一種白及種苗的組織培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及藥用植物組織培養技術領域，具體設及一種白及種苗的組織培養方 法。
【背景技術】
[0002] 白及(Bletillas化ia化(Thunb.)Reic^lb.f.)為蘭科白及屬多年生草本植物，亦稱 "白巧"，其塊莖是我國傳統的名貴中草藥，具有收斂止血，消腫生肌，清熱利濕的功效，通常 用于肺結核、咯血、肝癌、胃癌、十二指腸潰瘍、內外出血等疾病的治療;現代藥理學研究表 明白巧對結核桿菌、炎癥細胞等有明顯的抑制作用，具有代血漿、骨髓造血、延緩衰老、增加 機體免疫力等保健作用，其合成的大量超氧化物(SOD)還具有抗菌鎮痛和抗腫瘤活性(張永 為等，2012;王紅英，2009;王光輝等，2007 ; Jiangetal. 2007)。此外，白及還被廣泛用作飲 片、護膚美白化妝品、煙蒂膠、糊料、漿絲銅、漿紗、涂料等的工業原料和基因遞送的載體材 料，且白及花色艷麗，也是一種很好的園林花弁。運些廣泛用途，導致其市場需求急劇增加， 價格飛速上漲，前景十分廣闊。
[0003] 然而，市場的巨大需求致使野生白及幾乎被采挖殆盡，成為溯臨滅絕的名貴中藥 材，被國家列為重點保護的野生藥用植物之一，還被國際貿易公約(CUES)附錄二錄入加 W 保護，如何保護白及種質資源和為人工馴化栽培提供大量種苗是亟待解決的現實問題。通 過建立人工繁育的方法來保護白及野生資源和為大田的規模化種植提供大量種苗是中藥 材研究中被通常采用的行之有效的方法。由于白及的種子非常細小且無胚乳，在自然狀況 下很難萌發和生長，因而傳統繁育白及種苗的方法主要依靠分株繁殖，但分株繁殖周期長， 繁殖效率低，而且耗種量大，成本高，很難滿足規模化種植的需要。采用組織培養技術提高 白及種子萌發率，進而進行生根和壯苗培養誘導再生苗，是解決白及種質資源保護和快速 繁殖大量種苗最經濟、高效的方法。然而由于組培技術的操作繁瑣，耗時繁多，不僅增加了 勞動力成本，也增加了經濟成本，且在種苗的轉移過程中，種苗極易受到細菌的感染而降低 組培苗的成活率。故本發明目的是建立一套省時、省力獲取白及種苗的技術體系，為白及的 種質資源保護和種苗快繁奠定實驗基礎。
【發明內容】
[0004] 本發明針對上述存在的技術問題，本發明旨在建立一套效率高、省力的獲取白及 種苗的技術體系。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:一種白及種苗的組織培養方法，包括 W下步驟： 步驟一、培養基的配置:萌發培養基：1/2MS+NAA0.2mg/L+薦糖30g/L+瓊脂6gA;繼代培 養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+薦糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+1%。碳粉+8%香蕉+薦糖30g/L+瓊脂6g/l;調節所述萌發培養基、繼代培養基和生根 培養基的抑值為5.70~6.00，分別將S種培養基轉移至濕熱高壓滅菌鍋內，進行加熱加壓 滅菌，加熱溫度為12rC，壓力為O. I~1.0 MPa，滅菌20min后備用； 步驟二、準備紙膜或無紡布:將紙膜或無紡布剪切成<9X9cm的圓片或方塊，12rC滅 菌后備用； 步驟=、白及葫果的準備:在無菌環境中將成熟、完整、無霉變的白及葫果用濃度75%的 酒精浸泡25~35s后，用無菌水清洗2~4次，再用濃度0.1 %的升隸浸泡15~25min，無菌水 清洗3~7次； 步驟四、準備培養皿:準備=個無菌的空培養皿，分別標注一號培養皿、二號培養皿和 =號培養皿;將步驟一的萌發培養基轉移至一號培養皿中，在萌發培養基表面平鋪步驟二 制備的紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中；生根培養基轉移至=號培養皿 中； 步驟五、接種:培養皿準備完成1~5min后，使用無菌處理后的剪刀，將步驟S的白及葫 果剪開獲得白及種子，將白及種子均勻播種在步驟四的一號培養皿中，利用封口膠封住一 號培養皿，在24 ± rC的光照條件下培養25~35d; 步驟六、萌發培養:步驟五的培養期滿后，白及種子萌發得到組培苗，使用無菌處理的 綴子夾持一號培養皿中的紙膜或無紡布，將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至二號培養 皿中，在24 ± rc的光照條件下培養； 步驟屯、繼代培養:待二號培養皿中白及種子萌發至組培苗長度>2cm后，使用無菌處 理的綴子夾持二號培養皿中紙膜或無紡布，將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至=號培 養皿中，在24 ± rc的光照條件下培養； 步驟八、待組培苗生長至長度5~6cm后，進行煉苗后獲得種苗，將種苗移栽即可。
[0006] 本發明的有益效果為：（1)本發明相對現有技術效率高、勞動量小。因為在培養皿 中培養基的表面添加紙膜或無紡布后，整個培養過程的轉接中只需要將整個紙膜或無紡布 轉入，所有的白及種子或組培苗也隨之同時轉入新培養基中，運省去了大量的轉接時間，大 大的減少了勞動量，降低了生產成本，尤其是不需要復雜的儀器與技術，不需要改變一貫的 培養條件；（2)本方法培養的組培苗生長勢態良好。與未添加紙膜或無紡布的培養基上的白 及相比:在萌發階段，萌發時間和萌發率無顯著性差異，均能達到100%;在繼代階段，在紙膜 或無紡布上的白及生長旺盛，根系更發達；同時轉入生根培養基中，紙膜或無紡布上生長的 白及苗更加的粗壯。
[0007] 進一步，本發明方案步驟五中在24± TC的光照條件下培養30d，獲得的組培苗根 系更發達健壯，成活率更高。
【附圖說明】
[0008] 圖1為實施例1中白及組培苗的繁育過程圖； 圖2為對比例1的白及組培苗的繁育過程圖。
【具體實施方式】
[0009] 下面結合附圖和實施例對本發明技術方案進一步說明： 附圖標記:本發明接種狀態曰1、本發明萌發狀態曰2、本發明萌發培養狀態曰3、本發明繼 代培養狀態曰4、本發明生根狀態曰5、對比例接種狀態bl、對比例萌發狀態b2、對比例萌發培 養狀態b3、對比例繼代培養狀態b4、對比例生根狀態b5。
[0010] 實施例1: 一種白及種苗的組織培養方法，包括W下步驟： 步驟一、培養基的配置:萌發培養基：1/2MS+NAA0.2mg/L+薦糖30g/L+瓊脂6gA;繼代培 養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+薦糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+1%。碳粉+8%香蕉+薦糖30g/L+瓊脂6g/l;調節所述萌發培養基、繼代培養基和生根 培養基的抑值為5.70~6.00，分別將S種培養基轉移至濕熱高壓滅菌鍋內，進行加熱加壓 滅菌，加熱溫度為12rC，壓力為0.1~1. OMPa，滅菌20min后備用； 步驟二、準備紙膜或無紡布:將無紡布剪切成<9X9cm的圓片或方塊，12rC滅菌后備 用； 步驟=、白及葫果的準備:在無菌環境中將成熟、完整、無霉變的白及葫果用濃度75%的 酒精浸泡30s后，用無菌水清洗2次，再用濃度0.1 %的升隸浸泡20min，無菌水清洗5次； 步驟四、準備培養皿:準備=個空的培養皿，分別標注一號培養皿、二號培養皿和=號 培養皿;將步驟一的繼代培養基轉移至一號培養皿中，在繼代培養基表面平鋪步驟二制備 的紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中；將生根培養基轉移至=號培養皿中； 步驟五、接種:培養皿準備完成1~5min后，紙膜或無紡布吸滿水分，使用無菌處理后的 剪刀，將步驟=的白及葫果剪開獲得白及種子，將白及種子均勻播種在步驟四的一號培養 皿中，利用封口膠封住一號培養皿，在24 ± TC的光照條件下培養30d; 步驟六、萌發培養:步驟五的培養期滿后，白及種子萌發得到組培苗，使用無菌處理的 綴子夾持一號培養皿中紙膜或無紡布，將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至二號培養皿 中，在24 ± rc的光照條件下培養； 步驟屯、繼代培養:待二號培養皿中白及種子萌發至組培苗長度>2cm后，使用無菌處 理的綴子夾持二號培養皿中紙膜或無紡布，將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至=號培 養皿中，在24 ± rc的光照條件下培養； 步驟八、待組培苗生長至長度5~6cm后，進行煉苗后獲得種苗，將種苗移栽即可。
[0011] 實施例2: -種白及種苗的組織培養方法，包括W下步驟： 步驟一、培養基的配置:萌發培養基：1/2MS+NAA0.2mg/L+薦糖30g/L+瓊脂6gA;繼代培 養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+薦糖30g/L+瓊脂6g/