本發明涉及一種泥鰍飼料，具體涉及一種含有甲殼素酶的泥鰍生長飼料及其制備方法，屬于泥鰍飼料技術領域。
背景技術：
泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)，隸屬鯉形目、鰍科、花鰍亞科、泥鰍屬，俗稱鋼鰍、鰍魚、真泥鰍等。因為泥鰍肉質蛋白含量高、脂肪含量低、營養豐富、味道鮮美，深受廣大東南亞國家消費者青睞。近年來，由于環境污染、過度捕撈等原因，泥鰍野生資源呈下降趨勢，為了滿足巨大的市場，泥鰍人工養殖規模逐年擴大。但是泥鰍配合飼料的研究卻嚴重滯后于產業發展，成為泥鰍養殖業健康快速可持續性發展的制約因素之一，急需加強對泥鰍配合飼料的研究力度。
甲殼素酶(E.C.3.2.1.14)為第三代飼料酶制劑，可以隨機切斷甲殼素中的β-1,4糖苷鍵，降解甲殼素為水溶性的低聚糖(甲殼素聚糖)，進而消除其的抗營養作用，而且甲殼素聚糖具有特殊的生物學活性。目前，已有研究者將其應用與甲殼素含量較高的水產飼料中，以提高養殖動物對飼料的利用效率，如朱家勇等利用具有甲殼素酶降解活性的酵母菌添加于含有蠅蛆粉的鯽魚(Musca domestica)飼料，可降低甲殼素的抗營養作用，進而提高鯽魚的生長性能和非特異性免疫能力。再如Y zhang在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的飼料中添加甲殼素酶和蝦粉(富含甲殼素)后，發現甲殼素酶作用于蝦粉后斜帶石斑魚的生長性能和免疫能力得到顯著提高。目前，甲殼素酶在泥鰍飼料中的應用研究還是空白。
魚粉是一種廣泛應用于水產飼料中的優質蛋白質源，因其產量降低、需求量加大，魚粉的價格一直維持在較高水平，加大了養殖企業的飼養成本，限制了水產養殖業的發展。因此，為了降低飼料成本，提高養殖企業的經濟效益，尋求一種優質、價格低廉和供應量大的動植物蛋白質源對魚粉進行部分或全部替代，逐漸成為水產飼料的重要熱門研究方向之一。
蠅蛆粉(maggot meal)因其蛋白含量高、營養全面、價格低廉，已有研究報告其可以部分替代飼料中的魚粉。李賢等發現，蠅蛆粉可以替代泥鰍飼料中魚粉的25-50％，但發現隨著替代量的提高，泥鰍的生長性能逐漸下降，其認為是蠅蛆粉中含有較多的甲殼素，具有較高的抗營養作用，這與研究凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、鯽魚、石斑魚研究結果一致。本發明旨在為配制優質價廉的泥鰍生長飼料。
技術實現要素：
針對上述現有技術存在的問題，本發明提供一種含有甲殼素酶的泥鰍生長飼料，可降低飼料中甲殼素對泥鰍的抗營養作用，提高泥鰍對飼料的消化吸收率，提高其生長性能。本發明還提供了該泥鰍生長飼料的制備方法。
為了實現上述目的，本發明采用的一種含有甲殼素酶的泥鰍生長飼料，包括以下組份及含量，魚粉14％，蠅蛆粉27％，豆粕25％，玉米蛋白粉5％，高筋粉22％，甜菜堿0.5％，氯化膽堿0.5％，大豆磷脂1％，魚油0.5％，豆油2％，磷酸二氫鈣1.5％，維生素C多聚磷酸酯0.2％，維生素混合物0.3％，礦物質混合物0.5％；
將上述各組份均勻混合組成基礎飼料，以0.001-0.400％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，即得泥鰍生長飼料。
作為改進，所述維生素混合物在每千克飼料中，包括硫胺素50mg，核黃素200mg，鹽酸吡哆醇50mg，維生素B12 0.1mg，維生素K3 40mg，肌醇2000mg，泛酸400mg，煙酸750mg，葉酸15mg，生物素5mg，維生素A5000IU，維生素D 2000IU，維生素E 100mg，維生素C 320mg，次粉18.67g。
作為改進，所述礦物質混合物在每千克飼料中，包括四水硫酸錳40mg，六水氯化鈷80mg，五水硫酸銅12mg，七水氯化鋁15mg，碘酸鉀5mg，七水硫酸亞鐵1000mg，七水硫酸鋅350mg，氯化鈉5000mg，亞硒酸鈉6mg。
作為改進，將以下含量的組份，魚粉14％、蠅蛆粉27％、豆粕25％、玉米蛋白粉5％、高筋粉22％、甜菜堿0.5％、氯化膽堿0.5％、大豆磷脂1％、魚油0.5％、豆油2％、磷酸二氫鈣1.5％、維生素C多聚磷酸酯0.2％、維生素混合物0.3％和礦物質混合物0.5％，混合組成基礎飼料，加入基礎飼料總量0.100％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，即得泥鰍生長飼料。
作為改進，所述甲殼素酶為飼料級粉狀酶制劑，活性為20000U/g。
作為改進，所述蠅蛆粉中粗蛋白含量為53.00％，粗脂肪含量為13.5％，水分含量為8.2％，灰分含量為10.80％，鈣含量為1.00％，總磷含量為1.12％，能量為20.9MJ/kg。
另外，本發明還提供了一種上述任一項所述含有甲殼素酶的泥鰍生長飼料的制備方法，包括以下步驟：
1)蠅蛆粉的制備：取所需含量蠅蛆粉，粉碎研磨后過80目網篩，-20℃冰箱中保存備用；
2)泥鰍生長飼料的制備：取配方量的魚粉、豆粕、玉米蛋白粉、高筋粉、甜菜堿、氯化膽堿、大豆磷脂、魚油、豆油、磷酸二氫鈣、維生素C多聚磷酸酯、維生素混合物和礦物質混合物，及步驟1)所制備的蠅蛆粉，各組分均勻混合，粉碎并過60目篩，再制成直徑為2.00mm的顆粒飼料，自然冷卻后裝入密封袋，置于陰涼干燥處保存備用。
本發明的機理：飼料中添加外源性甲殼素酶，能有效降低甲殼素對動物消化和吸收的負面影響，消除其抗營養作用。甲殼素聚糖為甲殼素酶降解甲殼素的產物，相較于水不溶性的甲殼素，其具有抗氧化作用，能激活動物的免疫機能，具有較強的生物學活性。
本發明通過在飼料中添加0.001％-0.400％的甲殼素酶，能提高泥鰍的增重率和特定生長率，降低飼料系數。因此將甲殼素酶添加于含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中，可有效消除甲殼素對泥鰍的抗營養作用，能有效促進泥鰍的生長性能，增強泥鰍的非特異性免疫能力。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明了，下面通過實施例，對本發明進行進一步詳細說明。但是應該理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限制本發明的范圍。
除非另有定義，本文所使用的所有的技術術語和科學術語與屬于本發明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同，本文中在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發明。
實施例一
一種含有甲殼素酶的泥鰍生長飼料，包括以下組份及含量，魚粉14％，蠅蛆粉27％，豆粕25％，玉米蛋白粉5％，高筋粉22％，甜菜堿0.5％，氯化膽堿0.5％，大豆磷脂1％，魚油0.5％，豆油2％，磷酸二氫鈣1.5％，維生素C多聚磷酸酯0.2％，維生素混合物0.3％，礦物質混合物0.5％，將上述各組份均勻混合組成基礎飼料。
實施例二
向實施例一制得的基礎飼料中，加入基礎飼料總量0.025％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，即得泥鰍生長飼料。
實施例三
向實施例一制得的基礎飼料中，加入基礎飼料總量0.050％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，即得泥鰍生長飼料。
實施例四
向實施例一制得的基礎飼料中，加入基礎飼料總量0.100％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，即得泥鰍生長飼料。
實施例五
向實施例一制得的基礎飼料中，加入基礎飼料總量0.200％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，即得泥鰍生長飼料。
實施例六
向實施例一制得的基礎飼料中，加入基礎飼料總量0.400％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，即得泥鰍生長飼料。
本發明的泥鰍生長飼料的性能研究
1.1試驗用料
甲殼素酶為飼料級粉狀酶制劑，購自上海陸廣生物科技有限公司，活性為20000U/g；
試驗用蠅蛆粉購于江蘇長江飼料有限公司，粗蛋白含量為53.00％；粗脂肪含量為：13.5％；水分含量為8.2％；灰分含量為10.80％；鈣含量為1.00％；總磷含量為1.12％；能量為20.9MJ/kg。蠅蛆粉粉碎研磨后過80目網篩，-20℃冰箱中保存備用。
在基礎飼料的基礎上，參照實施例一至六，以0、0.025％、0.050％、0.100％、0.200％和0.400％的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，制成6種等氮等能試驗飼料，分別用E1(對照)、E2、E3、E4、E5和E6組表示。所有飼料原料均粉碎并過60目篩，再制成直徑為2.00mm的顆粒飼料，自然冷卻后裝入密封袋，置于陰涼干燥處保存備用。飼料中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量的測定參照AOAC(1995)的方法。飼料中總能采用氧彈量熱儀(TRHW-6000C)進行測定。基礎飼料組成及營養水平見表1。
表1 基礎飼料配方及化學成分
維生素混合物(mg/kg or IU/kg飼料)：硫胺素,50mg；核黃素，200mg；鹽酸吡哆醇，50mg；維生素B12,0.1mg；維生素K3,40mg；肌醇，2000mg；泛酸，400mg；煙酸，750mg；葉酸，15mg；生物素，5mg；維生素A，5000IU；維生素D,2000IU；維生素E，100mg；維生素C,320mg；次粉，18.67g。
礦物質混合物(mg/kg or g/kg飼料)：四水硫酸錳，40mg；六水氯化鈷，80mg；五水硫酸銅，12mg；七水氯化鋁，15mg；碘酸鉀，5mg；七水硫酸亞鐵，1000mg；七水硫酸鋅，350mg；氯化鈉，5000mg；亞硒酸鈉，6mg。
1.2試驗用魚與飼養管理
試驗選擇泥鰍幼魚，從徐州市七里溝農貿市場購得。試驗在徐州生物工程職業技術學院水產養殖實驗室的水族箱(120cm*60cm*40cm)中進行，開始飼喂鯉魚開口料，2周后隨機分6組，每組3個重復，每個重復放養45尾，初始體重約2.32±0.01g。試驗開始停喂24h后，于每天8:00和17:00各投喂1次，投喂量為泥鰍體重的3％左右，以泥鰍1h內攝食完為宜，根據實際情況適當調整投喂量。試驗用水為瀑氣后的自來水，水深15cm左右，水箱無土，每隔4d換水一次，以保證水質清潔，加熱棒加熱控制水溫在25-27℃。
1.3樣品采集與分析
試驗結束后停喂24h，分別稱量各組泥鰍的終末體重，統計泥鰍的尾數，計算平均終末體重、增重率、特定生長率、飼料系數、成活率、肥滿度等指標，參照李愛杰(1996)和劉永堅(2002)的方法測定。
取各組織樣品：取泥鰍血，經離心后，吸出血清待測；取血后再取出泥鰍的內臟，并分離出肝臟，并準確稱取內臟、肝臟重量，計算空殼率和內臟指數等指標。將肝臟和血清放人-80℃超低溫冰箱中，待測超氧化物歧化酶(Superoxide ismutase，SOD)活性及丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量。
增重率(weight gain rate，WGR，％)＝100×(終末體重－初始體重)/初體重；
特定生長率(specific growth rate，SGR，％/d)＝100×(ln終末體重-ln初始體重)/試驗天數；
飼料系數(feed coeficient，FC)＝投飼總量/(終末體重+死亡體重-初始體重)；
存活率(survival rate，SR，％)＝100×終末尾數/初始尾數；
空殼率(DOR，％))＝100×(體重-內臟重)/體重；
肥滿度(condition factor，CF，g/cm)＝100×體重/體長3；
內臟指數(viscerosomtic index，VSI，％)＝100×內臟重/體重；
肝臟和全腸道中SOD活性和MDA含量測定均采用南京建成生物有限公司生產的試劑盒，操作步驟按試劑盒中的說明書進行。
數據以平均值±標準誤(mean±S.E)表示，采用SPSS 17.0for Windows對所有數據進行單因子方差分析(ANOVA)，若差異達到顯著，則進行Tukey多重比較(Tukey HSD test)，顯著水平為P<0.05。
1.4蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍生長性能的影響
由表2可知，各試驗組終末體重隨著甲殼素酶添加量的增加先上升后下降，其中E4組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；E2和E3組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于對照組、E5和E6組(P<0.05)；對照組、E5和E6組差異不顯著(P>0.05)。E4組泥鰍的WGR最高，為78.00％，隨后依次是E3、E2、E6、E5、E1組，E1組最低，為40.33％；E4組顯著高于E1、E2、E5、E6組(P<0.05)，與E3組差異不顯著(P>0.05)；E1、E5和E6組之間無顯著差異(P>0.05)。各組泥鰍SGR的順序為E4>E3>E2>E6>E5>E1組，E4組顯著高于其他各組(P<0.05)；E2、E3和E4組與E1組差異顯著(P<0.05)，而E5、E6組與E1組差異不顯著(P>0.05)。各組飼料FC在1.40-1.51之間，其中E4組最低，為1.40，顯著高于E1、E2、E5、E6組(P<0.05)，與E3組差異不顯著(P>0.05)；E2、E5、E6組與E1組無顯著差異(P>0.05)。飼料中添加不同劑量的甲殼素酶對泥鰍的存活率無顯著影響(P>0.05)，但E4組泥鰍的SR最高，為95.56％。
表2 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍生長性能的影響
1.5蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍形體指標的影響
由表3可知，泥鰍的內臟指數、肥滿度、空殼率各組之間無顯著性差異(P>0.05)，但隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加，內臟指數有先降低后上升的趨勢，E4組最低，肥滿度和空殼率有先上升后下降的趨勢，E4組最高。
表3 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍形體指標的影響
1.6蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍各組織中SOD活性和MDA含量的影響
由表4可見，肝臟和血清中SOD活性均隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加先上升后降低，均在E4組最高，分別為153.96U·ml-1、113.63U·ml-1，且均顯著高于其他各組(P<0.05)。E2、E4和E5組泥鰍肝臟中SOD活性無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于E1組(P<0.05)；E6和E1組之間無顯著差異(P>0.05)。E3和E5組泥鰍血清中SOD活性差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于E1組(P<0.05)；E2、E6和E1組之間無顯著差異(P>0.05)。
表4 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍各組織中SOD活性的影響
由表5可見，肝臟和血清中MDA含量均隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加先降低后上升，均在E4組最低，分別為10.67nmol·ml-1、10.90nmol·ml-1。E2、E3和E4組肝臟MDA含量無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于E1和E6組(P<0.05)；E5和E6組與E1組差異不顯著(P>0.05)。E2、E3、E4和E5組泥鰍血清MDA含量無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于E1組(P<0.05)；E1和E6組差異不顯著(P>0.05)。
表5 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍各組織中MDA含量的影響
蠅蛆粉是一種新型生物蛋白飼料原料，蛋白質含量與魚粉相差無幾，同時含有多種生物活性物質，如抗菌肽、甲殼素等。由于不具有內源性甲殼素酶，動物很難降解蠅蛆粉中的甲殼素，某些情況下可能會對養殖動物的生長造成負面影響。
飼料中添加外源性甲殼素酶，能有效降低甲殼素對動物消化和吸收的負面影響，消除其抗營養作用。甲殼素聚糖為甲殼素酶降解甲殼素的產物，相較于水不溶性的甲殼素，其具有抗氧化作用，能激活動物的免疫機能，具有較強的生物學活性。本發明以甲殼素酶添加于含有蠅蛆粉(富含甲殼素)的飼料中飼養泥鰍，發現甲殼素酶可有效消除甲殼素對泥鰍的抗營養作用，促進泥鰍生長，增強泥鰍的非特異性免疫能力。
本發明在飼料中添加0.025％-0.100％的甲殼素酶，能提高泥鰍的增重率和特定生長率，降低飼料系數。因此甲殼素酶添加于含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中，能有效促進泥鰍的生長性能，提高飼料利用率。
在蠅蛆粉含量較高的泥鰍飼料中，通過添加甲殼素酶，能有效降解蠅蛆粉中甲殼素，消除其抗營養作用，促進營養物質的消化吸收，提高泥鰍的生長性能，另外，本發明發現添加10μg和20μg/kg體重的重組表達的甲殼素酶到含有2％蝦粉的斜帶石斑魚飼料中，能顯著提高斜帶石斑魚的生長性能。當甲殼素酶添加量為0.200％和0.400％時，泥鰍的增重率、特定生長率和飼料系數與對照組無顯著差異，原因可能是外源性酶過多的添加會抑制內源性酶的分泌，出現的一種酶活性飽和現象，進而影響泥鰍的生長性能。
本發明中，各添加甲殼素酶組的泥鰍內臟指數、肥滿度和空殼率與E1組之間無統計學差異，這說明添加甲殼素酶對泥鰍的形體指標無不良影響。同時，隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加，內臟指數有先降低后上升的趨勢，E4組最低，肥滿度和空殼率有先上升后下降的趨勢，E4組最高。原因可能是飼料中的脂類含量和氧化程度以及碳水化合物的含量有關。
抗氧化系統是動物體免疫防御機制中起著重要作用，是一種防御過氧化反應的傷害主動防御系統；SOD活性是衡量機體抗氧化能力和非特異性免疫能力的重要指標；MDA是脂質在自由基作用下發生過氧化反應的產物，通過測定其含量，能間接評價機體抗氧化的能力。本發明中添加甲殼素酶對泥鰍的SOD活性有顯著增強作用；MDA含量顯著降低。說明甲殼素酶添加與含量蠅蛆粉的飼料中可在一定程度上有效增強泥鰍的抗氧化能力；并且，通過數據分析，甲殼素酶添加量為0.100％效果最佳。
綜上所述，甲殼素酶添加于含有蠅蛆粉的飼料中，可降低蠅蛆中甲殼素對泥鰍的抗營養作用，提高泥鰍對飼料的消化吸收率，提高其生長性能，增強抗氧化力和非特異性免疫力，進一步提高了蠅蛆粉在泥鰍飼料中的應用價值。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換或改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。