡是酵母酒精發酵非常重要的產物。將酵母加入面團時，酒精和二氧化碳的產生決定了谷蛋白網的膨脹，其變寬并且松弛，以增大所述面團的體積。隨后的烹調決定了蛋白質并且因此決定了谷蛋白的變性/凝固，失去延伸的能力，以不可逆的方式穩定了面團的結構和形狀。
[0009]作為蛋白質復合物的谷蛋白不具有特別的營養特性，因為其所含的必需氨基酸(如賴氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)很少。
[0010]膳食中這種化合物的缺失不涉及任何特定的營養風險。
[0011]另一方面，谷蛋白能夠產生毒性活性，特別是針對腸粘膜；因此，將小麥的谷蛋白以及黑麥、大麥和燕麥的相應蛋白質的永久性不耐受性(其能夠產生炎性細胞因子的炎性級聯)定義為乳糜瀉。
[0012]最初，認為谷蛋白的毒性作用歸因于α麥醇溶蛋白部分；隨后證明了甚至ω麥醇溶蛋白和麥谷蛋白以及相關谷物的醇溶谷蛋白(如大麥(ordeine)、黑麥(黑麥醇溶蛋白(secaline))和燕麥(燕麥堿(avenine)))，也能夠誘發腸粘膜的損傷。
[0013]最近關注的是所述α -麥醇溶蛋白的33個氨基酸的肽(稱為33_mer)的研宄；所述肽能夠抵抗到達完整腸粘膜(腸粘膜對組織谷氨酰胺轉移酶具有高親和性)的消化酶的蛋白水解活性，其在處于風險的個體中發揮出有效的致免疫作用；將來自肽的毒性表位脫氨基后，通過釋放炎性細胞因子的TCD4的淋巴細胞的強烈激活，將會決定這種作用(Shuppan 等，2009)。
[0014]此外，已經顯示出α -麥醇溶蛋白的其他毒性表位能夠誘發源自乳糜泄病人的腸粘膜外植體的腸上皮細胞的凋亡。
[0015]因此，谷蛋白通過激活細胞因子的炎性級聯，并且通過引起直接的毒性作用，發揮對腸粘膜的有害作用。乳糜泄的膳食治療最初是基于在出現不耐受癥狀(如腹痛、腹脹、胃炎、口瘡性口炎、心境障礙、頭痛等)時，從膳食中完全排除所有谷物和含有谷蛋白的食物(尤其是面包和意大利面食，這些是公知的從小麥獲得的產品，以及其他地中海營養補給的食物)；如果存在典型的損傷，這種治療允許病人獲得癥狀的減輕和腸粘膜結構的恢復。然而，這種治療涉及時間持續的困難性，因為這對病人的膳食形成了巨大的限制，并且因此對涉及食物的社會活動形成了巨大的限制；為了解決這些問題，決定為谷蛋白不耐受人群生產無谷蛋白食物，或其中谷蛋白不會激活炎性反應的食物，使得病人通過食用味道和外觀部分類似面包和意大利面食的食物來具有正常的生活方式。
[0016]目前，已知一些部分消除谷蛋白毒性作用的方法。
[0017]尚未顯示出所需效果的試驗階段的方法通過遺傳操作形成了脫毒的小麥，S卩，以這樣的方式修飾為不含控制谷蛋白毒性表位(其可以刺激淋巴T細胞)產生的免疫原性序列。
[0018]這種方法的第一個限制在于鑒別控制谷蛋白的主要結構內含有的免疫活性肽編碼的所有基因序列(目前約四十個，位于兩條不同染色體的六個基因座上)；此外，這種方法不能確保有某種結果，因為存在具有尚未獲知的編碼其他毒性表位的基因序列的高可能性。
[0019]另一個限制是缺乏消費者長時間消費“遺傳修飾”產品的信心，并且因此，這樣的產品難以進入通常目的在于整個人群的市場。
[0020]然而，現有技術的另一種方法提供了使用酶(Rizzello等，2007)，其是面粉制備過程中添加的細菌來源的內肽酶的補充，能夠發酵谷蛋白，并且特別是所述的33-mer片段。這種方法的限制在于是非常昂貴的，因為其涉及使用純化的酶；潛在的用途僅在打算用于乳糜泄病人的食物中，并且因為高的生產成本，因此變得非常昂貴。
[0021]這種方法的第二個限制在于這些酶的使用導致谷蛋白網絡的破壞，并且因此面團失去技術特性，不能用于面包或意大利面食中的轉化過程，并且因此必須借助技巧，使此類物質(樹膠、多糖、預糊化淀粉、瓊脂等)結構化。
[0022]現有技術中已知的另一種方法是在賴氨酸甲酯的存在下使用微生物酶(谷氨酰胺轉移酶)，以通過脫酰胺作用使小麥麥醇溶蛋白中存在毒性表位脫毒(Gianfrani等，2007) ο這種方法與之前的方法相比，具有優勢，保存了谷蛋白網絡并且因此維持了面粉的技術特性。這種方法的限制在于非常昂貴，因為其涉及使用純化的酶；潛在的用途僅在打算用于乳糜泄病人的食物中，并且因為高的生產成本，因此變得非常昂貴。
[0023]另一個重要限制是脫毒取決于毒性蛋白和微生物酶的濃度，以及反應的動力學。出于這些原因，實驗不可能獲得特定的結果。
[0024]解決谷蛋白不耐受問題的替代方案是可以使用連蛋白(zonulin)的抑制劑(Fasano，2008)，連蛋白是一種似乎在改變腸滲透性中起著關鍵作用的蛋白質。
[0025]然而，這種方法忽視了毒性麥醇溶蛋白的傳遞只通過胞內途徑(其可以通過連蛋白的抑制劑阻斷)是不會發生而是通過胞外途徑發生的事實。
[0026]由于這種需要，S卩，生產地中海飲食的典型食物，如源自小麥的面包和意大利面食，其中谷蛋白對于乳糜瀉病人是無毒的，并且對于風味和外觀，可以被整個人群消費，因此形成了本發明。
[0027]本發明的目的是通過提出一種谷蛋白的脫毒方法來克服所述的現有技術缺陷，特別是來自小麥谷粒以及其他谷物谷粒的谷蛋白，通過在經歷水合處理后，將這些谷粒暴露于微波。
[0028]實際上，本發明的目的特別在于解決打算用于乳糜瀉病人的食物、面包和意大利面食生產的技術問題，以及使面粉失去有毒的谷蛋白作用，而沒有失去其形成面團的技術特性。
[0029]更特別地，本發明通過用微波處理成熟谷粒，主要是想要解決具有脫毒谷蛋白的面粉的生產技術問題，同時，所述面粉適用于意大利面食、面包的技術生產以及從小麥生產烘焙產品，而沒有失去谷蛋白網絡的形成。
[0030]最后，本發明通過從谷蛋白的有毒表位脫毒的面粉的生產并且因此食品(如，面包和意大利面食)的生產，目的在于生產源自小麥并且味道和外觀與地中海營養補給中常用的那些相當的食品，其通過及時以及被大部分人群，不僅是乳糜瀉人群的使用，確定了人群中乳糜瀉發病率的降低并且因此還確定了用于乳糜瀉人群的特定食品的生產的經濟影響。
[0031]使用根據權利要求1的脫毒方法已經實現了這一目的。
[0032]附圖簡沐
[0033]現在將以說明性的方式而不是限制，特別參照附圖，來描述本發明，其中:
[0034]圖1顯示了在捏合的機械作用過程中，從麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的結合，結合了淀粉顆粒并且在水的存在下形成的三維網絡；
[0035]圖2顯示了從不同樣品(A、B、C、D、E、F、G、H)提取的麥醇溶蛋白的電泳譜，其中樣品A和B用本發明的脫毒方法處理；
[0036]圖3顯示了通過SE-HPLC分析的脫毒粗粒小麥粉的蛋白質譜(圖3a是可溶性蛋白質，圖3b是不溶性蛋白質);
[0037]圖4顯示了一張圖，所述圖顯示了在乳糜瀉病人的腸黏膜產生的T淋巴細胞系中的干擾素的產生；
[0038]圖5顯示了在微波處理成熟谷粒后形成的谷蛋白網絡(a)和天然形成的谷蛋白網絡(b)；
[0039]圖6顯示了脫毒處理后有毒表位的遮掩模式，如產生了在腸水平下谷氨酰胺轉移酶不可接近和/或不可識別的麥醇溶蛋白連接位點，谷氨酰胺轉移酶在乳糜瀉病癥中誘導免疫應答。
[0040]發曰月描沐
[0041]在本發明中，描述了提供谷蛋白(特別是來自小麥谷粒的)脫毒的方法。
[0042]通過谷蛋白的有毒表位脫毒來制備所述面粉的方法包括以下階段:
[0043]A)用自來水將谷粒(特別是小麥的谷粒)水合約I小時；對于100克成熟谷粒，加入500ml水。這個階段是引發谷蛋白脫毒的化學反應功能所需的。
[0044]B)除去水。通過用篩網排水來進行這一階段，以保留谷粒并除去水。
[0045]C)使用1000瓦的功率，將水合的谷粒微波處理兩分鐘。在這個階段，重要的不是烤箱中的溫度，而是通過谷粒中所含水弓I發脫毒反應的電磁波的功率。
[0046]D)在室溫(20-22 °C )下將用微波處理過的谷物谷粒冷卻。
[0047]上述所有階段都是必須遵循的:谷粒水合一小時使得種子累積在電磁波的存在下引發谷蛋白脫毒反應所需的水量。
[0048]根據之前描述的程序施用的1000瓦的功率持續兩分鐘足以使得水累積的能量促進通過細胞代謝(過氧化物酶、脂肪氧合酶等)產生單態氧基、羥基或氫。小麥種子內部的這些高反應性化合物通過分子間鍵和/或分子內鍵涉及位于穎果以外的其他部分中的谷蛋白(糊粉層中存在的蛋白質顆粒和胚乳中存在的蛋白質顆粒)的聚合反