一種松材線蟲的快速制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于線蟲制備技術領域，尤其涉及一種松材線蟲的快速制備方法。
【背景技術】
[0002]我國于1982年在南京中山陵首次發現松材線蟲病，此后，該病在我國境內迅速擴散蔓延，危害日趨嚴重，現已在江蘇、浙江、安徽、福建、江西、山東、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、重慶、四川、貴州、陜西、香港及臺灣等地區發生，發生面積達8.7萬公頃，累計致死松樹3，500多萬株，因松材線蟲病造成的直接經濟損失已達25億元，間接損失達250億，使我國的松木資源、自然景觀和生態環境遭受嚴重影響。
【發明內容】
[0003]本發明就是針對上述問題，提供一種靈敏、快速的松材線蟲的快速制備方法。
[0004]為實現上述目的，本發明包括以下步驟。
[0005](I)將葡萄孢接種于PDA培養基上，25°C恒溫培養箱中培養7天，待氣生菌絲基本長滿培養皿時接種松材線蟲，每皿接種約200頭線蟲。將接種后的培養皿置25°C恒溫培養箱中培養10-14天，待菌絲基本被線蟲消耗完后，置于4°C儲存備用。
[0006](2)松材線蟲的分離采用貝爾曼漏斗分離法；其裝置是將直徑10-15cm的玻璃漏斗架在鐵架上，下面接一段約1cm的橡皮管，在橡皮管末端接一個1.5ml離心管，橡皮管上裝一個彈簧夾；在漏斗內放一個用細銅紗制成的漏斗狀網篩，將面巾紙或濾紙裁剪好后放置到漏斗狀網篩上，用蒸餾水浸濕濾紙，然后將待分離的培養基材料切碎放置到濾紙上；加水淹沒待分離培養基材料，靜止分離24h ;由于趨水性和自身的重量，線蟲就離開培養基材料，沉降到漏斗底部的離心管中；關閉彈簧夾，取下離心管，將管中收集到的線蟲轉移至另一離心管中，備用。
[0007](3)將收集到的松材線蟲及蟲卵進行消毒處理。
[0008]作為一種優選方案，本發明所述消毒處理方法包括以下步驟。
[0009]I)收集到的松材線蟲分別用無菌的M9溶液洗滌，離心Imin。
[0010]2)用1%的硫柳萊溶液消毒，無菌水洗滌3次。
[0011]3)用硫酸鏈霉素和放線菌酮，4°C消毒過夜。
[0012]4)無菌水沖洗后回接到長到半皿的灰葡萄孢菌上，培養1-2天，時刻觀察，待有少量蟲卵產生時，無菌水沖洗收集線蟲。
[0013]5)將重新收集的線蟲用無菌的M9溶液洗滌，離心lmin。
[0014]6)重復步驟2)。
[0015]7)將6)中消毒的線蟲放在裝有無菌的生理鹽水的培養皿中，25°C生化培養箱中培養，待大量蟲卵產生后收集蟲卵。
[0016]8)用無菌水沖洗培養皿，直至線蟲去除干凈，只剩皿底的蟲卵。
[0017]9 )用吐溫和NaOH溶液收集蟲卵。
[0018]10)無菌水沖洗。
[0019]11)將部分蟲卵置于NA培養基上，檢測消毒情況，其余的蟲卵接種到長滿灰葡萄孢的斜面上。
[0020]作為另一種優選方案，所述消毒處理方法包括以下步驟。
[0021 ] I)收集到的松材線蟲分別用無菌的M9溶液洗滌3-4次，3000rpm離心lmin。
[0022]2)用1%的硫柳萊溶液消毒30min，無菌水洗滌3次。
[0023]3)用0.1%的硫酸鏈霉素和0.02%的放線菌酮，4°C消毒過夜。
[0024]4)無菌水沖洗3次后回接到長到半皿的灰葡萄孢菌上，培養1-2天，時刻觀察，待有少量蟲卵產生時，無菌水沖洗收集線蟲。
[0025]5)將重新收集的線蟲用無菌的M9溶液洗滌3-4次，3000rpm離心lmin。
[0026]6)重復步驟2)。
[0027]7)將6)中消毒的線蟲放在裝有無菌的0.9%的生理鹽水的培養皿中，25°C生化培養箱中培養12_24h，待大量蟲卵產生后收集蟲卵。
[0028]8)用無菌水沖洗培養皿，直至線蟲去除干凈，只剩皿底的蟲卵。
[0029]9 )用0.05%的吐溫和8mM的NaOH溶液收集蟲卵。
[0030]10)無菌水沖洗5次。
[0031]11)將部分蟲卵置于NA培養基上，檢測消毒情況，其余的蟲卵接種到長滿灰葡萄孢的斜面上。
[0032]本發明有益效果。
[0033]本實驗采用PCR方法檢測消毒效果可彌補傳統培養方法的缺點，結合對線蟲和蟲卵進行多步消毒的方法，建立了獲得無菌線蟲的技術。與傳統培養檢測的方法相比，PCR方法檢測細菌污染更靈敏更快速。
【具體實施方式】
[0034]本發明包括以下步驟。
[0035](I)將葡萄孢接種于PDA培養基上，25°C恒溫培養箱中培養7天，待氣生菌絲基本長滿培養皿時接種松材線蟲，每皿接種約200頭線蟲。將接種后的培養皿置25°C恒溫培養箱中培養10-14天，待菌絲基本被線蟲消耗完后，置于4°C儲存備用。
[0036](2)松材線蟲的分離采用貝爾曼漏斗分離法。其裝置是將直徑10_15cm的玻璃漏斗架在鐵架上，下面接一段約1cm的橡皮管，在橡皮管末端接一個1.5ml離心管，橡皮管上裝一個彈簧夾。在漏斗內放一個用細銅紗制成的漏斗狀網篩，將面巾紙或濾紙裁剪好后放置到漏斗狀網篩上，用蒸餾水浸濕濾紙，然后將待分離的培養基材料切碎放置到濾紙上。加水淹沒待分離培養基材料，靜止分離24h。由于趨水性和自身的重量，線蟲就離開培養基材料，沉降到漏斗底部的離心管中。關閉彈簧夾，取下離心管，將管中收集到的線蟲轉移至另一離心管中，備用。
[0037](3)將收集到的松材線蟲及蟲卵進行消毒處理。
[0038]所述消毒處理方法包括以下步驟。
[0039]I)收集到的松材線蟲分別用無菌的M9溶液洗滌，離心lmin。
[0040]2)用1%的硫柳萊溶液消毒，無菌水洗滌3次。
[0041]3)用硫酸鏈霉素和放線菌酮，4°C消毒過夜。
[0042]4)無菌水沖洗后回接到長到半皿的灰葡萄孢菌上，培養1-2天，時刻觀察，待有少量蟲卵產生時，無菌水沖洗收集線蟲。
[0043]5)將重新收集的線蟲用無菌的M9溶液洗滌，離心lmin。
[0044]6)重復步驟2)。
[0045]7)將6)中消毒的線蟲放在裝有無菌的生理鹽水的培養皿中，25°C生化培養箱中培養，待大量蟲卵產生后收集蟲卵。
[0046]8)用無菌水