一種復合雙酶同步提取北蟲草多糖的方法及在加工北蟲草飲料中的應用與流程
本發明涉及一種真菌多糖的提取方法，特別是涉及一種復合雙酶同步提取北蟲草多糖的方法及在加工北蟲草飲料中的應用，屬于高新技術加工領域。
背景技術：
王普等通過蟲草多糖的化學結構重點研究蟲草多糖藥理活性尤其是抗腫瘤、降血糖、對肝臟和腎功能的保護作用,以及免疫調節作用，提出蟲草多糖可應用到食品中，對人體健康起到重大作用。何建麗等對蟲草中功能成分，蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖、甾醇、超氧化物歧化酶等檢測方法進行研究、總結，可將其應用于蟲草食品的質量監控和開發。劉春泉等研究北蟲草多糖提取和分離純化，通過研究其結構來明確其功能因子和作用機理，對北蟲草多糖的應用產生重要影響。朱培欣研究蟲草多糖對免疫活性、體外抗癌活性、抗氧化活性有顯著的作用，并且通過分離純化蟲草多糖提高其生理活性。曲瑾郁等研究也進一步證明：將蟲草多糖進行純化后，再對其進行化學修飾，蟲草多糖的抗氧化活性進一步加強。賈俊強等采用α-淀粉酶修飾蟲草多糖，其DPPH、還原力等抗氧化活性也顯著增加。
但是目前的蟲草在提取過程中，多糖提取率低，穩定性不理想，并且有化學試劑殘留等問題。
技術實現要素：
本發明針對上述現有技術中存在的問題，提供了一種復合雙酶同步提取北蟲草多糖的方法，解決了現有技術中多糖提取率低，有化學試劑殘留的問題。
本發明的另一目的在于提供一種復合雙酶制取北蟲草飲料的方法，達到提高蟲草多糖含量，減少損失，增加多糖穩定性的目的。
一種復合雙酶同步提取北蟲草多糖的方法，該方法包括以下步驟：
步驟(1)、將干燥的北蟲草進行粉碎過60目篩，得到北蟲草粉；
步驟(2)、然后將北蟲草粉加水混合，料液質量比為1：12-1：28，用食用檸檬酸調節pH，使其一直保持pH3.5，然后向混合液中添加果膠酶并放到55℃水浴鍋中酶解，果膠酶添加量為物料質量的2％-4％，再用食用碳酸氫鈉調節pH至5.5并保持，然后添加纖維素酶酶解，纖維素酶添加量為物料質量的2％-4％，兩次酶解總時間為3-5h；
步驟(3)、酶解后，混合液在4000rad/min離心機中離心30min后取上清液，即蟲草原液，并在4℃下保存。
所述的步驟(2)中，果膠酶添加量為2.54wt％，纖維素酶添加量為2.08wt％，料液質量比1：21.45，酶解時間3.9h。
一種復合雙酶同步提取北蟲草多糖在加工北蟲草飲料中的應用，包括如下步驟：
步驟1.將上述蟲草原液煮沸滅酶15min，加水進行調配，并添加白砂糖、果糖、檸檬酸溶解并調配飲料口感，再加入飲料質量0.06％的黃原膠和0.04％的羧甲基纖維素鈉，最后加入山梨酸鉀，上述蟲草原液和水的質量比為1：6-1：18，白砂糖和果糖添加質量比為2：1，總糖添加量占飲料質量的4％-16％，糖酸質量比為70：1-110：1，山梨酸鉀添加量占飲料質量的0.05％-0.25％；
步驟2.將調配好的飲料進行高壓均質，均質壓力：20MPa，然后進行超高溫瞬時殺菌，殺菌條件：135℃，2s，最后無菌灌裝制成成品，完成蟲草飲料的加工。
所述的步驟1中，蟲草原液與水質量比為1：12，糖添加量占飲料質量的10％，糖酸質量比100：1，山梨酸鉀添加量占飲料質量的0.1％。
本發明的優點效果如下：
北蟲草中富含蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸、甾醇、多肽、超氧化物歧化酶等生物活性物質，尤其是蟲草多糖能夠起到抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、增強免疫力、降血脂等功效，通過酶法提取蟲草多糖，可以有效提高蟲草多糖的提取率，并且不破壞蟲草的結構和組成，有利于其功效的發揮，提高利用率和吸收率，復合雙酶生產的北蟲草飲料是一種營養價值極高的飲品，具有極大的市場潛力。
本發明在加工北蟲草飲料的過程中，采用果膠酶和纖維素酶復合酶解工藝提取蟲草多糖，并通過復合穩定劑和功能性單糖進行飲料調配。此發明可以最大限度地提高蟲草多糖的提取率，保證蟲草多糖的穩定性，并用北蟲草多糖原液進行飲料配方的研制。因此，復合雙酶制取北蟲草飲料工藝研究具有重要的應用價值和實際意義。
附圖說明
圖1是本發明總工藝路線圖。
圖2是果膠酶添加量和纖維素酶添加量交互作用響應面圖。
圖3是果膠酶添加量和料液比交互作用響應面圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明具體實施例進行詳細描述。
一種復合雙酶同步提取北蟲草多糖和加工北蟲草飲料的方法，該方法包括以下步驟：(1).將干燥的北蟲草進行粉碎過60目篩，得到北蟲草粉；(2).然后將北蟲草粉加水混合，料液比為1：12-1：28，用食用檸檬酸調節pH，使其一直保持pH3.5，然后添加物料質量2％-4％的果膠酶放到55℃水浴鍋中酶解一定時間，再用食用碳酸氫鈉調節pH至5.5并保持，添加物料質量2％-4％的纖維素酶，酶解總時間3-5h；(3).酶解后，混合液在4000rad/min離心機中離心30min后取上清液，即蟲草原液，并在4℃下保存；(4).將蟲草原液煮沸滅酶15min，加一定量水進行調配，并添加一定量白砂糖、果糖、檸檬酸溶解并調配飲料口感，再加入飲料質量0.06％黃原膠和0.04％羧甲基纖維素鈉，提高飲料穩定性，最后加入一定量的山梨酸鉀，上述原液和水比例為1：6-1：18，白砂糖和果糖添加比例為2：1，總糖添加量為4％-16％(按照飲料質量計算)，糖酸比為70：1-110：1，山梨酸鉀添加量為0.05％-0.25％(按照飲料質量計算)；(5).將調配好的飲料進行高壓均質，均質壓力：20MPa，然后進行超高溫瞬時殺菌，殺菌條件：135℃，2s，最后無菌灌裝制成成品，完成蟲草飲料的加工。
所述北蟲草多糖提取過程最優參數：果膠酶添加量2.54％，纖維素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解時間3.9h；北蟲草飲料調配最優參數：蟲草原液與水比例1：12，糖添加量為10％，糖酸比100：1，山梨酸鉀添加量為0.1％。
實施例1酶解提取蟲草多糖最佳參數的篩選實驗
1材料與方法
1.1材料、試劑
北蟲草 大連金和菌業有限公司
果膠酶(食用級) 南京松冠生物科技有限公司
纖維素酶(食用級) 北京盛世嘉明科技開發有限公司
1.2主要儀器設備
1.3實驗方法
1.3.1蟲草多糖測定干燥的北蟲草進行粉碎，過60目篩，55℃水浴下酶解提取蟲草多糖，離心取上清液，重復上述操作三次，合并上清液，真空濃縮至一定體積，加入最終體積80％的乙醇沉淀，將沉淀加水復溶，采用sevage法除蛋白，干燥冷凍備用。
葡萄糖標準溶液的配置：
精確稱取100mg烘干至恒重的無水葡萄糖，在小燒杯加少許水溶解，移至100ml容量瓶加水定容，反復震搖后從中吸取10ml，并定容至1000ml，得到的標液100ug/ml貯存備用。標準曲線的繪制表如下
按上表加入各試劑后，震蕩搖勻，沸水浴15min加熱，冷卻后，于490nm處測定吸光度，以葡萄糖含量C為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線。
樣品多糖含量的測定：用分析天平稱取1.0000g多糖樣品定容至100ml，從中精密吸取1.0ml置于試管中，參照葡萄糖標準曲線的繪制方法測定樣品吸光度，根據標準曲線計算葡萄糖質量濃度，再由換算因子得到蟲草多糖的含量。
1.3.2換算因子測定精密稱取干燥至恒重的蟲草多糖5.0mg，用蒸餾水定容至100ml容量瓶中，搖勻得到蟲草多糖儲備液，取2.0ml測定其吸光值，同時做空白對照。按照f＝m/(c*D*V)公式計算，f表示換算因子，m表示蟲草多糖質量，c為儲備液中葡萄糖的質量濃度，D為稀釋倍數，V為樣品體積。
1.3.3工藝流程
見附圖1
2結果與分析
2.1北蟲草酶解工藝條件的確定
2.1.1果膠酶添加量對蟲草多糖提取率的影響從表1可知，隨著果膠酶添加量增加，提取率先增加后保持穩定。由于酶解過程中果膠酶可以將蟲草細胞壁多糖中果膠進行分解，有利于多糖溶出。當果膠酶添加量達到3.50％時，多糖提取率達到最大。
表1果膠酶添加量對多糖提取率的影響
2.1.2纖維素酶添加量對蟲草多糖提取率的影響從表2知，隨著纖維素酶添加量增加，提取率先增加后降低，并有緩慢下降趨勢。由于蟲草細胞壁主要為纖維素等多糖，阻礙蟲草多糖溶出，纖維素酶將纖維素進行分解，提高多糖溶出效果。當纖維素酶添加量為2.5％時，多糖提取率達到最大。
表2纖維素酶添加量對多糖提取率的影響
2.1.3料液比對蟲草多糖提取率的影響從表3知，隨著料液比增加，提取率先增加后減小。隨著料液比增大，溶液中酶與底物接觸面積增加，提高酶解效果，多糖溶出增加，但隨著料液比繼續增加，酶的濃度被稀釋，酶解效果下降，因此當料液比為1：24時，多糖提取率達到最大。
表3料液比對多糖提取率的影響
2.1.4酶解時間對蟲草多糖提取率的影響從表4知，隨著酶解時間增加，多糖提取率先增加后保持穩定。隨著酶解時間增加，酶與底物充分接觸，有利于多糖溶出，當酶解時間在4-4.5h時，多糖提取率達到最大。
表4酶解時間對多糖提取率的影響
2.2工藝條件的優化
2.2.1響應面試驗設計在單因素試驗的基礎上，確定各因素的最佳水平值范圍，采用響應面中心組合試驗設計，研究各多糖提取率影響因素對多糖提取率的影響規律，并得到復合酶法提取多糖的最優條件。以多糖提取率影響因素果膠酶添加量(A)、纖維素酶添加量(B)、料液比(C)、酶解時間(D)為自變量，以多糖提取率為響應值，其因素水平編碼表見表5。
表5試驗因素水平編碼表
2.2.2響應面分析響應面試驗方案及結果見表6。試驗號1～16為析因試驗，17～21為5個中心試驗，用以估計試驗誤差。
表6響應面試驗方案及結果
通過統計分析軟件Design expert8.06進行數據分析，建立二次響應面回歸模型為：
Y＝9.30+0.21A-0.26B+0.10C+0.086D+0.31AB-0.23AC-0.42AD+0.085BC+0.27BD-0.16CD-0.35A2-0.31B2-0.43C2-0.45D2
表7回歸與方差分析結果
進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，響應曲面數據的方差分析結果見表7。由表7可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(P<0.001)，失擬項不顯著，并且該模型R2＝99.28％，R2Adj＝97.60％，說明該模型與試驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，試驗誤差小，可以用此模型來分析和預測結果。由此可以認為上面給出的二次回歸方程模型是合適的。由F檢驗可以得到因子貢獻率為：B>A>C>D，即纖維素酶添加量>果膠酶添加量>料液比>酶解時間。
根據試驗結果可知，A、B、C、AB、AC、AD、BD、CD、A2、B2、C2、D2對蟲草多糖提取率的影響顯著。將其他2個因素固定在零水平，可以得到其他2個因素的響應面圖，可以從中看出各因素之間的交互作用。
各兩因素顯著項(P<0.05)交互作用對蟲草多糖提取率影響的響應面圖見圖2-3。
當料液比、酶解時間在零水平時，圖2表示果膠酶添加量和纖維素酶添加量有顯著的交互作用，在不同纖維素酶添加量作用下，果膠酶對多糖提取率的影響趨勢是先保持穩定后有小幅降低；在不同的果膠酶添加量作用下，纖維素酶添加量對多糖提取率的影響趨勢也是先保持穩定然后下降。說明果膠酶添加量在2.5％-3.0％附近，多糖提取率達到最大，所以果膠酶添加量不宜過高；纖維素酶添加量在2.0％-2.5％附近，多糖提取率達到最大。
當纖維素酶添加量、酶解時間在零水平時，圖3表示果膠酶添加量和料液比有顯著的交互作用，在不同料液比作用下，果膠酶添加量對多糖提取率的影響趨勢是先升高后降低；在不同果膠酶添加量作用下，料液比對多糖提取率的影響趨勢是先增加后降低并保持穩定，料液比在1：20附近，提取率達到最大。
2.3最佳工藝的確定和驗證試驗
應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析可知，當果膠酶添加量2.54％，纖維素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解時間3.9h，響應面最優值為(9.37±0.12)％，在此條件下蟲草多糖提取率最大。
在響應面分析法求得的最佳條件下，即果膠酶添加量2.54％，纖維素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解時間3.9h，進行平行試驗(3次)，3次平行試驗值為9.29％、9.32％、9.28％，平均值為9.30％。響應值的試驗值與回歸方程預測值吻合良好，說明該模型能夠較好地預測蟲草多糖的提取率。
實施例2蟲草飲料感官品質參數優選實驗
1.1材料、試劑
1.2主要儀器設備
1.3實驗方法
1.3.1感官評價測定采用百分制進行感官評定，所有感官指標的評分值范圍均為1-25分，分值越高，則表示其質量越好。感官評價指標包括口感、氣味、色澤、粘稠度4項，感官指標及其評分標準如下:氣味(1-9分：差；10-19分：一般；20-25分：好)，口感(1-9分：差；10-19分：一般；20-25分：好)，色澤(1-9分：無色；10-19分：適中；20-25分：淡黃色)，粘稠度(1-9分：非常粘稠；10-19分：適中；20-25分：好)。選擇30名專業飲料鑒評師進行感官評價，其中包括15名男士，15名女士。
1.3.2工藝流程
見附圖1
2結果與討論
2.1料液比對感官評價值的影響從表8知，隨著原料液與水的比例增加，感官評價值先增加后減小。料液比增加，使原料液中蟲草特有的味道降低，有利于感官評價，但水繼續增加，口感降低。所以料液比在1：12時，感官評價值達到最大。
表8料液比對感官評價值的影響
2.2總糖添加量對感官評價值的影響從表9知，隨著總糖添加量增加，感官評價值先增加后減小。糖添加量增加，甜度增加，口感較好，但由于果糖的甜度較高，糖添加量繼續增加，飲料口感下降。所以總糖添加量在10％時，感官評價值最大。
表9總糖添加量對感官評價值的影響
2.3糖酸比對感官評價值的影響從表10知，隨著糖添加量增大，感官評價值先增加后減小。通過糖酸比調節飲料的口感，當糖酸比在100：1時，感官評價值達到最大。
表10糖酸比對感官評價值的影響
2.4山梨酸鉀添加量對感官評價值的影響從表11可知，隨著山梨酸鉀添加量增加，感官評價值先增加后降低并保持穩定，當山梨酸鉀添加量在0.1％時，感官評價值達到最大。
表11山梨酸鉀添加量對感官評價值的影響
2.5工藝條件優化
2.5.1正交試驗設計在單因素試驗的基礎上，確定各因素的最佳水平值范圍，采用四因素三水平正交試驗設計，研究各感官評價影響因素對感官評價值的影響規律，并得到蟲草多糖飲料的最優條件。以感官評價值影響因素蟲草原液料水比(A)、總糖添加量(B)、山梨酸鉀添加量(C)、糖酸比(D)為自變量，以感官評價值為指標，其因素水平表見表12。
表12正交因素水平表
2.5.2正交試驗結果與分析
由表13知，根據極差分析，R值為極差，R值越大，其因素對感官評價值影響越大，結果表明RB>RA>RD>RC，即因素貢獻率：B>A>D>C，最優水平為A2B2C2D3，因此蟲草飲料的最佳工藝為：北蟲草原液料水比1：12，總糖添加量10％，山梨酸鉀添加量0.1％，糖酸比100：1。
表13試驗方案及試驗結果
2.6最佳工藝的確定和驗證試驗
應用四因素三水平正交試驗和極差分析可知，當北蟲草原液料水比1：12，總糖添加量10％，山梨酸鉀添加量0.1％，糖酸比100：1，感官評價值95.7±1.2，口感、色澤、粘稠度、氣味最佳。
在正交試驗求得的最佳條件下，即北蟲草原液料水比1：12，總糖添加量10％，山梨酸鉀添加量0.1％，糖酸比100：1，進行平行試驗(3次)，3次平行試驗值為95、95.1、94.8，平均值為95。試驗值與正交試驗預測值吻合良好，說明該模型能夠較好地預測產品的感官評價值。
并且在最優條件下，即北蟲草原液料水比1：12，總糖添加量10％，山梨酸鉀添加量0.1％，糖酸比100：1，此時產品多糖含量1.02％。
3結論
(1)北蟲草多糖提取過程最優參數：果膠酶添加量2.54％，纖維素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解時間3.9h；
(2)北蟲草飲料最優配方：北蟲草原液料水比1：12，總糖添加量10％，山梨酸鉀添加量0.1％，糖酸比100：1。
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