枸杞多糖在制備降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑中的用途的制作方法

本發明涉及一種枸杞多糖在制備降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑中的用途。

背景技術：

反芻是指牛羊等反芻動物采食經過一段時間后將胃中半消化的食物返回嘴里再次咀嚼的過程。反芻動物是具有反芻現象的動物，通常是一些食草動物，因為粗飼料中的植物纖維比較難消化，所以需要通過反芻來促進粗飼料的消化。多數反芻動物的胃包括4部分，分別為瘤胃、網胃、瓣胃和皺胃。其中，瘤胃是牛羊等反芻動物的第一胃，反芻動物采食的飼料首先進入瘤胃，在瘤胃內飼料經過瘤胃液的親潤、切斷、物理混合以及瘤胃微生物發酵的過程，飼料中的大分子被降解為小分子物質，被動物吸收利用或排除體外。瘤胃中包含大量的微生物，包括細菌、真菌、原蟲和古菌。這些微生物產生的酶能夠有效降解反芻動物采食的粗飼料等難于降解的成分，而瘤胃本身是不會產生此類降解酶。瘤胃內食物在被微生物分解的過程中，會產生一定的氣體。

瘤胃中微生物發酵產生的氣體通過食管向外排出的過程，稱為噯氣。牛每小時約噯氣17-20次。噯氣的次數決定于氣體產生的速度。正常情況下瘤胃中所產生的氣體和通過噯氣等所排出的氣體之間維持相對平衡。如產生的氣體過多，不能及時排出，可形成瘤胃急性脹氣。瘤胃脹氣是反芻動物采食了大量易發酵的牧草、飼料等，在瘤胃微生物的作用下過度發酵，產生大量的氣體，以致于瘤胃和網胃迅速擴張而引起的疾病。瘤胃噯氣排出的氣體以甲烷和二氧化碳為主，二者均為溫室氣體，可導致全球氣候變暖等一系列問題。同時，反芻動物排出甲烷氣體也是一種能量浪費。因此，有效降低反芻動物氣體排放和降低瘤胃脹氣發病對動物健康和高效生產具有重要作用。

目前，對于反芻動物的瘤胃調控的添加劑研究較多的是植物或植物提取物等。例如，單寧酸、皂苷、類黃酮和其他的植物次級代謝物已經被證明能提高瘤胃發酵。單寧和皂素可以有益調節瘤胃發酵，減少瘤胃中蛋白質的降解，防止瘤胃脹氣，抑制產甲烷菌并提高共軛亞油酸濃度。功能性多糖添加在動物飼糧中可提高動物的免疫力和改善單胃動物的生產性能，且不良反應小，是一種較為理想的飼料添加劑。功能性多糖普遍存在于自然界中，它在植物體內起著支持組織和貯存養料的作用。近年來隨著許多功能性多糖生物活性的發現，其在動物生產中的應用研究日益受到人們的重視。

枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharide)是從枸杞中提取得到的一種水溶性多糖，由各種單糖通過糖苷鍵相連接，是枸杞的有效成分之一，枸杞的藥理和保健作用與枸杞多糖的含量有很大關系。枸杞多糖是植物多糖中少有的含蛋白質多糖，其可提高機體免疫力，增強造血功能，保肝降壓，增強細胞活性，且無任何毒副作用，在食品和醫藥領域具有廣闊的應用前景。但目前還未見關于枸杞多糖在調節反芻動物瘤胃發酵中降低產氣量應用的相關報道。

技術實現要素：

針對現有技術，本發明提供一種枸杞多糖在制備反芻動物瘤胃飼料添加劑中的用途，經研究發現，反芻動物經食用枸杞多糖后，能夠顯著降低瘤胃內的總產氣量。

本發明采用如下技術方案：

本發明的第一個發明目的是提供一種枸杞多糖在制備降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑中的應用。

進一步的，所述反芻動物為牛或羊。經過研究，本發明首次發現，在反芻動物(特別是牛或羊)的飼料中加入一定量的枸杞多糖，對反芻動物的瘤胃微生物發酵具有良好的調節作用，可調控瘤胃微生物區系、種屬結構及其發酵模式，從而能夠抑制原蟲和甲烷菌，降低反芻動物瘤胃產氣量，同時還可以提高反芻動物飼料中干物質和粗蛋白的降解率及飼料中能量的利用效率。

更進一步的，所述反芻動物為奶畜(奶牛或奶山羊)。從綜合效果來講，最佳的，所述奶畜為泌乳高峰期的奶牛或奶山羊。泌乳高峰期是奶畜一生中最重要的時期，密切關系到奶畜的泌乳與繁殖性能，奶畜在此階段的激素水平、瘤胃功能、能量的代謝以及免疫力都發生了一系列巨大的變化。奶畜在泌乳高峰期時為保證較高的奶產量和乳品質，需要大量且快速的提高飼料采食量，且采食的飼料中富含易于發酵的碳水化合物等成分，極易造成奶畜的瘤胃脹氣。反芻動物的能量代謝不同于其他動物，主要靠瘤胃微生物產生的乙酸、丙酸等揮發性脂肪酸供能，丙酸可通過糖異生轉化為葡萄糖，葡萄糖是反芻動物最重要的能量供給形式。因此，瘤胃健康及高效發酵對奶畜健康及高效生產具有重要作用。經過試驗發現，添加枸杞多糖可顯著降低泌乳高峰期的奶牛或奶山羊中瘤胃中氣體生成及排放，降低噯氣發病率，并在不影響瘤胃功能的情況下可提高動物能量平衡。

上述應用中，所述枸杞多糖是通過下述方法制備得到的：

(1)將枸杞原料干燥，粉碎，經超臨界co2萃取，萃取壓力為25-30mpa，co2流量為28-32l/h，萃取時間為2-3h，夾帶劑為90-95％(體積分數)乙醇，夾帶劑用量為枸杞原料(干燥后)重量的5-8％，經萃取后的物料即為脫脂后的枸杞顆粒；

(2)向脫脂后的枸杞顆粒加入8-12倍重量的水，超聲提取，超聲提取功率為300-400w，超聲時間為20-40min，得超聲提取液；

(3)向超聲提取液中加入體積分數為70-80％的乙醇溶液進行醇析，將醇析后的析出液濃縮、干燥，即得枸杞多糖。

優選的，步驟(1)中，超臨界co2萃取，萃取壓力為25mpa，co2流量為30l/h，萃取時間為2.5h，夾帶劑的用量為枸杞原料重量的6％。本發明在提取枸杞多糖時，采用超臨界co2萃取技術對枸杞進行脫脂，可以脫除枸杞中的脂類、膠類、色素等脂溶性物質，提高了枸杞多糖的溶解性和分散性，降低了其溶出阻力，多糖與水的接觸面積及親和力大幅度增加，從而提高了枸杞多糖的提取率。

本發明還對超臨界co2萃取的萃取條件進行了優化，采用本發明的萃取條件，可以提高對枸杞中油脂的脫除效率，進而提高枸杞多糖的提取率，改善枸杞多糖的風味和品質。

優選的，步驟(2)中，超聲提取的功率為350w，超聲時間為25min。本發明對脫脂后的枸杞顆粒采用超聲提取，并對超聲提取工藝條件進行了優化，其工藝流程簡單，工序少，提取時間短，節約資源，生產成本較低，而且多枸杞多糖的提取率高。

優選的，步驟(3)中，乙醇溶液的加入量為超聲提取液的2-4倍體積，醇析時間為2-4h，醇析溫度為2-4℃。

與其他提取方法制備得到的枸杞粗多糖，本發明的提取方法得到的枸杞多糖提取物，在作為降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑時，效果顯著突出。而對于產生這種效果的原因是，將超臨界co2萃取方法和超聲提取方法相結合，加大了傳質效率，有助于溶質的擴散，使得枸杞多糖有效成分得到最大程度的釋放而其分子結構不被破壞。故該提取方法得到的枸杞多糖提取物的多糖有效含量較高，在作為降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑時，效果顯著突出。

枸杞多糖的添加濃度非常重要，因為高濃度的枸杞多糖可能會抑制瘤胃的正常發酵。優選的，在反芻動物的飼料中添加0.1-0.5％(w/w)的枸杞多糖(即枸杞多糖的質量為飼料質量的0.1-0.5％)，能降低瘤胃中甲烷氣體的產量，防止瘤胃脹氣。

基于枸杞多糖能夠降低反芻動物瘤胃產氣量的特點，經過研究發現，本發明的第二個目的是提供一種枸杞多糖在制備預防或輔助治療反芻動物瘤胃脹氣藥物中的應用。

上述技術方案中具有如下有益效果：

(1)本發明首次發現枸杞多糖能夠在制備降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑中進行應用，在反芻動物的飼料中添加0.1-0.5％的枸杞多糖，能顯著降低瘤胃中甲烷氣體的產量，防止瘤胃脹氣。同時，枸杞多糖還可提高反芻動物飼料中干物質和粗蛋白的降解率，有效提高飼料的利用率。

(2)本發明研究了枸杞多糖的提取方法對反芻動物瘤胃產氣量的影響。研究發現，采用本發明超臨界co2萃取方法和超聲提取方法相結合的方法，在作為降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑時，效果顯著突出。

(3)經本發明的研究發現，在反芻動物中尤其是對泌乳高峰期的奶牛或奶山羊的綜合效果最佳，添加枸杞多糖可顯著降低氣體的生成，并在不影響瘤胃功能的情況下可提高動物能量平衡。故從經濟成本和飼喂效果來看，本發明的枸杞多糖更加適用于泌乳高峰期的奶牛或奶山羊。

附圖說明

圖1是功能性多糖對48h產氣量影響的柱狀圖。

圖2是功能性多糖對24h干物質降解率影響的柱狀圖。

圖3是功能性多糖對48h干物質降解率影響的柱狀圖。

圖4是功能性多糖對24h粗蛋白降解率影響的柱狀圖。

圖5是功能性多糖對48h粗蛋白降解率影響的柱狀圖。

圖6是枸杞多糖對不同生長階段的奶牛36h產氣量影響的柱狀圖。

具體實施方式

應該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本發明的示例性實施方式。

實施例1枸杞多糖的制備

(1)將枸杞原料干燥，粉碎，過70目篩，經超臨界co2萃取，萃取壓力為28mpa，co2流量為30l/h，萃取時間為2.5h，夾帶劑為90％(體積分數)乙醇，夾帶劑用量為枸杞原料(干燥后)重量的8％，經萃取后的物料即為脫脂后的枸杞顆粒；

(2)向脫脂后的枸杞顆粒加入10倍重量的水，超聲提取，超聲提取功率為320w，超聲時間為30min，得超聲提取液；

(3)向超聲提取液中加入體積分數為70％的乙醇溶液進行醇析，乙醇溶液的加入量為超聲提取液的3倍體積，醇析時間為3h，醇析溫度為3℃，將醇析后的析出液濃縮、干燥，即得枸杞多糖，經檢測，枸杞多糖提取物的得率為5.56％，采用苯酚-硫酸比色法檢測枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量為91.72％。

多糖提取物得率(％)＝枸杞粗多糖質量(g)÷干燥后的枸杞原料質量(g)×100％。

實施例2枸杞多糖的制備

(1)將枸杞原料干燥，粉碎，過80目篩，經超臨界co2萃取，萃取壓力為30mpa，co2流量為28l/h，萃取時間為3h，夾帶劑為95％(體積分數)乙醇，夾帶劑用量為枸杞原料(干燥后)重量的5％，經萃取后的物料即為脫脂后的枸杞顆粒；

(2)向脫脂后的枸杞顆粒加入12倍重量的水，超聲提取，超聲提取功率為400w，超聲時間為20min，得超聲提取液；

(3)向超聲提取液中加入體積分數為75％的乙醇溶液進行醇析，乙醇溶液的加入量為超聲提取液的2倍體積，醇析時間為2.5h，醇析溫度為4℃，將醇析后的析出液濃縮、干燥，即得枸杞多糖，經檢測，枸杞多糖提取物的得率為5.60％，采用苯酚-硫酸比色法檢測枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量為93.11％。

實施例3枸杞多糖的制備

(1)將枸杞原料干燥，粉碎，過80目篩，經超臨界co2萃取，萃取壓力為25mpa，co2流量為32l/h，萃取時間為2h，夾帶劑為90％(體積分數)乙醇，夾帶劑用量為枸杞原料(干燥后)重量的6％，經萃取后的物料即為脫脂后的枸杞顆粒；

(2)向脫脂后的枸杞顆粒加入8倍重量的水，超聲提取，超聲提取功率為350w，超聲時間為25min，得超聲提取液；

(3)向超聲提取液中加入體積分數為80％的乙醇溶液進行醇析，乙醇溶液的加入量為超聲提取液的3倍體積，醇析時間為2h，醇析溫度為2℃，將醇析后的析出液濃縮、干燥，即得枸杞多糖，經檢測，枸杞多糖提取物的得率為5.39％，采用苯酚-硫酸比色法檢測枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量為92.18％。

對比例1枸杞多糖的制備

稱取24g干枸杞，粉碎后放入800ml燒杯中，加入500ml蒸餾水，熱水提取1.5h。過濾，加入1/4體積的三氯甲烷-正丁醇(體積比為5：1)，劇烈震蕩20min，3000rpm離心25min，棄去中間變性蛋白和氯仿層，留用上清液。上清液于85℃水浴攪拌濃縮至50ml。在攪拌狀態下，將濃縮液加入3倍體積90％乙醇中，室溫靜置1h，3000rpm離心10min，固形物用90％乙醇洗滌，3000rpm離心10min，然后再用無水乙醇洗滌，3000rpm離心10min，真空干燥，得到1.44g枸杞粗多糖提取物，枸杞多糖提取物的得率為6％，采用苯酚-硫酸比色法檢測枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量為50.98％。

實驗例1枸杞多糖對反芻動物瘤胃產氣量的影響

(1)試驗動物及飼養管理

選擇8只健康泌乳期奶牛為試驗動物。基礎日糧組成(以風干樣計)為：日糧精粗質量比為40：60，粗飼料中青貯玉米和苜蓿按照質量比1：1提供，精料補充料包括58％玉米、18.3％小麥麩、23％大豆粕、小蘇打0.7％(w/w)。每天早上9：00和下午5：30定量飼喂，充足自由飲水。

(2)試驗樣品

向精粗質量比為40：60的日糧中添加0.1％(w/w)的實施例1制備的枸杞多糖1、對比例1制備的枸杞多糖2、葡萄糖、黃芪多糖、低聚木糖、低聚果糖和殼聚糖，以不添加多糖作為空白對照。

(3)試驗方法

采用反芻動物體外發酵技術研究添加不同種類的多糖對瘤胃發酵產氣量的影響。

晨飼前，應用口腔套管從8頭奶牛瘤胃的上中下3個不同位點采集瘤胃液，經4層紗布過濾后按照1：2的體積比例接種到含有底物(基礎日糧)和磷酸緩沖液的發酵瓶中，并向發酵瓶中持續注入co2調節ph至6.8。

分別向發酵瓶中添加枸杞多糖提取物(實施例1制備)、枸杞多糖提取物(對比例1制備)、葡萄糖、黃芪多糖、低聚木糖、低聚果糖和殼聚糖后加塞密封。通過氣路導管將發酵瓶與體外發酵產氣自動記錄裝置連通，并由裝置實時自動記錄發酵產氣量，發酵瓶在39℃下持續培養48h，記錄發酵產量。

(2)試驗結果

枸杞多糖對反芻動物瘤胃產氣量的影響結果見圖1，由圖1可得，黃芪多糖能夠顯著降低反芻動物瘤胃產氣量，與其他功能性多糖具有差異顯著性；實施例1的方法得到的枸杞多糖提取物與對比例1相比，降低產氣量顯著突出，說明不同方法制備得到的枸杞多糖效果上具有一定的差異；也說明了本發明在專門制備降低反芻動物瘤胃產氣量的飼料添加劑時，應選擇本發明實施例1中的提取方法更為合適，可有效緩解泌乳期奶牛的瘤胃脹氣。

另外，本發明還測了ph、乙酸、丙酸、乙丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和總揮發性脂肪酸(tvfa)等參數，檢測結果具體如下表1：

表1功能性多糖對瘤胃ph和vfa的影響

由表1可知，不同種類的功能性多糖對瘤胃中的各氣體濃度的影響各不相同，與其他種類的功能性多糖相比，采用本發明的枸杞多糖能有效調控反芻動物瘤胃的功能，提高微生物活性和揮發酸產量，這有利于泌乳期奶牛體重的增加，在不影響瘤胃功能的情況下可提高動物能量平衡。

綜上，從圖1和表1來看，與其他功能性多糖相比，枸杞多糖在降低反芻動物瘤胃產氣量的效果上顯著突出。

實驗例2研究枸杞多糖對飼料干物質和粗蛋白降解率的影響

枸杞多糖對飼料干物質和粗蛋白降解率的調控

(1)試驗動物及飼養管理

選擇8只安裝有永久性瘤胃瘺管的健康西農薩能奶山羊為試驗動物。基礎日糧組成(以風干樣計)為：日糧精粗質量比為40：60，粗飼料中青貯玉米和苜蓿按照質量比1：1提供，精料補充料包括58％玉米、18.3％小麥麩、23％大豆粕、小蘇打0.7％(w/w)。每天早上9：00和下午5：30定量飼喂，充足自由飲水。

(2)試驗樣品

向精粗質量比為40：60的日糧中添加0.1％的實施例1制備的枸杞多糖、葡萄糖、黃芪多糖、靈芝多糖、低聚木糖、低聚果糖和殼聚糖，以不添加多糖作為空白對照。

(3)試驗方法

選擇孔徑為300目的尼龍布，制成8×12cm的尼龍袋，分別稱取試驗樣品7.5g(精粗比為40：60的tmr日糧)放入尼龍袋中，用橡皮筋扎好，然后將尼龍袋固定在一根長20cm的半軟尼龍管的一端，在晨飼前1h放入瘤胃內，培養時間分別為24h和48h，連續取樣、放樣，在規定時間內取出尼龍袋，并用大量的水清洗，直至水澄清為止。然后將洗干凈的尼龍袋65℃烘干至恒重。將尼龍袋中的降解樣倒出后，洗凈，同樣65℃烘干至恒重，測定降解前后飼料原料的干物質和粗蛋白的降解率，測定方法參考《飼料質量與安全檢測技術》。

(4)試驗結果

不同種類的功能性多糖對飼料原料干物質的降解率結果分別見圖2和圖3；不同種類的功能性多糖對飼料原料的粗蛋白降解率結果見圖4和圖5。

由圖2～5可得，不同種類的功能性多糖對反芻動物飼料原料中的干物質和粗蛋白的降解效果差別較大。與其他的功能性多糖相比，在飼料中添加本發明制備的黃芪多糖，在48h內飼料的粗蛋白的降解效果明顯優于其他種類的功能性多糖。

實驗例3枸杞多糖對不同生長階段奶牛瘤胃產氣量的影響

(1)試驗動物及飼養管理

選擇不同生長階段(每階段3只)健康奶牛為試驗動物，不同生長時期是指：小育成牛階段(6-12個月齡)、大育成牛階段(12月齡-配孕)、妊娠期、圍產期(產前3周和產后3周)、泌乳高峰期(自分娩后至200天)、干乳期(自停奶日期至分娩日期之前)。

基礎日糧組成(以風干樣計)為：日糧精粗質量比為40：60，粗飼料中青貯玉米和苜蓿按照質量比1：1提供，精料補充料包括58％玉米、18.3％小麥麩、23％大豆粕、小蘇打0.7％(w/w)。每天早上9：00和下午5：30定量飼喂，充足自由飲水。

(2)試驗樣品

向精粗質量比為40：60的日糧中添加0.1％的實施例1制備的枸杞多糖，以不添加多糖作為空白對照。

(3)試驗方法

采用反芻動物體外發酵技術研究添加枸杞多糖對不同生長階段的奶牛瘤胃發酵產氣量的影響。每個生長時期的試驗重復三次。

晨飼前，從試驗奶牛瘤胃的上中下3個不同位點采集瘤胃液，經4層紗布過濾后按照1：2的體積比例接種到含有底物(基礎日糧)和磷酸緩沖液的發酵瓶中，每個發酵瓶中含有5g底物，并向發酵瓶中持續注入co2調節ph至6.8。

分別向發酵瓶中添加枸杞多糖(實施例1制備)加塞密封。通過氣路導管將發酵瓶與體外發酵產氣自動記錄裝置連通，并由裝置實時自動記錄發酵產氣量，發酵瓶在39℃下持續培養36h，記錄發酵產量。

(4)試驗結果

枸杞多糖對反芻動物瘤胃產氣量的影響結果見圖6，由圖6可得，黃芪多糖對各個生長階段的奶牛瘤胃的產氣量的影響差別較大，經過試驗驗證，黃芪多糖能夠顯著降低泌乳高峰期奶牛瘤胃產氣量，與其他生長階段的奶牛瘤胃的產氣量相比具有差異顯著性。

實驗例4應用

本發明經過大量的應用實踐得到：黃芪多糖能夠顯著降低泌乳高峰期奶牛瘤胃產氣量，與其他生長階段的奶牛瘤胃的產氣量相比具有差異顯著性，具有統計學意義。以下是其中的一個應用案例。

瘤胃膨脹治療的關鍵就在于排出已產生的氣體和制止瘤胃內容物持續大量的發酵產氣。

2015年7月某養殖小區一頭泌乳奶牛，上午采食大量的精料，下午出現腹部鼓脹。經檢測發現患牛營養良好，t38.5℃，p80次/分，r38次/分，噯氣及反芻較弱，瘤胃蠕動音減弱。選用實施例1中的枸杞多糖5g/kg(每千克常規藥物加入5g枸杞多糖)和常規的藥物配方(松節油50-60ml、魚石脂20-30g、酒精100-150ml)，服用量為服用1次，患牛投服后，6min后開始噯氣，15min后胃蠕動音增強，腹圍逐漸縮小，經35min腹脹基本消失，其癥狀也逐漸好轉，2小時后出現反芻，并不再復發。

常規方法的藥物配方加入枸杞多糖后對泌乳奶牛瘤胃膨脹的治療效果優異，能夠縮短治愈時間。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。