本發明涉及飼料添加劑制備技術領域，尤其涉及一種保護豬肝臟的微生物飼料添加劑及其制備方法。
背景技術：
肝臟是豬體內最大的腺體，肝細胞產生的許多物質可以直接釋放入血液中，影響和調節機體的代謝和生理活動。另外肝臟還有導管系統，生成的膽汁能經膽管排入十二指腸。因此肝臟具有內分泌腺和外分泌腺的性質。肝臟豐富的血液供應和獨特的生態結構使其代謝極為活躍，不僅在糖、脂、蛋白質、維生素和激素等代謝方面與各個組織器官密切相關，而且具有分泌、排泄和生物轉化等重要功能。
然而，隨著規模養豬業的飛速發展，豬群受不良的養殖觀念影響和危害極其嚴重。霉變飼料的飼喂，長期大量、超量抗生素的使用，養殖密度大造成的空氣質量惡劣等因素，直接或間接造成豬的肝臟、腎臟嚴重損傷，從而導致豬群的免疫力下降甚至免疫抑制，使豬長期處于亞健康狀態（“底色病”），為各種疫病的入侵提供了可乘之機，風吹草動一下，豬即發病。此外，環境變化應激和疾病造成的生理病理負擔也對肝臟造成很大壓力。在各種壓力之下，肝臟疲于應付，正常功能受到影響。
技術實現要素：
本發明針對現有技術中的缺陷，提出一種促進肉豬肝臟抗氧化能力的微生物飼料添加劑及其制備方法，為實現該技術目的，本發明的技術方案為：
一種保護豬肝臟的微生物飼料添加劑的制備方法，其特征在于，采用菌種復合培養方法，使菌種在同一培養基中馴化培養，其制備步驟為：
第一步：菌種篩選和生產制種
a. 菌株篩選：菌種來源健康豬小腸，采用乳酸菌培養基MRS進行乳酸菌分離，篩選植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌；在啤酒發酵液中用麥氏瓊脂培養基分離釀酒酵母菌在實驗室中作菌株保存；
b. 將分離的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養基中，同時添加0.1-1％比例的亞硒酸鈉，在28－35℃溫度下培養20－25小時，然后將釀酒酵母菌接種于麥氏瓊脂培養基、枯草芽孢桿菌接種于營養瓊脂培養基，植物乳桿菌接種于步驟a中的乳酸菌培養基中，進行劃線培養，選出生長快、菌體特征明顯的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，在實驗室中保存；
c. 生產制種：將步驟b的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別轉接入裝有PDA和MRS營養瓊脂培養基的茄子瓶中，在28－35℃溫度下培養40－50小時，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出，然后放入2－6℃的冰箱中進行保存；
第二步：復合菌劑制作
a. 按以下重量配比稱取茄子瓶中各生產菌種：植物乳桿菌5－10％、釀酒酵母菌70－85％、枯草芽孢桿菌10－20％；
b. 將生產菌種混合，將混合后的菌種按復合菌劑重量比例的4－6％添加在由糖蜜2-6%、蛋白胨0.5-1%、葡萄糖2-4%、氯化鈉0-1%、酵母膏2-6％、硫酸鎂0-1%、水81-93.5％組成的復合菌劑培養基中， 調節ph值至6－8，放入容器中加溫至110－130℃進行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發酵罐中發酵6-8小時，通氣量10-50L/小時，攪拌速度180-250rpm；
第三步：復合菌劑擴大和馴化培養
a. 將復合菌劑按以下重量配比與炭源、氮源、無機鹽及誘導劑混合：復合菌劑5-15%、碳源2-15%、氮源 2-10%、無機鹽 0.5－1%、 亞硒酸鈉 0.1-1%、水58－90.4％混合置入密閉罐中，110－130℃進行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發酵罐中發酵20-30小時，通氣量10-50L/小時，攪拌速度180-250rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補料，30-60L/小時，直至發酵結束；
B. 發酵過程中取樣三次，測定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4；
第四步：粉碎過篩
a. 將發酵液加入2%的硅藻土在100-125℃下噴霧干燥干燥2-3S，，干燥后的產品過80目篩，篩出的粗料再進行粉碎和過篩，
b. 過篩后裝入包裝袋中，轉入成品庫有序堆放，通知品管部門取樣檢測，主要參數：水份≤12.0%、活菌數≥100億/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性狀：淡黃色粉末狀固體。
所述的復合菌劑由植物乳桿菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌組成，其重量百分配比為：植物乳桿菌5－10％、釀酒酵母菌70－85％、枯草芽孢桿菌10－20％。
所述的碳源為糖蜜、葡萄糖之一或它們的混合物；所述的氮源為豆餅粉、菜粕粉、酵母粉、玉米漿之一或它們的混合物；所述的無機鹽為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀之一或它們的混合物。
另一方面，本發明還提供通過上述方法制備得到的保護豬肝臟的微生物飼料添加劑。
本發明采用在健康豬小腸中取食糜為菌源中篩選出的菌種與有機營養物質
混合，通過微生物發酵技術制成，它含有多種活性酶、小肽、游離氨基酸、單體
蛋白、抗氧化物質、維生素及抗菌物質，有益菌活菌數的數量達到了100億/克；
在健康豬的腸道中存活著多種細胞構成的菌群，當本發明產品的有益微生物進入豬道后，結合原有的有益菌，迅速形成優勢微生物菌群，抑制了腸道有害菌的生長，其中的有益微生物在腸道壁周圍通過磷壁酸與腸粘膜上皮細胞緊密結合，形成菌膜屏障，阻止有害菌的定植；復合微生物還可以產生抗菌物質、乳糖菌素、桿菌肽等，抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌在腸道內的繁殖、定植和吸附、中和毒性產物，抑制氨和胺的合成，促進腸道相關淋巴組織的高度反應能力。
本發明產品中所含的谷胱甘肽其所含有的巰基可以充分與體內自由基結合而使自由基還原且促進超氧化物歧化酶合成而提高自由基清除率，同時還原性谷胱甘肽可以通過激活多種酶類等途徑促進糖類、脂肪及蛋白質等多種物質代謝且對藥物、生物毒性損傷所致腎功能損害起到解毒、穩定細胞膜、保持其完整性和促進藥物及細胞代謝等多種功效。作為一種非肽類內皮素拮抗劑可以有效拮抗內皮素、調節血管舒縮、保護肝臟血管內皮，因此對改善肝功能、保護肝臟具有十分重要的價值。
本發明產品中所含的活性微生物利于營養物的吸收提高飼料的利用率及能量，降低料重比；可減少外加無機酸鹽，減少糞便磷的排放，減輕對環境的污染，而且還可以提高被結合的蛋白質、礦物元素的利用，提高消化率。
本發明產品采用碳源、氮源、無機鹽及亞硒酸鈉作為菌種培養原料，它們是微生物細胞結構和酶的重要組成部分，還可維持酶的活性，能促進微生物生長繁殖，刺激活性酶及小肽的生成。
本發明從生態綠色養殖的目的入手，選育自然界中分離的益生素菌種，以農業廢料原料為培養基，通過多級的富集發酵，產生高濃度的有益于對飼料中多種成分消化和吸收的有益菌群，同時生產谷胱甘肽及小肽等物質的添加劑，在飼料中直接添加，可以提高豬肝臟抗氧化活性，可通過促進垂體GH的分泌,GH可能通過上調肝臟GHR基因轉錄水平和GHR水平,增強肝臟、半腱肌IGF-1基因轉錄,降低脂肪細胞IGF-1基因轉錄,使血清IGF-1水平提高,進而促進蛋白合成、提高養分利用率,最終促進豬的生長。肝臟能凈化被動物吸收的霉菌毒素，此凈化過程基于谷胱甘肽的氧化還原反應，可以減輕毒素侵害。本發明是一種安全、高效的綠色飼料添加劑。
綜上所述，本發明相對于現有技術的的優點是：
1.采用獨創的復合培養及馴化相結合的發酵技術，避免了各菌種的拮抗機制，使發酵產物得到最優化；
2.整個生產工藝最大程度上得到有益微生物最大化，發酵最主要產物谷胱甘肽胞內胞外全部回收；
3.產品中含有促進飼料采食量的乳酸，還有發酵中產生的纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶等多種活性酶，與有益菌群共同作用，使飼料中的營養充分吸收利用。
4.本發明中最主要原料是農業副產物糖蜜，再加上采用糧食作物和常用飼料載體作為主要培養基原料，生產成本低，易于在養殖中推廣。
5.本發明的產品采用飼料工業中2045（2013年）公告的菌種進行發酵，在保證改善豬自身免疫系統和生長發育，還能加快抗生素、重金屬和毒素代謝，符合生態農業的要求，為人民提供安全綠色產品提供保障。
具體實施方式
本發明提供了一種保護豬肝臟的微生物飼料添加劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟a. 菌株篩選：菌種來源健康豬小腸，采用乳酸菌培養基進行乳酸菌分離，篩選植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌；在啤酒發酵液中用麥氏瓊脂培養基分離釀酒酵母菌；
步驟b. 將分離的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養基中，同時添加0.1-1％比例的亞硒酸鈉，在28－35℃溫度下培養20－25小時，然后將釀酒酵母菌接種于麥氏瓊脂培養基，枯草芽孢桿菌接種于營養瓊脂培養基，植物乳桿菌接種于乳酸菌培養基中，進行劃線培養，選出生長快、菌體特征明顯的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，保存；
步驟c. 生產制種：將步驟b中獲得的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別轉接入裝有PDA和MRS營養瓊脂培養基的培養瓶中，在28－35℃溫度下培養40－50小時，待培養瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出，然后放入2－6℃的冰箱中進行保存備用；
步驟d. 按重量配比稱取步驟c中培養瓶中保存備用的各生產菌種，然后將三者混合；
步驟e. 將混合后的生產菌種按復合菌劑重量比例的4－6％添加在復合菌劑培養基中， 調節ph值至6－8，放入容器中加溫至110－130℃進行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發酵罐中發酵6-8小時，獲得復合菌劑；
步驟f. 將步驟e獲得的復合菌劑與炭源、氮源、無機鹽、誘導劑及水混合，110－130℃進行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發酵罐中發酵20-30小時，通氣量10-50L/小時，攪拌速度180-250rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補料，30-60L/小時，直至發酵結束；
步驟g. 將發酵液加入2%的硅藻土在100-125℃下噴霧干燥干燥2-3S，干燥后的產品過80目篩，篩出的粗料再進行粉碎和過篩，獲得保護豬肝臟的微生物飼料添加劑。
下面通過具體實施例對本發明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發明，但是下述實施例并不限制本發明范圍。
實施例1
第一步：菌種篩選和生產制種
a. 菌株篩選：在健康鵝小腸中取食糜為菌源，采用由MRS培養基的乳酸菌培養基進行乳酸菌分離、篩選植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌；在啤酒發酵液中用PDA瓊脂培養基分離釀酒酵母菌在實驗室中作菌株保存，本發明使用如下菌種：植物乳桿菌Lactobacillus plantarum（ATCC8014）、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae（IFO0203）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis （ACCC10623）；
b. 將分離的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養基中，同時添加0.5％比例的亞硒酸鈉，在30℃溫度下培養24小時，然后將釀酒酵母菌接種于由葡萄糖1g、氯化鉀1.8g、酵母浸膏2。5g、醋酸鈉8.2g、瓊脂15－20g、蒸餾水1000ml組成的麥氏（Meclary）瓊脂培養基中，枯草芽孢桿菌接種于由牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15－20g、水1000ml、pH7.0-7.2組成的營養瓊脂（LB培養基），植物乳桿菌接種于步驟a中的乳酸菌培養基中，進行劃線培養，選出生長快、菌體特征明顯的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，在實驗室中保存；
c. 生產制種：將步驟b的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別轉接入裝有營養瓊脂培養基的茄子瓶中，在30℃溫度下培養45小時，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出;然后放入4℃的冰箱中進行保存;
以上分離培養基在實驗室操作手冊中均可查到。
第二步：復合菌劑制作
a. 按以下重量配比稱取茄子瓶中各生產菌種：植物乳桿菌10％、釀酒酵母菌80％、枯草芽孢桿菌10％。
b. 將生產菌種混合，按培養基重量的4％比例添加在由糖蜜4%、蛋白胨0.8%、葡萄糖3%、氯化鈉0.5%、酵母膏2％、硫酸鎂0.05%、水89.65%組成的復合菌劑培養基中，ph值調節至7.0，放入容器中加溫至120℃進行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后發酵罐中發酵8小時，通氣量20L/小時，攪拌速度200rpm；
第三步：復合菌劑擴大和馴化培養
a.將復合菌劑按重量配比與炭源、氮源、無機鹽及誘導劑混合：復合菌劑
10％轉接入含有糖蜜4％（碳源）、豆餅粉2％（氮源）、磷酸氫二鉀0.4，磷酸二氫鉀0.2％（無機鹽）、亞硒酸鈉0.5％、水92.9％混合置入密閉罐中，加溫至120℃進行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后在發酵罐中發酵24小時，通氣量40L/小時，攪拌速度200rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補料，36L/小時，直至發酵結束；
b. 發酵過程中取樣三次，測定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4。
第四步：粉碎過篩
a. 將發酵液加入2%的硅藻土在115℃下噴霧干燥干燥2.5S，，干燥后的產品過80目篩，篩出的粗料再進行粉碎和過篩，
b.過篩后裝入包裝袋中，轉入成品庫有序堆放，通知品管部門取樣檢測，主要參數：水份≤12.0%、活菌數≥100億/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性狀：淡黃色粉末狀固體。
實施例2
第一步:菌種篩選和生產制種同實施例1相同；
第二步：復合菌劑制作
a. 按以下重量配比稱取茄子瓶中各生產菌種：植物乳桿菌8％、釀酒酵母菌80％、枯草芽孢桿菌12％。
b. 將生產菌種混合，按培養基重量的4％比例添加在由糖蜜5%、蛋白胨0.6%、葡萄糖3%、氯化鈉0.8%、酵母膏2.5％、硫酸鎂0.08%、水88.02%組成的復合菌劑培養基中，ph值調節至7.0，放入容器中加溫至121℃進行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后發酵罐中發酵8小時，通氣量25L/小時，攪拌速度180rpm；
第三步：復合菌劑擴大和馴化培養
a.將復合菌劑按重量配比與炭源、氮源、無機鹽及誘導劑混合：復合菌劑
15％轉接入含有糖蜜5％（碳源）、豆餅粉2.5％（氮源）、磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.25％（無機鹽）、亞硒酸鈉0.8％、水90.95％混合置入密閉罐中，加溫至121℃進行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后在發酵罐中發酵26小時，通氣量30L/小時，攪拌速度220rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補料，30L/小時，直至發酵結束；
b. 發酵過程中取樣三次，測定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4。
第四步：粉碎過篩
a. 將發酵液加入2%的硅藻土在118℃下噴霧干燥干燥2.5S，，干燥后的產品過80目篩，篩出的粗料再進行粉碎和過篩，
b.過篩后裝入包裝袋中，轉入成品庫有序堆放，通知品管部門取樣檢測，主要參數：水份≤12.0%、活菌數≥100億/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性狀：淡黃色粉末狀固體。
將實施例1和2中獲得添加劑使用時按200-400ppm比例添加到豬飼料中并攪拌均勻，然后測定相關指標。本產品使用在飼料中每日豬攝食量將明顯增加，測試血清中是SOD含量比對照提高了20%，MDA下降了10%以上，在上海農科院飼料研究開發中心進行的對比試驗中，添加200ppm本發明制備的產品，育肥豬日增重分別提高11.67%；飼料轉化率提高8.9%；胴體瘦肉率提高5.80%。可見,育肥豬日糧中添加本產品在促生長、提高瘦肉率、節約飼料等方面效果顯。
以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。