一種超臨界流體降低脂肪酶活性的方法與流程

本發明涉及一種食品保鮮技術領域，尤其涉及一種超臨界流體處理脂肪酶的技術。

背景技術：

脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應，除此之外還表現出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的發揮依賴于反應體系的特點，如在油水界面促進酯水解，而在有機相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物中。由于微生物種類多、繁殖快、易發生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用pH、作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，主要的發酵微生物有根霉、曲霉和假絲酵母等等。作為一種生物催化劑，脂肪酶具有一般催化劑高效性、高選擇性、反應條件溫和等共同優點，是綠色環保的催化劑，越來越受到各個領域的關注。在食品工業方面，主要用于乳制品的增香、魚片脫脂和食用油加工；在紡織領域中主要用于羊毛防縮、絲綢除油去蠟以及改善滌綸親水性等方面；在化工工業中主要用于生產芥酸及其衍生物。同時，脂肪酶在洗滌添加劑、廢水處理添加劑、醫藥、造紙行業以及手性藥物的合成等方面也有相應的應用。

在乳制品生產和加工過程中,原料乳從收集到加工常常需要存放一段時間。為了防止乳酸菌或病原菌等微生物引起原料乳的腐敗,常用的方式是利用冷藏方法保存鮮乳。將擠出的乳迅速冷卻是保證鮮乳較長時間保持新鮮狀態的必要條件，但一般的冷藏溫度對嗜冷菌(嗜冷菌被定義為在7℃或7℃以下能夠繁殖的一類細菌,是一類常見的能引起乳品腐敗的微生物)的抑制作用很小。一般地講，嗜冷菌的繁殖本身不會引起乳的嚴重腐敗，嗜冷菌能產生耐熱的脂肪酶，這些耐熱的脂肪酶在巴氏消毒過程中基本不受影響，即使經過超高溫處理仍會有部分殘留，而殘留的脂肪酶則是使乳制品出現凝集、蛋白質酸化以及出現腐敗變味的主要原因。因此，為了保證乳制品的質量，降低脂肪酶的活性是十分必要的。

目前，工業中常采用的是巴氏滅菌和超高溫瞬時滅活的方法，雖能殺死大多數細菌，但對于其他一些細菌產生的脂肪酶的滅活效果不佳，成本較高，且達不到預期的效果。因此，開發一種能有效降低脂肪酶活性的方法是解決上述問題的關鍵之一。

由于超臨界流體技術具有無水、無毒、節能減排、生態環保等諸多優勢，近年來受到了社會各界越來越多的關注。超臨界流體技術實現了污水的零排放，在源頭上解決了環境及處理產品自身被污染的問題，大大減少了生產成本和能耗。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，該方法可有效降低脂肪酶的活性，可應用于食品保鮮加工技術領域，以解決食品貯藏過程中微生物產生的脂肪酶破壞其品質。

本發明的一種超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，包括以下步驟：

(1)將脂肪酶直接散裝置于由纖維材料制成的處理容器中。

(2)將裝有脂肪酶的處理容器置于超臨界流體系統的處理釜中進行超臨界流體處理。

(3)將上述處理后的脂肪酶進行封裝，放入冰箱中進行冷藏保存備用。

進一步的，步驟(1)中，所述脂肪酶來自豬胰腺的酶制劑。

進一步的，步驟(1)中，所述脂肪酶為固體粉末。

進一步的，所述處理容器通過網狀框架支撐在所述處理釜中，優選金屬絲網狀框架。

進一步的，所述處理容器罩設在所述框架外/設置在所述網狀框架內。

進一步的，步驟(2)中，處理溫度為30-90℃。

進一步的，步驟(2)中，超臨界流體的壓強為8-23MPa。

進一步的，步驟(2)中，處理時間為1-4h。

進一步的，步驟(2)中，所述超臨界流體系統還設有超臨界流體循環裝置。

進一步的，步驟(2)中，所述超臨界流體為超臨界二氧化碳流體、超臨界正己烷流體和超臨界丙烷流體中的一種或幾種，優選超臨界二氧化碳流體。

借由上述方案，本發明至少具有以下優點：

1、本發明的超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，將脂肪酶直接散裝于專用處理容器中并封裝固定于超臨界流體系統的處理釜中，通過改變不同的超臨界流體條件實現對脂肪酶的處理，從而降低脂肪酶的活性及穩定性；

2、本發明的處理方法工藝簡單，操作簡便，能夠有效地降低脂肪酶的活性，從而可應用于改善乳制品貯藏過程中出現變質的問題，且不會破壞乳制品的風味并節約成本；

3、避免了超高溫瞬時滅活的高能耗和產品品質變化及其自身被污染等問題；

4、金屬絲組成的網狀框架和纖維材料制成的封裝袋構成處理容器，不但利于超臨界流體通過，使脂肪酶的處理效果更好，而且方便固定于處理釜中；

5、超臨界二氧化碳流體具有綠色環保、節能減排等優點。

上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1圖示了本發明的實施例1、2、3中處理壓強對脂肪酶活性及活性降低率的影響；

圖2圖示了本發明的實施例4、5、6、7中處理溫度對脂肪酶活性及活性降低率的影響；

圖3圖示了本發明的實施例8、9、10中處理時間對脂肪酶活性及活性降低率的影響。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

下列實施例中所涉及的試劑如下：乙醇、磷酸二氫鉀、十二水磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、均為分析純，聚乙烯醇、橄欖油均為化學純，酚酞指示劑，鄰苯二甲酸氫鉀為工作基準試劑，脂肪酶為生物純。

實施例1

一種超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，包括以下步驟：

(1)稱取0.500g脂肪酶，散裝于專用處理容器中并封裝；

(2)將處理容器固定于超臨界二氧化碳流體系統的處理釜內，將處理釜置于超臨界二氧化碳流體系統中，密閉系統后，在超臨界二氧化碳流體壓強為8MPa，溫度為40℃的條件下對脂肪酶進行處理1.0h；將上述經過處理后的脂肪酶放入冰箱中進行冷藏保存備用，并根據脂肪酶的活性測試方法進行活性測試。

處理后的脂肪酶的活性測試方法包括以下步驟：

(1)溶液配制：

底物溶液：稱取聚乙烯醇40.000g于燒杯中，緩慢加入900ml水，室溫下浸泡48h后，在沸水中不斷攪拌直至聚乙烯醇顆粒完全溶解，待溶液冷卻后定容至1000ml，用干凈紗布過濾后將濾液儲存備用；量取上述濾液150ml于燒杯中，再加橄欖油50ml，用高速剪切乳化機處理10min(分兩次處理，間隔5min)，既得乳白色PVA乳化液，該溶液現配現用。

氫氧化鈉標準溶液(C＝0.05mol/L，按GB/T 601配制)：先稱取氫氧化鈉110.000g，溶于100ml水中，取27ml稀釋定容到1000ml；再準確稱取烘至恒定重量的鄰苯二甲酸氫鉀(工作基準試劑)3.600g，加入80ml水溶解，再滴入2滴酚酞溶液，用標準氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，并保持30s，記下此時消耗的氫氧化鈉的體積(V)，同時做空白試驗，以此標定氫氧化鈉的濃度；最后準確量取上述氫氧化鈉溶液100ml，定容至1000ml，計算氫氧化鈉的實際濃度，計算稀釋后的氫氧化鈉實際濃度為0.051mol/L。

酚酞指示液(10g/L，按GB/T 603配制)：稱取酚酞1.000g，加乙醇完全溶解后定容至100ml。

磷酸緩沖液(pH＝7.5)：準確稱取磷酸二氫鉀1.960g和十二水磷酸氫二鈉39.620g于燒杯中，加水溶解定容到500ml，并用pH計校準。

脂肪酶溶液：準確稱取脂肪酶0.077g，用磷酸緩沖液溶解并定容至25ml。

(2)脂肪酶活性測試

開始前先用pH校正液校正pH計。取兩個100ml燒杯，向空白杯和樣品杯中各加入底物溶液4ml和緩沖液5ml，再向空白杯中加入15ml乙醇溶液。將空白被和樣品杯置于40℃水浴中預熱5min，然后向兩杯中各加待測酶液1ml，立即混勻計時。準確反應15min后，立即向樣品杯中加入15ml乙醇搖勻以終止反應，取出燒杯后用氫氧化鈉標準溶液滴定，以pH計顯示pH值為10.3作為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積。

(3)脂肪酶活性計算

脂肪酶活性定義：1g固體脂肪酶在40℃和pH為7.5的條件下，1min水解底物產生1μmol的可滴定的脂肪酸為一個活力單位，單位Ug^-1。活性計算公式(Ⅰ)如下：

式中：X表示脂肪活性，單位：Ug^-1；

V₁：滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，單位：ml；

V₀：滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，單位：ml；

C：氫氧化鈉標準溶液濃度，單位：mol/L；

50：0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00ml相當于脂肪酸50umol；

n：酶的稀釋倍數；

0.05：氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數；

1/15：反應時間15min，以1min計。

活性降低率R的計算公式(Ⅱ)如下：

式中：R表示脂肪酶的活性降低率；

X₁表示超臨界流體處理后脂肪酶的活性，單位為Ug^-1；

X₀表示超臨界流體處理前脂肪酶的活性，單位為Ug^-1。

根據上述方案中的方法和步驟測得超臨界流體處理前脂肪酶的活性為25807Ug^-1；根據上述方案中的方法和步驟測定本實施例處理后的脂肪酶的活性為18053Ug^-1，活性降低率為30.0％。由于脂肪酶的活性降低率表示的是脂肪酶處理前后脂肪酶的活性的損失率，亦即反映脂肪酶在處理前后活性的穩定性，故經過實施例1的工藝處理后，脂肪酶的活性大幅降低，其穩定性也顯著降低，所得實驗結果如圖1所示。

實施例2

本實施例步驟與實施例1基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：壓強為10MPa。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為18164Ug^-1，活性降低率為29.6％，脂肪酶的活性及穩定性均有明顯地降低，所得實驗結果如圖1所示。

實施例3

本實施例步驟與實施例1基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：壓強為20MPa。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為18940Ug^-1，活性降低率為26.6％，脂肪酶的活性及穩定性均有所降低，所得實驗結果如圖1所示。

實施例4

本實施例步驟與實施例1基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：壓強為15MPa，溫度為60℃。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為18829Ug^-1，活性降低率為27.0％，脂肪酶的活性及穩定性均有所降低，所得實驗結果如圖2所示。

實施例5

本實施例步驟與實施例4基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：溫度為70℃。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為17832Ug^-1，活性降低率為30.9％，脂肪酶的活性及穩定性均有明顯降低，所得實驗結果如圖2所示。

實施例6

本實施例步驟與實施例4基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：溫度為80℃。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為16060Ug^-1，活性降低率為37.8％，脂肪酶的活性及穩定性均有所降低，所得實驗結果如圖2所示。

實施例7

本實施例步驟與實施例4基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：溫度為90℃。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為13069Ug^-1，活性降低率為49.4％，脂肪酶的活性及穩定性均有大幅的降低，所得實驗結果如圖2所示。

實施例8

本實施例步驟與實施例1基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：壓強為15MPa，溫度為50℃，處理時間為1.5h。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為18607Ug-¹，活性降低率為27.9％，脂肪酶的活性及穩定性均有所降低，所得實驗結果如圖3所示。

實施例9

本實施例步驟與實施例8基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：處理時間為2.0h。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得的脂肪酶活性為18829Ug^-1，活性降低率為27.0％，脂肪酶的活性及穩定性均有所降低，所得實驗結果如圖3所示。

實施例10

本實施例步驟與實施例8基本相同，其區別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理條件為：處理時間為2.5h。

對本實施例處理后的脂肪酶進行同實施例1方法和條件相同的活性測試，測得其活性為19383Ug^-1，活性降低率為24.9％。脂肪酶的活性和穩定性均有所降低，所得實驗結果如圖3所示。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，并不用于限制本發明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。