一種植物乳桿菌飼料及其應用的制作方法

本發明涉及一種含植物乳桿菌魚飼料及其應用，屬于微生物技術領域。

背景技術：

鎘是人體非必需元素，具有很強的毒性以及致癌性。在美國毒物和疾病登記署(ATSDR)于2015年公布的危害物質目錄中，鎘位列第七位。工業上鎘常用于電池、合金、顏料的生產。工業生產中含鎘的廢棄物若未經過處理，直接排放到自然環境中，會造成區域內環境重金屬鎘污染。環境中的鎘會通過生物吸收以及體內蓄積作用會不斷在食物鏈中積累，進而危害處于食物鏈頂端的人類的健康。近年來隨著工業的不斷發展，環境鎘污染問題也愈發突出，其中水環境鎘污染也在世界范圍內廣泛報道。水體環境鎘超標不僅會對水生生物產生毒害，引發多種急慢性疾病，從而影響水產養殖業。同時，水生生物吸收水體中的鎘并在體內逐漸蓄積，不僅威脅水產品的食用安全性，消費者的身體健康也會受到潛在危害。現有對鎘的毒性研究中，水體中鎘超標會使魚類產生氧化應激，并對魚有一定的免疫毒性，從而導致魚的一些重要器官(如腮、肝、腎等)出現損傷并影響其正常的生理功能，進而抑制魚類正常生長，并增加魚類死亡率。

目前處理水生生物鎘中毒的可選方法較少，其主要方法集中于水體中鎘元素的減除以及鎘毒害作用的緩解。水體中鎘元素的減除主要依賴于吸附劑的吸附作用，如粉末活性炭、膨潤土、海泡石等，但靠吸附劑降低水環境中鎘濃度使用性較差且成本太高。緩解鎘毒害則主要集中降低鎘的生物利用率以及緩解機體氧化應激產生的危害，主要方法是在飼料中添加抗氧化劑以及鎘吸附劑。其中鎘吸附劑主要有殼聚糖，葡甘露聚糖與膨潤土等，抗氧化物質則主要包括維生素C、無機硒等。但吸附劑的攝入會破壞水生生物體內原有的離子平衡，而添加抗氧化物質則成本過高。固而尋找一種高效且低成本的方法緩解鎘對水生生物的毒害有著重要的意義。

已有的研究表明，魚類的腸道微生物在魚類的免疫力、新陳代謝能力以及抵抗病原菌能力方面有的不可或缺的作用。腸道菌群紊亂會使魚腸道免疫系統失調并導致魚類患病率增加。已有研究表明，益生菌可作為飼料添加劑混入飼料，并可有效調節魚的腸道菌群，改善魚的生長性能以及維持魚體內免疫平衡。同時，某些特定的乳酸菌菌株具有高效吸附鎘離子的特性，也可作為潛在吸附劑添加進飼料，加之乳酸菌的培養成本較低，可用于大規模的飼料制作。并且益生菌在緩解水生生物鎘中毒方面的研究較少，因此，探究一種能夠緩解水生生物鎘中毒的飼料，進而降低水生生物可食用部位的鎘含量，具有很大的研究意義以及應用價值。

技術實現要素：

本發明的第一個目的在于提供一種水生動物飼料，所述飼料含有≥10⁸CFU/g的植物乳桿菌CCFM 8610活菌。

在本發明的一種實施方式中，所述的植物乳桿菌CCFM 8610。該菌株已于2012年5月3日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No.6077，該菌株在申請號為201210322124.2的發明專利中公開。

在本發明的一種實施方式中，所述飼料是由植物乳桿菌CCFM 8610的菌劑與食品學上可接受的載體組成的。

在本發明的一種實施方式中，所述食品學上可接受的載體是指水生動物飼料的基礎配料。

在本發明的一種實施方式中，所述水生動物飼料含有粗蛋白30～35份，粗脂肪5～10份，粗纖維10～15份，粗灰分10～15份。

在本發明的一種實施方式中，所述水生動物飼料含有大豆粕、次粉、面粉、魚粉、礦物鹽、氯化膽堿、復合維生素、酪蛋白、豆粕、大豆油、VC-磷酸酯鈉、微晶纖維素、磷酸二氫鈣中的至少一種。

在本發明的一種實施方式中，所述水生動物飼料含有大豆粕20～25份、次粉20～25份、面粉20～25份、魚粉10～15份、礦物鹽1～2份、氯化膽堿0.5～1份、復合維生素1～2份、酪蛋白8～10份、豆粕20～25份、大豆油5～10份、VC-磷酸酯鈉0.2～0.5份、微晶纖維素2～4份、磷酸二氫鈣1～2份。

本發明的第二個目的是提供一種水生動物飼料的生產方法，是將配料粉碎，與植物乳桿菌CCFM 8610菌液混合，制備成菌體含量≥10⁸CFU/g的飼料。

在本發明的一種實施方式中，所述配料包括大豆粕、次粉、面粉、魚粉、礦物鹽、氯化膽堿、復合維生素、酪蛋白、豆粕、大豆油、VC-磷酸酯鈉、微晶纖維素、磷酸二氫鈣中的至少一種。

在本發明的一種實施方式中，所述菌液的制備包括以下步驟：將植物乳桿菌CCFM 8610按體積比以2-4％的接種量接種到MRS培養基中，37℃下培養16～24h，離心并洗滌菌體，用生理鹽水重懸使活菌濃度≥10¹¹CFU/mL。

在本發明的實施方式中所述的飼料制作包括以下步驟：將粒狀原料粉碎處理后與粉狀原料按比例混合，得到預混飼料，將所述菌液按14mL/kg預混飼料的比例均勻混入預混飼料，以小型顆粒飼料機進行制粒，制粒溫度為65℃。

本發明的第三個目的是提供一種飼喂水生動物的方法，所述方法是應用含有植物乳桿菌CCFM 8610的水生動物飼料飼喂水生動物。

在本發明的一種實施方式中，所述水生動物是羅非魚，所述飼喂是按羅非魚體重3～5％進行飼喂。

本發明還提供所述飼料在制備低含鎘水產品中的應用。

有益效果：本發明的植物乳桿菌CCFM 8610在魚飼料中的應用能夠加快羅非魚的生長速率，使其相對增長速率提高5％以上，并能有效降低羅非魚肌肉中鎘含量，由0.14μg/g降低至0.057μg/g,達到GB2762-2012中規定的魚類鎘限量標準(0.1μg/g)，緩解羅非魚體內因鎘中毒導致的氧化應激損傷，改善鎘暴露羅非魚的血細胞指標以及血清生化指標，對于制備低鎘含量、天然無重金屬污染的羅非魚及以羅非魚肉為原料的食品非常具有應用前景。

附圖說明

圖1為本發明的飼料制作方法流程圖；

圖2是羅非魚血液生理指標的變化：A，紅細胞壓積；B，血紅蛋白濃度；C，白細胞數量；D，紅細胞平均容量。注：標有不同字母的組表示有差異顯著(P<0.05)；

圖3是羅非魚血清生化指標的變化：A，總膽固醇；B，總甘油三酯；C，谷草轉氨酶；D，谷丙轉氨酶；E，高密度脂蛋白；F，總蛋白。注：標有不同字母的組表示有差異顯著(P<0.05)

圖4是羅非魚肝胰臟丙二醛(A)和谷胱甘肽過氧化物酶活性(B)的變化；注：標有不同字母的組表示有差異顯著(P<0.05)；

圖5是羅非魚腦丙二醛(A)和超氧化物歧化酶活性(B)變化；注：標有不同字母的組表示差異顯著(P<0.05)；

圖6是羅非魚糞便微生物組成變化(屬水平)；

圖7是羅非魚糞便中微生物相對豐度的變化：A,Cetobacterium,Plesiomonas和Deefgea的相對豐度變化；B，Flavobacterium,Pseudomonas,Cellvibrio和Acinetobacter的相對豐度變化。

具體實施方式

實施例1水生動物飼料的制備

按表1-2所示的基礎配方及營養組成配制飼料配料，按附圖1所示的方法制備飼料，具體步驟如下：

將植物乳桿菌CCFM 8610按體積比以2-4％的接種量接種到MRS培養基中，37℃下培養18h，離心并洗滌菌體，用生理鹽水重懸浮，使活菌濃度≥10¹¹CFU/mL。將粒狀原料經初清、粉碎處理后與粉狀原料按表1配方混合，得到預混飼料；將上述菌液按14ml/kg預混飼料的比例均勻混入預混飼料后，以小型顆粒飼料機進行制粒，制粒溫度為65℃，得到含該菌的顆粒飼料，所得顆粒飼料的活菌數大于10⁸CFU/g。

表1基礎飼料組成及含量

表2基礎飼料組成和營養成分含量

實施例2植物乳桿菌CCFM 8610對鎘暴露羅非魚生長性能影響的實驗

選取健康的羅非魚200尾，初始體重平均值±標準差為34.0±1.16g，隨機分成四組，每組三個平行，每個平行16-17尾。分組分別是，對照組：正常水體中飼養，飼喂基礎日糧；益生菌CCFM 8610組：正常水體中飼養，飼喂CCFM 8610益生菌飼料；Cd暴露組：暴露于1mg/L的Cd²⁺溶液中，飼喂基礎飼料；益生菌CCFM 8610干預組：暴露于1mg/L的Cd²⁺溶液中，飼喂CCFM 8610益生菌飼料。所使用的CCFM 8610飼料為附圖1中以濃縮菌液方式制作的顆粒飼料，飼料的每日飼喂量約為羅非魚體重的3％。實驗為期4周，期間記錄羅非魚的飼喂量、體重和死亡情況，每周收集一次羅非魚糞便。結束后記錄羅非魚體重，尾靜脈取血后處死羅非魚進行解剖。利用以下公式對羅非魚相對增長速率、飼料轉化率、存活率進行計算。

相對增長速率(％)＝[(四周后魚重(g)-初始魚重(g))/初始魚重(g)]×100％

飼料轉化率＝四周攝入飼料總量(g)/(四周后魚重(g)-初始魚重(g))

存活率(％)＝(四周后存活魚數量(尾)/初始魚數量(尾))×100％"

計算結果如表3所示。由表3可知，對比CCFM 8610組和對照組，發現在相對增長速率和飼料轉化率上均有有顯著性差異，說明益生菌促進了羅非魚的生長。

表3羅非魚的生長指標變化

注：不同字母代表的組別間具有顯著性差異(P<0.05)

實施例3植物乳桿菌CCFM 8610對鎘暴露羅非魚血液生理以及血清生化指標改善作用實驗

按照實施例1所述以羅非魚進行動物實驗和分組，實驗結束后對羅非魚進行尾部靜脈取血，每個處理組取15條，其中一半血液放入添加有抗凝劑(EDTA-2K)的無菌EP管中，使用血細胞分析儀(BC-5300V；Mindray,China)進行血液生理指標分析，另一半經靜置1h后離心(3000g，10min)得到血清，使用全自動生化分析儀(BS-400；Mindray,China)進行血清生化分析。

測定結果如附圖2和3所示。由附圖2可知，鎘暴露能顯著減少羅非魚血液中白細胞數量(WBC)，同時紅細胞壓積(HCT)以及紅細胞平均容積(MCV)降低，血紅蛋白含量(HGB)下降。而通過CCFM 8610飼料干預，白細胞數量(WBC)和血紅蛋白含量(HGB)下降趨勢受到抑制。由附圖3可知，鎘暴露會顯著改變羅非魚血清中TC,TG,TP,ALT,AST和HDL含量(P<0.05)，而通過益生菌飼料干預，TG,ALT和AST的變化趨勢受到抑制。通過對比對照組和CCFM 8610組，可知含飼喂CCFM 8610的飼料會提高魚血液中HGB含量以及血清中HDL含量，對其他指標并無顯著性影響。以上數據表明，CCFM 8610能夠改善鎘暴露羅非魚血液生理以及血清生化指標。

實施例4植物乳桿菌CCFM 8610對鎘暴露羅非魚體內鎘含量的降低作用實驗

按照實施例1所述以羅非魚進行動物實驗和分組，實驗結束后處死羅非魚進行解剖，取肝胰臟、腎臟、脾臟、鰓、腦、腸組織，背部肌肉，放入微波消解爐(MARS；CEM,UK)中消解20min，得到的消解液使用電感耦合等離子體質譜儀(NexIon-300X；PerkinElmer)測定鎘含量。實驗結果如表4所示。

表4羅非魚組織鎘含量

注：-表示未檢測到；標有不同字母的組表示差異顯著(P<0.05)

對比CCFM 8610干預組與鎘暴露組可以發現，在脾、腎、腮、腸組織中，鎘含量呈現顯著性差異，而在腦和肝胰臟中差異則不顯著，但是仍然表現出CCFM 8610干預組要低于Cd暴露組。同時可以發現，鎘暴露組中羅非魚背部肌肉中的鎘含量達到了0.14μg/g，超出了GB2762-2012中規定的魚類鎘限量標準(0.1μg/g)。而通過飼喂益生菌飼料，羅非魚背部肌肉中鎘含量降低了59％，從0.14μg/g降低至0.057μg/g,達到GB2762-2012中規定的魚類鎘限量標準(0.1μg/g)。以上數據表明CCFM 8610能夠降低鎘暴露羅非魚體內的鎘含量，并顯著減少羅非魚可食用部位(即肌肉)中的鎘含量。

實施例5植物乳桿菌CCFM 8610緩解鎘暴露羅非魚氧化損傷實驗

以實施例4所述以羅非魚進行動物實驗和分組，實驗結束后處死羅非魚進行解剖，取肝胰臟，腎臟和腦，按照南京建成試劑測試盒的方法分別測定丙二醛(MDA)、還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平。測試結果如附圖4和5所示。

測試結果如附圖4和5所示，CCFM 8610抑制了羅非魚因鎘暴露造成的MDA含量和GSH-Px活性在肝胰臟中的變化，以及SOD活性和MDA含量在腦中的變化。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，是生物體內清除自由基的首要物質，可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害，是生物體內氧化應激損傷的一種標志酶；GSH-Px是體內廣泛存在的一種抗氧化酶，能將有毒的過氧化物催化成無毒物質。兩者都是重金屬暴露的生物標志物；MDA是一種生物體內的自由基與脂質發生過氧化反應的終產物，是生物體內氧化應激損傷的一種標志酶。以上結果說明，CCFM 8610緩解了羅非魚鎘中毒引起的氧化應激和氧化損傷。

實施例6

以實施例1所述以羅非魚進行動物實驗和分組，每周從水體中收集糞便，使用糞便DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取糞便中所含DNA，并使用PCR擴增細菌16S rRNA中的V4V5區，擴增引物為515F(5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)，907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。

對擴增子進行電泳純化，使用膠回收試劑盒(Axygen Biosciences,CA,US)回收純化產物，并用熒光儀(Promega,US)進行定量。將純化后的擴增子等量混合后，利用Illumina MiSeq^TM測序服務技術平臺對混合物進行雙尾測序。測序結果儲存于ncbi的Sequence Read Archive(SRA)數據庫中。(收錄號：SRP089871)

使用QIIME(版本1.17)對測序結果進行de-multiplex以及quality-filter。使用UPARSE將相似度在97％以上的片段序列聚類成為分類操作單元(OTUs)，并利用UCHIME識別并移除嵌合序列。使用DPR分類(http://rdp.cme.msu.edu/)以及SILVA(SSU115)16S rRNA數據庫對每個16S rRNA進行比對分類(置信度閾值為70％)。

羅非魚腸道菌群分類結果如圖6、7，鎘暴露會降低腸道微生物多樣性以及顯著改變腸道菌群的結構。在屬水平上，鎘暴露會顯著增加羅非魚腸道內Flavobacterium,Pseudomonas,Cellvibrio和Acinetobacter的數量，同時顯著降低Cetobacterium,Plesiomonas和Deefgea的數量。而通過飼喂含CCFM 8610飼料，鎘暴露羅非魚腸道內的Flavobacterium和Pseudomonas的豐度得到了抑制。由于這兩種菌是常見的致病菌，故可認為含CCFM 8610飼料可改善羅非魚腸道微生物結構，并有效抑制腸道病原菌的生長。

隨后利用植物乳桿菌的特異性引物(LP-F,5′-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3′和LP-R,5′-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3′)對羅非魚糞便中該種群進行定量分析。結果如表5，可見鎘暴露會降低羅非魚能顯著降低羅非魚腸道內植物乳桿菌的豐度(第四周)，而飼喂含CCFM 8610飼料則能顯著增加羅非魚腸道內該種群的豐度。

表5羅非魚糞便中植物乳桿菌含量

以上數據表明植物乳桿菌CCFM 8610能調節鎘暴露羅非魚腸道微生物的組成及豐度，并有潛在的抑制腸道病原菌生長的能力。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

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<110> 江南大學

<120> 一種植物乳桿菌飼料及其應用

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