一種高茶堿普洱熟茶的制備方法與流程

本發(fā)明屬于茶葉加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高茶堿普洱熟茶的制備方法。

背景技術(shù)：

嘌呤堿是茶葉中主要的生物堿，主要包括咖啡堿(1,3,7-三甲基黃嘌呤)、可可堿(3,7-二甲基黃嘌呤)、茶堿(1,3-二甲基黃嘌呤)等。在一般茶葉和茶樹品種中，咖啡堿含量較高，為2％～5％；可可堿含量次之，為0.2％～0.4％；茶堿含量最少，僅為0.008％～0.2％。三種嘌呤堿具有不同的保健功效和生理活性?？Х葔A和可可堿主要具有興奮中樞神經(jīng)、降低膽固醇、強(qiáng)心、利尿等功效。茶堿可松弛支氣管平滑肌，具有良好的平喘作用；對肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺有抑制作用，具有良好的抗炎癥；在急性和慢性哮喘治療中有廣泛應(yīng)用。黑茶是中國特有的微生物主導(dǎo)下的后發(fā)酵茶類。普洱熟茶作為黑茶的一種，是以云南大葉種曬青毛茶為原料，經(jīng)微生物、酶、濕熱、氧化等綜合作用形成具有獨(dú)有品質(zhì)特征的茶葉類型。渥堆發(fā)酵(后發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵)是普洱熟茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序。

在現(xiàn)在茶葉發(fā)展的大趨勢下，廣大人民群眾對茶葉的保健功效越來越重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為茶堿在哮喘病的治療、肺功能改善和呼吸道疾病的防治有良好的保健功效。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

現(xiàn)有技術(shù)，還未通過外源微生物接種曬青毛茶進(jìn)行普洱熟茶渥堆發(fā)酵，加工生產(chǎn)出一種預(yù)防呼吸系統(tǒng)疾病、改善肺功能的高茶堿普洱熟茶。

本發(fā)明通過醫(yī)藥用微生物—聚多曲霉的純培養(yǎng)-擴(kuò)大培養(yǎng)獲得富含聚多曲霉分生孢子的菌種，并將菌種按照一定比例接種至?xí)袂嗝柚羞M(jìn)行普洱熟茶的渥堆發(fā)酵，得到的普洱熟茶茶堿含量在1.9755％至3.0758％之間。在高接種組(3.0％接種量)渥堆發(fā)酵所得普洱熟茶茶堿含量高達(dá)3％以上，對急慢性哮喘病的治療有一定輔助作用，并能改善人體肺功能，對呼吸系統(tǒng)疾病有良好的預(yù)防效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種高茶堿普洱熟茶的制備方法。

本發(fā)明是通過聚多曲霉的-純培養(yǎng)-擴(kuò)大培養(yǎng)-外源接種-自然渥堆等工序獲得高茶堿普洱熟茶。一種高茶堿普洱熟茶的制備方法，所述高茶堿普洱熟茶的制備方法，包括以下步驟：

步驟一，聚多曲霉菌種的純培養(yǎng):稱取600克云南大葉種曬青毛茶，添加水分使茶葉含水量為35％；平均分裝進(jìn)10個錐形瓶；在121℃滅菌15min后，每瓶接種5ml10⁸cfu/ml聚多曲霉菌懸液；置于35℃，85％濕度的恒溫恒濕試驗(yàn)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)14天后，取出，在無菌狀態(tài)下晾至足干；

步驟二，聚多曲霉菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)：稱取12000克云南大葉種曬青毛茶，添加水分使茶葉含水量為35％～38％；在121℃高壓高溫滅菌后，冷卻至室溫，與步驟一所得聚多曲霉菌種按照質(zhì)量比例混合，進(jìn)行菌種擴(kuò)大培養(yǎng)；

步驟三，聚多曲霉菌種的接種渥堆發(fā)酵：稱取1000千克云南大葉種曬青毛茶，依次添加水分，并按照1.5％-3％的比例接種步驟二所得聚多曲霉菌種，混合均勻后進(jìn)行渥堆發(fā)酵；整個渥堆發(fā)酵持續(xù)35天，每隔5-7天進(jìn)行翻堆、勻堆，并適時添加適量水分，以維持微生物的代謝；

步驟四，渥堆發(fā)酵的后續(xù)處理：渥堆發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行自然干燥--倉儲陳化--篩分揀剔；完成普洱熟茶的制備。

進(jìn)一步，所述的純培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)、接種渥堆發(fā)酵中，所應(yīng)用的菌種均為聚多曲霉(aspergillussydowii)。

進(jìn)一步，步驟一中，所述的聚多曲霉菌種純培養(yǎng)所得的聚多曲霉菌種含聚多曲霉數(shù)量在1.0*10¹⁰cfu/g，雜菌菌落不大于5％。

進(jìn)一步，步驟二中，所述的聚多曲霉擴(kuò)大培養(yǎng)中聚多曲霉的接種量為5％，擴(kuò)大培養(yǎng)所得的菌種含聚多曲霉數(shù)量大于1.0*10⁸cfu/g，雜菌菌落不大于5％。

進(jìn)一步，步驟三中，所述的聚多曲霉接種渥堆發(fā)酵中，聚多曲霉菌種的接種量為1.5％-3.0％，渥堆發(fā)酵堆的茶葉初始潮水量為37％～48％，渥堆堆高為70厘米～80厘米，渥堆堆溫在35℃～55℃。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述的高茶堿普洱熟茶的制備方法制備具有防治哮喘病的保健普洱熟茶。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述的高茶堿普洱熟茶的制備方法制備具有改善肺功能的保健普洱熟茶。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：

本發(fā)明利用在普洱茶渥堆中篩選出一株產(chǎn)茶堿的有效菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為聚多曲霉(aspergillussydowii)。該菌株能通過脫甲基作用將咖啡堿轉(zhuǎn)化為茶堿，為高茶堿普洱熟茶的生產(chǎn)提供了優(yōu)質(zhì)菌種。研究證明，聚多曲霉能分泌產(chǎn)生多種具有抗癌活性的吲哚生物堿和雜氧蒽酮，為重要的醫(yī)藥微生物，在醫(yī)藥以及相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)中以得到初步應(yīng)用。本發(fā)明利用聚多曲霉的外源接種進(jìn)行普洱熟茶渥堆發(fā)酵，加工生產(chǎn)高茶堿普洱熟茶，目前還未見有相關(guān)報道。本發(fā)明通過聚多曲霉的純培養(yǎng)-擴(kuò)大培養(yǎng)-外源接種-自然渥堆等工序得到的高茶堿普洱熟茶茶堿含量在2％左右，最高可達(dá)3％以上，在呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療，以及在肺功能改善等方面有一定保健功效。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的高茶堿普洱熟茶的制備方法流程圖。

圖2本發(fā)明實(shí)施例提供的聚多曲霉菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。

圖中：a為pda正面，b為pda背面，c為察氏正面，d為察氏背面。

圖3本發(fā)明實(shí)施例提供的聚多曲霉菌株在電子顯微鏡下的形態(tài)特征圖。

圖中：a為分生孢子(×400)，b為分生孢子頭(×200)，c為雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)：梗基、瓶梗(×200)，d為分生孢子梗(×200)。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的不同接種組在渥堆發(fā)酵中茶堿含量變化圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的應(yīng)用菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的高茶堿普洱熟茶的制備方法，包括以下步驟：

s101:聚多曲霉菌種的純培養(yǎng):稱取600克云南大葉種曬青毛茶，添加適度水分使茶葉含水量為35％，平均分裝進(jìn)10個錐形瓶。在121℃滅菌15min后，每瓶接種5ml10⁸cfu/ml聚多曲霉菌懸液，置于35℃，85％濕度的恒溫恒濕試驗(yàn)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)14天后，取出，在無菌狀態(tài)下晾至足干。

s102:聚多曲霉菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)：稱取12000克云南大葉種曬青毛茶，添加適量水分使茶葉含水量為35％～38％。在高壓高溫滅菌后，冷卻至室溫，與s101所得聚多曲霉菌種按照5％質(zhì)量比例混合均勻，進(jìn)行菌種擴(kuò)大培養(yǎng)。

s103:聚多曲霉菌種的接種渥堆發(fā)酵：稱取1000千克云南大葉種曬青毛茶，依次添加適量水分，并按照1.5％-3％的比例接種s102所得聚多曲霉菌種，混合均勻后進(jìn)行渥堆發(fā)酵。整個渥堆發(fā)酵持續(xù)35天左右，每隔一段時間進(jìn)行翻堆、勻堆，并適時添加適量水分，以維持微生物的代謝。

s104:渥堆發(fā)酵的后續(xù)處理：渥堆發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行自然干燥--倉儲陳化--篩分揀剔等加工工序，以完成普洱熟茶的制備。

本發(fā)明所述的純培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)、接種渥堆發(fā)酵等工序所應(yīng)用的菌種均為聚多曲霉(aspergillussydowii)。

本發(fā)明所述的聚多曲霉菌種純培養(yǎng)所得的聚多曲霉菌種含聚多曲霉數(shù)量在1.0*10¹⁰cfu/g,雜菌菌落不得超過5％。

本發(fā)明所述的聚多曲霉擴(kuò)大培養(yǎng)中聚多曲霉的接種量為5％，擴(kuò)大培養(yǎng)所得的菌種含聚多曲霉數(shù)量在1.0*10⁸cfu/g以上，雜菌菌落不超過5％。

本發(fā)明所述的聚多曲霉接種渥堆發(fā)酵中，聚多曲霉菌種的接種量在1.5％以上，渥堆發(fā)酵堆的茶葉初始潮水量(含水量)為37％～48％，渥堆堆高在70厘米～80厘米，渥堆堆溫在35℃～55℃。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

本發(fā)明實(shí)施例中所采用的材料，其它所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

1.材料

符合gb/t22111-2008普洱茶國家地理標(biāo)志產(chǎn)品要求的云南大葉曬青毛茶為原料。應(yīng)用菌株的its1-5.8s-its2rrna序列(516bp)seqidno1為：

ctgcctccgggcgcccacctcccacccgtgaatacctaacactgttgcttcggcggggaaccccctcgggggcgagccgccggggactactgaacttcatgcctgagagtgatgcagtctgagtctgaatataaaatcagtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaactgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcccggcttgtgtgttgggtcgtcgtcccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcgactagggccggccgggcgccagccgacgtctccaaccatttttcttcaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaaa。

通過在線blast比對檢索結(jié)合圖5系統(tǒng)進(jìn)化樹，應(yīng)用菌株屬于曲霉屬，與典型菌株aspergillussydowiinrrl250系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近，相似性為99.8％。

2.試驗(yàn)儀器

jr-1003型電子天平(上海新諾儀器廠)；hh-s28s型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市環(huán)保儀器廠)；dfz-o1型電熱真空干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；jh-752型紫外可見分光亮度計(上海菁華科技儀器有限公司)；agilent1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；低溫冰箱(日本sanyo公司)；fz-102型微型植物試樣粉碎機(jī)(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；labonce-150th恒溫恒濕試驗(yàn)箱(北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司)；sfg型固態(tài)發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江江工生物工程設(shè)備公司)。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的高茶堿普洱熟茶的制備方法，包括：

步驟(1)應(yīng)用菌株的純培養(yǎng)：

準(zhǔn)確稱取600克云南大葉種曬青毛茶，添加適量水分，使茶葉含水量為35％左右，平均分裝進(jìn)10個錐形瓶。121℃滅菌15min后，每瓶接種5ml10⁸cfu/ml聚多曲霉菌懸液。置于35℃，85％濕度的恒溫恒濕試驗(yàn)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)14天，待菌落成熟后，取出；在自然狀態(tài)下進(jìn)行攤放至完全干燥；待干燥完成后，收集在無菌密閉容器內(nèi)，用于菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)。按照gb4789.15—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計數(shù)中的測定方法》對純培養(yǎng)得到的菌種進(jìn)行微生物數(shù)量測定。結(jié)果如下表(表1)所示，菌種中聚多曲霉數(shù)量為2.38×10⁹～4.30×10¹⁰cfu/g，平均值為1.25×10¹⁰cfu/g，雜菌菌落占聚多曲霉菌落的0.41％～7.69％，平均為3.59％。雜菌根據(jù)《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》、《微生物實(shí)驗(yàn)手冊》初步判斷為青霉菌、酵母菌、黑曲霉等。

表1不同稀釋度下聚多曲霉和雜菌菌落數(shù)

注：括號內(nèi)雜菌菌落數(shù)。

步驟(2)應(yīng)用菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)：

準(zhǔn)確稱取12000克曬青毛茶，添加適量水分，使茶葉含水量在35％-40％之間。121℃滅菌15min，冷卻至室溫后，與步驟(1)得到的菌種，按照5％(w/w)進(jìn)行混合。在已滅菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行菌種的固態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵過程中通入無菌處理后的空氣，不再添加水分。固態(tài)發(fā)酵中聚多曲霉菌以及其他雜菌數(shù)量變化見表2。在發(fā)酵3天時，茶坯開始出現(xiàn)聚多曲霉菌落，且開始大量繁殖。發(fā)酵5天時，聚多曲霉數(shù)量已達(dá)7*10⁷cfu/g。發(fā)酵9天時聚多曲霉數(shù)量已達(dá)到1.2*10⁸cfu/g。長時間的固態(tài)發(fā)酵會增加其他雜菌污染的風(fēng)險。待發(fā)酵9天，聚多曲霉菌數(shù)量(cfu/g)達(dá)到10⁸數(shù)量級后結(jié)束發(fā)酵，進(jìn)行自然干燥。在固態(tài)發(fā)酵干燥茶葉中應(yīng)杜絕黑霉、青霉、白霉紅霉等雜菌的污染。聚多曲霉菌數(shù)量達(dá)到1*10⁸cfu/g，雜菌數(shù)量應(yīng)控制在5％以下。擴(kuò)大培養(yǎng)(固態(tài)發(fā)酵)得到的富含聚多曲霉的菌種自然干燥后可用于高茶堿普洱熟茶的自然渥堆發(fā)酵。

表2固態(tài)發(fā)酵以及干燥過程中聚多曲霉菌增長情況

步驟(3)聚多曲霉菌種的接種渥堆發(fā)酵生產(chǎn)高茶堿普洱熟茶：

將按步驟(2)以云南大葉種曬青毛茶為基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵得到的富含聚多曲霉菌種的菌種按照一定的接種量與云南大葉種曬青毛茶進(jìn)行混合，并添加適量的飲用水，使茶葉的初始潮水量(含水量)維持在37％-48％之間。渥堆所用曬青毛茶為1000kg以上，渥堆堆高度在70厘米至80厘米，上覆蓋蒸汽滅菌處理后的麻布。分別設(shè)置高接種量發(fā)酵組(3％接種量)和低接種量發(fā)酵組(1.5％接種量)，并以無接種的自然渥堆發(fā)酵作為照。在發(fā)酵過程中每五天翻堆一次，并在第一次或第二次翻堆時進(jìn)行解塊。整個發(fā)酵過程為35天左右。渥堆發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行自然干燥--倉儲陳化--篩分揀剔；完成普洱熟茶的制備。茶堿含量采取高效液相法(hplc)。

不同接種發(fā)酵組茶堿含量如圖4所示。在無接種自然渥堆發(fā)酵中，茶堿含量無大幅度增加，一般維持在0.2％以下。在接種渥堆發(fā)酵中，茶堿含量急劇增加；發(fā)酵結(jié)束時，在低接種組和高接種組中，茶堿含量分別達(dá)1.9755±0.162％和3.0758±0.155％，與原料相比分別提高35倍和56倍。2006年全球哮喘防治創(chuàng)議(globalinitiativeforasthma,gina)發(fā)表的指南將茶堿列為哮喘附加治療藥物，推薦給予負(fù)荷量為每天4-6mg/kg·b.w.。以人體正常體重60kg計，每日可服用茶堿0.24-0.32克。按照平均8克飲茶量計，若茶葉中茶堿含量達(dá)3％左右，每日茶堿服用量為0.24克，為茶堿推薦服用量的最小值，可達(dá)到治療或防止急性和慢性哮喘病的目的，并能改善肺功能等。因此，高接種量(3％接種量)適合用于高茶堿普洱熟茶的生產(chǎn)與應(yīng)用。

以高接種組(3％接種量)不同渥堆階段茶樣和成品茶為材料，分別對水浸出物，茶多酚，兒茶素，茶色素類(茶黃素、茶紅素、茶褐素)，游離氨基酸等理化成分進(jìn)行分析。水浸出物測定：采取gb/t8305-2013。茶多酚測定：采取酒石酸鐵比色法測定參照gb/t8313-2008。茶葉總兒茶素含量測定：采取香莢蘭素比色法。茶葉中茶色素含量測定：tfs、trs和tbs的含量測定采取系統(tǒng)分析法。游離氨基酸總量測定：采取茚三酮比色法參照gb/t8314-2013。不同發(fā)酵階段與成品茶的主要理化分析結(jié)果如表3所示。普洱熟茶接種渥堆發(fā)酵過程中與傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵中，主要化學(xué)成分變化趨勢一致，均呈現(xiàn)水浸出物減少、茶多酚減少、茶褐素含量大幅度增高的變化趨勢?！秅b/t22111-2008國家地理標(biāo)志產(chǎn)品普洱茶》要求普洱熟茶(散茶)水浸出物含量≥28％，茶多酚含量≤25％。高接種組渥堆發(fā)酵成品茶水浸出物含量為36.3％，茶多酚含量為13.6％，均符合《地理標(biāo)志產(chǎn)品普洱茶》的基本要求。

表3高接種組渥堆過程中主要理化指標(biāo)的變化

圖2本發(fā)明實(shí)施例提供的聚多曲霉菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。

圖中：a為pda正面，b為pda背面，c為察氏正面，d為察氏背面。

圖3本發(fā)明實(shí)施例提供的聚多曲霉菌株在電子顯微鏡下的形態(tài)特征圖。

圖中：a為分生孢子(×400)，b為分生孢子頭(×200)，c為雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)：?；?、瓶梗(×200)，d為分生孢子梗(×200)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>申請人名稱云南農(nóng)業(yè)大學(xué)周斌星

<120>一種高茶堿普洱熟茶的制備方法

<160>1

<210>1

<211>516

<212>rna

<213>人工序列

<400>rna序列

ctgcctccgggcgcccacctcccacccgtgaatacctaacactgttgcttcggcggggaaccccctcgggggcgagccgccggggactactgaacttcatgcctgagagtgatgcagtctgagtctgaatataaaatcagtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaactgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcccggcttgtgtgttgggtcgtcgtcccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcgactagggccggccgggcgccagccgacgtctccaaccatttttcttcaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaaa。