組培苗蔗糖利用率的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及組培苗蔗糖利用率的測定方法，屬于植物生物技術領域。 技術背景
[0002] 植物的組織培養是當前生物技術中的最基本的技術和手段，現已被廣泛應用到園 藝、農業和林業生產中。它是一種在人為提供的一定溫度、光照、濕度、營養、激素等條件下 快速繁育植物的技術。
[0003]在植物組織培養過程中，組培苗的生長方式有三種：一是小植株靠光合作用進行 的自養生長;二是小植株靠培養基中的有機碳源進行異養生長;三是小植株既靠培養基中 的有機碳源又靠人工光照，同時進行異養和自養的兼養生長。現在常規的植物組織培養快 繁技術大多數是以第三種方式進行。因此蔗糖成為組織培養過程中不可或缺的碳源和能 源，且在目前組織培養中用量最大。所以判斷組培過程中蔗糖的利用率為組培的培養基調 控提供了理論依據。同時組培苗的自養能力決定了組培苗生長的情況，僅異養生長的組培 苗，將會導致植株生理、形態上的紊亂，造成生長發育延緩或死亡，引起玻璃化、生根困難等 問題。由此可見，組培苗的自養作用是其良好地生長發育的基礎。
[0004] 因此，組培苗自養份額的測定和蔗糖利用率的測定就顯得特別重要，目前雖然有 用Li-840型C02/H 20分析儀建立的CO2交換速率測定系統來測定組培苗的自養能力，但是測 的只是瞬時的自養能力，不能代表一段時間內組培苗自養能力的情況，更不能測定出一段 時間內組培苗的自養份額和異養份額和來自組培苗呼吸所貢獻的份額。組培苗自養份額的 測定和蔗糖利用率的測定對培養基的優化具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是:提供一種組培苗在一個培養周期(例如增殖培養）中 各種份額的測定方法;結合組培苗的異養份額，計算出組培苗的蔗糖利用率。為組培過程中 各種環境因子的調控，培養基組成，激素配比等提供理論依據。
[0006] 本發明的技術方案：
[0007] 它包括以下步驟：
[0008] 第一，培養瓶采用完全透氣的封口膜封口，分別用C3植物蔗糖和C4植物蔗糖作為 有機碳源配制C3植物蔗糖培養基和C4植物蔗糖培養基；
[0009] 第二，測定上述C3植物蔗糖和C4植物蔗糖的S13C值，C3植物蔗糖的S13C值記為δ τ，〇4 植物蔗糖的S13C值記為Sc;
[0010] 第三，選取長勢一致的組培苗，記錄它們的鮮重Μ〇,分別接種到C4植物鹿糖培養基 和C3植物蔗糖培養基，培養至鮮重增重超20倍后，結束培養；
[0011] 第四，同期，一方面將待測植物的組培苗分別培養在無〇)2的03植物蔗糖培養基和 C4植物蔗糖培養基中；另一方面利用pH為5.5的營養液在待測環境中對長有2片展開葉的待 測植物進行溶液培養；
[0012] 第五，分別獲取培養前C4植物蔗糖和C3植物蔗糖培養基的蔗糖濃度CO和體積Vo，培 養結束后培養基的C4植物蔗糖和C3植物蔗糖濃度c和體積V，根據蔗糖濃度和體積的變化的 計算出鹿糖的消耗。鹿糖的消耗C = CO X VQ-C X V ;
[0013] 第六，測定培養結束后的組培苗鮮重M。計算出組培苗的增重為B=M-M0;
[0014]第七，獲取培養結束后的用C4植物蔗糖培養基和C3植物蔗糖培養基培養的組培苗 新生葉片的S13C值Sgi和δτ1;
[0015] 第八，獲取培養結束后的在無〇)2的03植物蔗糖培養基和C4植物蔗糖培養基中培 養的組培苗新生葉片的S 13C值δ?和δτο;
[0016] 第九，獲取培養結束后在溶液培養中的待測植物新生葉片S13C值Sair;
[0017] 第十，測定培養期間的待測培養環境中空氣中的二氧化碳S13C值
[0018] 第^^一，依據δ?和δτ〇以及δτ和6(；計算出待測植物的組培苗利用C4植物蔗糖和C3植 物鹿糖產生碳同位素分餾值Δ G和Δ τ，Δ G = 5G -δ?，Δ τ=δτ-δτο。
[0019] 第十二，依據Sair和33計算出待測植物利用空氣二氧化碳的分餾值Aair; Aair = Sa 5air;
[0020] 第十三，將上述所得數據，δτ、δ(；、Δ G、Δ T、Δ air、δα、δτ1、代入方程：
H十算出異養份額fb;
[0021] 第十四，根據上述計算得到的fb，結合組培苗的增重B和蔗糖消耗C，計算組培苗蔗 糖利用率A。鹿糖利用率A的計算公式為:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0022] 本發明的優點
[0023] 在植物組織培養過程中，組培苗通常是進行兼養生長，因此，就得額外提供蔗糖作 為有機碳源。蔗糖是培養過程中用量最大的營養物質，所以監測組培苗蔗糖利用率對節約 生產成本具有重要意義。穩定碳同位素可以示蹤營養源。因此，通過穩定碳同位素技術，就 可以計算出組培苗的自養和異養份額和來自組培苗呼吸所貢獻的份額;根據計算得到的組 培苗異養份額，結合組培苗的增重和蔗糖消耗，就可以計算出組培苗的蔗糖利用率。
[0024] 自然界中碳元素有兩種穩定同位素：12C和13C，它們的天然平均豐度分別為 98.89%和1.11 %。穩定碳同位素組成通常用δ13(Χ%。)表示，自然界中S13C的變化為_90%〇~ +20%〇 〇
[0025] 分別選用C3植物和C4植物的蔗糖作為有機碳源。C3植物S13C的變化范圍為-20%。~-35%。，C 4植物S13C的變化范圍為-9%。~-17%。X3植物的代表性蔗糖是甜菜蔗糖，C 4植物的代 表性蔗糖是甘蔗蔗糖。
[0026] 組培苗在生長過程中會利用有機碳源和無機碳源來生長，因此就會造成新生葉片 的S13C值既有來自有機碳源的組分(異養來源），又有來自無機碳源的組分（自養來源），其 中，自養份額包括組培苗自身呼吸作用的份額fc和來自利用空氣的份額fa，即fa= 1-fb- fCo
[0027] 因此，利用三端元的同位素混合模型就可獲取組培苗利用有機碳源的份額。
[0028]三端元的同位素混合模型可以表示為：
[0029] 6Gl = fb(5G- Δ G)+fc(SGl- Δ air) + ( l_fb_fc)5air ( I )
[0030] 5xi = fb(5x- Δ τ)+?〇(δτι- Δ air) + ( l_fb_fc)5air (2)
[0031] 這里的δα為甘蔗蔗糖作為碳源培養的新生組培苗葉片的S13C值;δη為甜菜蔗糖作 為碳源培養的新生組培苗葉片的S 13C值;Sair為待測植物以空氣二氧化碳為碳源培養的新生 葉片的S13C值;S g為甘蔗蔗糖的S13C值;δτ為甜菜蔗糖的S13C值；Ag為組培苗利用甘蔗蔗糖產 生的同位素分餾值。A τ為組培苗利用甜菜蔗糖產生的同位素分餾值。Aair為待測植物以空 氣二氧化碳為碳源培養產生的同位素分餾值。
[0032]聯立方程(1)和方程(2)，求解得到：
[0033]
[0034]
[0035] 根據計算得到的fb，結合組培苗的增重和蔗糖消耗，就可以計算出組培苗蔗糖利 用率A。鹿糖利用率的計算公式為:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0036] 本方法采用的步驟少，計算簡單，準確，能定量測定組培苗一個生長周期內的各種 份額，如自養份額、異養份額等，同時能計算出組培苗在一個培養周期內蔗糖利用率，對組 培環境因子的調控具有重要的指導價值，為后期組培苗的馴化和移栽提供技術參數。
【具體實施方式】
[0037]本發明的實施例：
[0038] 第一步驟，選用兩種S13C值差較大的C3植物的代表性蔗糖甜菜蔗糖和C4植物的代 表性蔗糖甘蔗蔗糖作為有機碳源，分別測定其S 13C值，甜菜蔗糖的S13C值記為δτ，甘蔗蔗糖的 S13C值記為Sc;用這兩種蔗糖同時培養被考察組培苗，培養條件完全一樣，區別在于一個是 以甜菜蔗糖為有機碳源，另一個是以甘蔗蔗糖為有機碳源。分別計算出培養前甘蔗蔗糖和 甜菜蔗糖培養基的蔗糖濃度(Co)和體積(Vo)，培養結束后測定培養基的甘蔗蔗糖和甜菜蔗 糖濃度(c)和體積(V)，根據蔗糖濃度和體積的變化的計算出蔗糖的消耗。蔗糖的消耗C = C0 Xv〇-c XV；
[0039] 第二步驟，選取長勢一致(鮮重為Mo)的組培苗分別培養在甜菜蔗糖和甘蔗蔗糖培 養基上，培養一個月后（增重20倍以上），測定其鮮重M。計算增重B = M-Mo。同時取一定量的 組培苗新生葉片，測定其穩定碳同位素組成S13C值。用甜菜蔗糖培養的組培苗新生葉片的 S13C值記為δτ1，用甘蔗蔗糖培養的組培苗新生葉片的S13C值記為S ci;
[0040] 第三步驟，同期將油菜組培苗分別培養在無 CO2氣體培養瓶內（用堿石灰吸收空氣 中的CO2和植物自身呼吸產生的CO 2)，分別用甜菜蔗糖和甘蔗蔗糖培養一個月，然后測定新 生葉片的S13C值。計算出油菜組培苗利用有機碳產生碳同位素分餾Δ (；和Δ τ，Δ G = SG - SG0， Δ T= δτ-δΤ()。在進行組培苗各份額計算時，扣除分餾值；
[0041] 第四步驟，在培養室萌發種子(種子與組培苗所用種子相同），待幼苗長出兩片子 葉后用PH為5.5霍格藍培養液培養植物，同期培養一個月后，取新生葉片，烘干，磨成粉末后 測定其S 13C值，記為Sair;同時測定培養室空氣中二氧化碳的S13C值，記為計算得到A air， A air - 5a-5air ;
[0042] 第五步驟，計算被考察組培苗在各培養條件下的有機碳利用份額，將甜菜蔗糖的 S13C值記為δτ，由甜菜蔗糖做為有機碳源的組培苗新生葉片的S13C值記為δη;將甘蔗蔗糖的 S13C值記為Sc，由甘蔗蔗糖做為有機碳源的組培苗新生葉片的S13C值記為S ci;用霍格藍培養 液培養植物的葉片的S13C值記為Sair和霍格藍培養液培養植物利用空氣二氧化碳產生的分 餾Δ air;油菜組培苗利用有機碳產生碳同位素分餾△ G和△ τ;帶入方程(3)和方程(4)，計算 出各個培養條件下組培苗利用有機碳源的份額，即異養份額。還可以計算得到組培苗利用 呼吸作用產生的二氧化碳的份額f。，同時還可得到組培苗利用空氣二氧化碳的份額f a;
[0043] 第六步驟，根據計算得到的fb，結合組培苗的增重和蔗糖消耗計算組培苗蔗糖利 用率(表征為字母A)。蔗糖利用率的計算公式為:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0044] 本發明的實施效果如下：
[0045] 培養材料:甘藍型油菜組培苗
[0046] 培養基配方為:13+6-8六2.〇11^/1+祖4 0.111^/1，其中進行不同氮源及氮濃度配比 實驗，其它實驗條件完全一致。pH值:5.8，瓊脂:7.5g/L，培養溫度:25 ± 2 °C。光周期：12h/d， 光照強度:30001x。
[0047] 分別用甘蔗蔗糖和甜菜蔗糖作為有機碳源，其穩定碳同位素值為：甘蔗蔗糖-12.00%〇(PDB)，甜菜蔗糖-24.64%q(PDB)。測定的待測植物新生葉片的S 13C值（Sair)為-35.97%。，培養室空氣CO2的S13C值隊)為-15.75%。，因此待測植物利用