本發明涉及功能微生物應用
技術領域：
，具體提供了一種阿膠益生菌口服液及其制備方法。
背景技術：
：益生菌是有益于宿主健康的一類微生物，1965年在Science上首次被提出。腸道菌系平衡是對人體營養和健康至關重要的因素，益生菌對人體腸道菌系有很好的調節作用，這使得益生菌的研究成為食品研究的一大熱點。近年來，隨著對益生菌的深入研究，益生微生物的種類也越來越多，其主要分為三大類:第一類為乳酸菌，主要包括嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌和乳雙歧桿菌等；第二類為芽胞桿菌；第三類為酵母菌。乳酸菌在自然界中的種類很多，分布極廣。目前自然界已發現的這類菌在細菌分類學上劃分至少有18個屬，共有200多種。除極少數外，其中絕大部分都是人體內必不可少的，且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體的腸道中。乳酸菌包括乳酸桿菌屬、肉食桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、明串珠球菌屬、片球菌屬、氣球菌屬、奇異菌屬、漫游球菌屬、利斯特氏菌屬、芽孢乳桿菌屬、芽孢桿菌屬中的少數種、環絲菌屬、丹毒絲菌屬、孿生菌屬和糖球菌屬等。乳酸菌主要歸屬于乳鏈球菌及乳酸桿菌兩大家族，乳酸桿菌與人體保健有著密切的關系，有44個種，連同亞種共51個種。乳桿菌、乳球菌及雙歧桿菌屬為最常用的菌株。乳酸菌能提高食品的營養價值，改善食品風味，提高食品的保藏性和附加值。近年來乳酸菌的特殊生理活性和營養功能，正日益引起人們的重視。大量研究表明，乳酸菌能夠調節機體胃腸道正常菌群、保持微生態平衡，提高食物消化率和生物價，降低血清膽固醇，控制機體內毒素，抑制腸道內腐敗菌生長繁殖和腐敗產物的產生，制造營養物質，刺激組織發育，從而對機體的營養狀態、生理功能、細胞感染、藥物效應、毒性反應、免疫反應、腫瘤發生、衰老過程和突然的應急反應等產生作用。由此可見，乳酸菌的生理功能與機體的生命活動息息相關。乳酸菌對人體有特殊的生理作用，是機體內必不可少的正常生理菌群，目前它已成為各國學者研究的熱門課題，在保健食品的研究應用中必將占據重要地位。拓展菌種來源，選育既有優良發酵特性，又有特殊保健功能的活菌數高、優良、安全的乳酸菌菌種仍是研究重點。技術實現要素：本發明的目的是提供一種新型益生菌口服液及其制備方法。所述益生菌口服液是以阿膠作為發酵培養基養分之一，選用干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）和發酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）三者混合發酵制備得到的。所述口服液能有效提高腸道益生菌含量，提高機體免疫力，應用前景廣闊。本發明一方面提供了一種阿膠益生菌口服液，是以含阿膠的原料為培養基，將干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發酵乳桿菌混合發酵制備得到的。所述干酪乳桿菌優選干酪乳桿菌KDB-LC（LactobacilluscaseiKDB-LC），已經于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016431。所述嗜酸乳桿菌優選嗜酸乳桿菌KDB-03（LactobacillusacidophilusKDB-03），已經于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016429。所述發酵乳桿菌優選發酵乳桿菌KDB-8（LactobacillusfermentumKDB-8），已經于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016430。一種益生菌口服液的制備方法，具體為：按發酵量的3-5%將嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和發酵乳桿菌的混合種子液接種于發酵罐中的液體發酵培養基中，攪拌15-20min，充分混勻后關閉攪拌；控制發酵溫度為35～40℃，發酵時間為15～20小時，冷水迅速降溫至10℃以下，進行無菌灌裝、包裝，即得到益生菌口服液。所述的混合種子液中嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和發酵乳桿菌的活菌數比例為1：1：1～3；進一步優選的，所述的混合種子液中嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和發酵乳桿菌的活菌數比例為1：1：1。所述的液體發酵培養基中各組分及其質量體積比分別為紅糖6.5-8%、阿膠0.5-2%、蛋白胨0.3-0.5%、酵母浸粉0.3-0.5%、乳清粉0.07-0.1%、土豆泥0.06-0.1%、低聚果糖0.05-0.08%、K2HPO40.03-0.05%、KH2PO40.02-004%、MgSO40.03-0.05%。進一步優選的，所述的液體發酵培養基中各組分及其質量體積比分別為紅糖7%、阿膠1.5%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%。有益效果本發明提供的阿膠益生菌口服液中嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和發酵乳桿菌的總活菌數超過50億/mL，能明顯提高人體腸道內乳酸菌和雙歧桿菌的數量，有效改善胃腸道環境。所述口服液中含有的阿膠成分不僅改善了口服液的風味，更具有益氣補血的功效，能顯著提升機體免疫力，增強機體抗病能力，有助于維護人體的健康。在阿膠益生菌口服液生產過程中，阿膠在發酵培養基中的添加量對于口服液中乳酸菌的總活菌數有重要影響。當阿膠添加量在0.5-2.0%時，制備得到的阿膠益生菌口服液中乳酸菌總活菌量隨著阿膠添加量的增加而增加，乳酸菌增長率為22%-122%；而當阿膠的添加量超過2%時，乳酸菌總活菌量隨著阿膠添加量的增加而迅速下降。說明阿膠中的某些成分對于上述三種乳酸菌的生長繁殖具有明顯的促進作用，但當這些成分超過一定劑量時又會反過來抑制其生長，取得了意料不到的技術效果。具體實施例本發明實施例中涉及的嗜酸乳桿菌KDB-03（LactobacillusacidophilusKDB-03）、發酵乳桿菌KDB-8（LactobacillusfermentumKDB-8）和干酪乳桿菌KDB-LC（LactobacilluscaseiKDB-LC）均篩選自在沈陽蘇家屯農村收集的自然發酵的酸菜汁。其中：嗜酸乳桿菌KDB-03（LactobacillusacidophilusKDB-03），已經于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016429。所述菌株對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和幽門螺旋桿菌均有明顯的抑制作用，尤其對大腸桿菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑達24mm。所述嗜酸乳桿菌能在胃酸中進行有效繁殖，并對膽汁鹽具有強耐受性。所述嗜酸乳桿菌KDB-03能強力去除膽固醇，去除率高達91.4%；該菌株還具有很強的抗氧化能力，其發酵上清液對DPPH·和羥基自由基的清除率分別高達92.6%和94.1%。發酵乳桿菌KDB-8（LactobacillusfermentumKDB-8），已經于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016430。所述菌株對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，尤其對幽門螺旋桿菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑高達23mm。所述發酵乳桿菌對胃酸和膽汁鹽的耐受性強，且能在胃酸環境下實現有效增殖。所述發酵乳桿菌KDB-8對膽固醇的去除率達到93.2%；在1.2mmol/LH2O2中仍能保持98.5％的存活率；其發酵上清液和無細胞提取物對羥基自由基的清除率分別高達95.1%和90.4%。干酪乳桿菌KDB-LC（LactobacilluscaseiKDB-LC）已經于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016431。所述菌株對大腸桿菌、沙門氏菌和幽門螺旋桿菌均有明顯的抑制作用，尤其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑高達24mm。所述干酪乳桿菌對胃酸和膽汁鹽的耐受性強，且能在胃酸環境下實現有效增殖。所述干酪乳桿菌KDB-LC還具有很強的抗氧化能力，在1.0mmol/LH2O2中仍能保持97.44％的存活率；其發酵上清液和無細胞提取物對羥基自由基的清除率分別高達92.3%和87.1%。植物乳桿菌DY-1（LactobacillusplantarumDY-1），篩選自健康成年人糞便，已于2016年3月22日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO:M2016137。嗜酸乳桿菌1.1878，嗜酸乳桿菌1.3342，副干酪乳桿菌1.2884，干酪乳桿菌1.580，發酵乳桿菌1.2133，發酵乳桿菌1.3261，植物乳桿菌1.3252，均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。本發明實施例中所用的原料可選購自市場上任意一種，例如阿膠可選購自東阿縣貴妃阿膠制品有限公司生產的阿膠。實施例1阿膠對于乳酸菌生長的影響1、乳酸菌的選擇嗜酸乳桿菌1.1878，嗜酸乳桿菌1.3342，嗜酸乳桿菌KDB-03；副干酪乳桿菌1.2884，干酪乳桿菌1.580，干酪乳桿菌KDB-LC；發酵乳桿菌1.2133，發酵乳桿菌1.3261，發酵乳桿菌KDB-8；植物乳桿菌1.3252，植物乳桿菌DY-1。2、乳酸菌發酵實驗將上述11株乳酸菌分別接種于100mLMRS液體培養基和100mL含2%（質量體積比）阿膠的MRS液體培養基中，37℃靜置培養48h后，分別檢測發酵液中乳酸菌的活菌數，具體結果見表1。表1乳酸菌在不同培養基中發酵后活菌數比較編號菌株名稱MRS液體培養基發酵后活菌數cfu/mL含2%阿膠的MRS液體培養基發酵后活菌數cfu/mL1嗜酸乳桿菌1.18782.0×1082.3×1082嗜酸乳桿菌1.33425.2×1085.0×1083嗜酸乳桿菌KDB-033.5×1082.6×1094副干酪乳桿菌1.28842.6×109.1.2×1085干酪乳桿菌1.5806.7×1089.1×1076干酪乳桿菌KDB-LC9.2×1084.2×1097發酵乳桿菌1.21338.8×1089.3×1088發酵乳桿菌1.32614.6×1081.5×1089發酵乳桿菌KDB-81.2×1095.0×10910植物乳桿菌1.32524.4×1088.4×10711植物乳桿菌DY-16.1×1082.7×108從表1的結果可以看出，阿膠在MRS液體培養基中的添加對上述11種乳酸菌的生長產生了截然不同的影響。其中，阿膠對嗜酸乳桿菌1.1878，嗜酸乳桿菌1.3342和發酵乳桿菌1.2133三株乳酸菌的生長影響不顯著，所述菌株在兩種培養基中發酵后的活菌數相當；阿膠對副干酪乳桿菌1.2884，干酪乳桿菌1.580，發酵乳桿菌1.3261，植物乳桿菌1.3252和植物乳桿菌DY-1五株乳酸菌的生長具有明顯的抑制作用，所述菌株在含阿膠的MRS液體培養基中發酵后的活菌數明顯減少；而阿膠對嗜酸乳桿菌KDB-03，干酪乳桿菌KDB-LC和發酵乳桿菌KDB-8三株菌的生長具有明顯的促進作用，所述菌株在含阿膠的MRS液體培養基中發酵后的活菌數明顯增加，取得了意料不到的效果。實施例2益生菌口服液的制備方法配制液體發酵培養基：在發酵罐中加入適量水，分別將紅糖、蛋白胨、酵母浸粉、乳清粉、土豆泥、低聚果糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4加入到罐中，攪拌溶解后定容。利用高溫蒸汽控制發酵罐內壓力0.09～0.10MPa，使溫度控制在115℃～121℃，殺菌25～45min，結束后冷卻降溫至35～40℃，其中各成分的質量體積比最終分別為：紅糖6.5-8%、蛋白胨0.3-0.5%、酵母浸粉0.3-0.5%、乳清粉0.07-0.1%、土豆泥0.06-0.1%%、低聚果糖0.05-0.08%、K2HPO40.03-0.05%、KH2PO40.02-004%、MgSO40.03-0.05%，培養基的初始pH值為5.5-6.0。按發酵量的3-5%接種嗜酸乳桿菌KDB-03、干酪乳桿菌KDB-LC和發酵乳桿菌KDB-8的混合種子液（三種乳酸菌的活菌數比例為1：1：1-3）于發酵罐中，攪拌15-20min，充分混勻后關閉攪拌；控制發酵溫度為35～40℃，發酵時間為15～20小時，冷水迅速降溫至10℃以下，進行無菌灌裝、包裝，即得到益生菌口服液，其中乳酸菌的總活菌數約為30-50億/mL。進一步優選的，申請人配制的液體發酵培養基中各組分質量體積比分別為：紅糖7%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%，培養基的初始pH值為6.0，嗜酸乳桿菌KDB-03、干酪乳桿菌KDB-LC和發酵乳桿菌KDB-8混合種子液中活菌數比例分別為1:1:1，接種量為5%，充分混勻后關閉攪拌；控制發酵溫度為37℃，發酵時間為18小時，冷水迅速降溫至10℃以下，進行無菌灌裝、包裝，即得到益生菌口服液，其中乳酸菌的總活菌數約為50億/mL。實施例3阿膠的添加量對益生菌口服液的影響申請人為了驗證阿膠的添加量對于益生菌口服液的影響，選用實施例2所述益生菌口服液的優選制備方法：液體發酵培養基中各組分質量體積比分別為：紅糖7%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%，培養基的初始pH值為6.0，嗜酸乳桿菌KDB-03、干酪乳桿菌KDB-LC和發酵乳桿菌KDB-8混合種子液中活菌數比例分別為1:1:1，接種量為5%，充分混勻后關閉攪拌；控制發酵溫度為37℃，發酵時間為18小時。申請人按質量體積比為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%分別向上述液體發酵培養基中添加阿膠，其他操作同上，最終獲得8種阿膠益生菌口服液，依次命名為口服液1#，2#，……，8#。同時，以實施例2中不加阿膠的益生菌口服液作為對照，命名為口服液0#，分別檢測每種口服液中乳酸菌的總活菌數，計算乳酸菌增長率。具體結果見表2。乳酸菌增長率（%）=（阿膠益生菌口服液活菌數-對照益生菌口服液活菌數）/對照益生菌口服液活菌數×100%表2阿膠益生菌口服液中乳酸菌活菌數比較編號發酵培養基中阿膠添加量口服液中乳酸菌活菌數乳酸菌增長率0#0%5×109cfu/mL-1#0.5%6.1×109cfu/mL22%2#1.0%9.2×109cfu/mL84%3#1.5%10.8×109cfu/mL116%4#2.0%11.1×109cfu/mL122%5#2.5%7.3×109cfu/mL46%6#3.0%5.2×109cfu/mL4%7#3.5%2.3×109cfu/mL-54%8#4.0%1.4×109cfu/mL-72%從表2的結果可以看出，在阿膠益生菌口服液生產過程中，阿膠在發酵培養基中的添加量對于口服液中乳酸菌的總活菌數有重要影響。當阿膠添加量在0.5-2.0%時，制備得到的阿膠益生菌口服液中乳酸菌總活菌量隨著阿膠添加量的增加而增加，乳酸菌增長率為22%-122%；而當阿膠的添加量超過2%時，乳酸菌總活菌量隨著阿膠添加量的增加而迅速下降；尤其是，當阿膠添加量超過3%時，口服液中乳酸菌總活菌量開始低于不添加阿膠的對照益生菌口服液。上述結果表明，阿膠中的某些成分對于嗜酸乳桿菌KDB-03、干酪乳桿菌KDB-LC和發酵乳桿菌KDB-8的生長繁殖具有明顯的促進作用，但當這些成分超過一定劑量時又會反過來抑制上述乳酸菌的生長，取得了意料不到的技術效果。實施例4阿膠益生菌口服液及其制備方法配制液體發酵培養基：在發酵罐中加入適量水，分別將紅糖、阿膠、蛋白胨、酵母浸粉、乳清粉、土豆泥、低聚果糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4加入到罐中，攪拌溶解后定容。利用高溫蒸汽控制發酵罐內壓力0.09～0.10MPa，使溫度控制在115℃～121℃，殺菌25～45min，結束后冷卻降溫至35～40℃，其中各成分的質量體積比最終分別為：紅糖6.5-8%、阿膠0.5-2%、蛋白胨0.3-0.5%、酵母浸粉0.3-0.5%、乳清粉0.07-0.1%、土豆泥0.06-0.1%%、低聚果糖0.05-0.08%、K2HPO40.03-0.05%、KH2PO40.02-004%、MgSO40.03-0.05%，培養基的初始pH值為5.5-6.0。按發酵量的3-5%接種嗜酸乳桿菌KDB-03、干酪乳桿菌KDB-LC和發酵乳桿菌KDB-8的混合種子液（三種乳酸菌的活菌數比例為1：1：1）于發酵罐中，攪拌15-20min，充分混勻后關閉攪拌；控制發酵溫度為35～40℃，發酵時間為15～20小時，冷水迅速降溫至10℃以下，進行無菌灌裝、包裝，即得到阿膠益生菌口服液，其中乳酸菌的總活菌數超過50億/mL。進一步優選的，液體發酵培養基中各成分的質量體積比分別為紅糖7%、阿膠1.5%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%，培養基的初始pH值為6.0，嗜酸乳桿菌KDB-03、干酪乳桿菌KDB-LC和發酵乳桿菌KDB-8混合種子液中活菌數比例分別為1:1:1，接種量為5%，充分混勻后關閉攪拌；控制發酵溫度為37℃，發酵時間為18小時。冷水迅速降溫至10℃以下，進行無菌灌裝、包裝，即得到阿膠益生菌口服液，其中乳酸菌的總活菌數超過100億/mL。實施例5阿膠益生菌口服液的效果評價從健康人群中隨機挑選成年男女各20名，收集其新鮮糞便檢測其中的乳酸菌及雙歧桿菌數平均為2.14×108CFU/g和8.82×109CFU/g。40名健康成年人每天食用本發明所述阿膠益生菌口服液50ml，一周后檢測其新鮮糞便中乳酸菌及雙歧桿菌數平均為9.97×109CFU/g和9.52×1011CFU/g。上述結果表明，食用本發明提供的阿膠益生菌口服液能顯著提高人體腸道內乳酸菌和雙歧桿菌的數量，有效改善胃腸道環境。所述口服液中含有的阿膠成分不僅改善了口服液的風味，更具有益氣補血的功效，能顯著提升機體免疫力，增強機體抗病能力，有助于維護人體的健康。長期研究數據表明，每日飲用本發明提供的阿膠益生菌口服液，不僅能大幅增加腸道中益生菌的數量，改善胃腸道的消化與吸收功能，還能有效降低人體血液中膽固醇的含量，清除自由基，增強機體的免疫力，維護身體健康。當前第1頁1 2 3