一種鐵皮石斛組培接種方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物生物工程技術領域，具體涉及一種鐵皮石斛組培接種方法。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科石斛屬多年生草本植物，野生鐵皮石斛主要分布在浙江、安徽、江西、廣西等地。鐵皮石斛的種子構造獨特，無胚乳，自然繁育率極低，加之人們對野生資源的瘋狂采挖，野生鐵皮石斛資源已經瀕臨滅絕。隨著現代生物組培技術的發展，現在鐵皮石斛種苗的人工繁育技術已經逐漸成熟。目前工廠化的鐵皮石斛種苗繁育，一般采用鐵皮石斛果莢為種源，經過人工播種培養基，令種胚萌發后，經過瓢種、單苗轉接、壯苗、生根四個階段約8-10個月的培養即可得到鐵皮石斛成品組培苗。在單苗轉接、壯苗、生根三個階段轉接過程中，需要人工用接種鑷子將種苗一一頻繁轉接到新的培養基中，在轉接過程中需要耗費大量的勞動力和原料，工序繁瑣、效率低下，導致生產成本居高不下。另外在轉接過程中，如果力度控制不當，在夾取幼苗時會造成苗體物理損傷，導致苗體生長緩慢、葉片黃化、整體失綠死亡等情況，嚴重影響種苗的成活率。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術的不足，提供一種簡單、高效的的鐵皮石斛組培接種方法。
[0004]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種鐵皮石斛組培接種方法，包括以下步驟:
1)鐵皮石斛果莢的選擇:選擇露天仿野生栽培3-6年生的鐵皮石斛所結并生長110-130天所形成的成熟未開裂果莢；
2)種胚播種:將鐵皮石斛果莢在超凈工作臺上經質量百分比濃度為65-75%的酒精消毒12-15 min后，再將果莢內的種胚播種到無菌燒杯中；
3)無菌種胚混合液的制備:在步驟2)的無菌燒杯中加入無菌水并攪拌，將種胚分散在無菌水中，分散度為60-100個/mL，得到無菌種胚混合液；
4)萌發生根培養基的配制:以1/2MS培養基作為基礎培養基，以該基礎培養基的體積計，向該基礎培養基中添加下列添加物:萘乙酸0.7-0.9 mg/L、活性炭0.2-0.5 g/L、6-芐氨基腺嘌呤0.05-0.2 mg/L、椰汁50-80 g/L、去皮香蕉30-50 g/L、大米20-30 g/L、蔗糖25-35g/L和瓊脂5.8-6.3 g/L，得到萌發生根培養基，并將該萌發生根培養基的pH值調至6.0?
6.2，之后將配制的萌發生根培養基分裝到帶透氣孔的650 mL組培瓶中，每個組培瓶的灌液深度為3-4 cm，然后將各個組培瓶在高壓滅菌鍋內于121 °C滅菌20-23 min，冷卻后備用；
5)種胚的接種與培養:將無菌種胚混合液用無菌移液器接種到萌發生根培養基中，每個組培瓶的接種量為800-1000 yL，再用無菌涂布棒涂平，將組培瓶的瓶蓋旋緊，接種完成；之后將各個組培瓶于22-24 °(:下暗處理5-7天，然后在每日光照強度為1200-1500 Lux、光照時間為10-11 h的培養環境下培養30-40天，最后在每日光照強度為2500-3000 Lux、光照時間為12-13 h的培養環境下培養若干天，直至種胚萌發并得到鐵皮石斛組培苗。
[0005]MS基礎培養基是目前使用最普遍的培養基，其組成包括大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分、肌醇等等，1/2MS基礎培養基即大量元素變為原來的1/2的培養基，可以自制或者選擇市售產品。
[0006]優選地，步驟3)中，種胚的分散度的確定方法為:用移液槍移取ImL無菌種胚混合液，用無菌水稀釋10倍后，對種胚進行計數，確定其分散度，若分散度不滿足60-100個/mL的要求，則向無菌燒杯中補充種胚或無菌水，直至分散度滿足要求。
[0007]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明鐵皮石斛組培接種方法，是一種簡單、高效的組培接種方法，該方法經過一次誘導萌發生根培養基接種于培養種胚，不需要進行反復的轉接，并且本發明方法配制的萌發生根培養基以天然抑菌添加物為主，無有害化學成分添加，從而能夠有效解決傳統人工逐顆接種調試時間長、工作量大、污染率高、生產出的種苗穩定性差的問題，本發明方法可大幅降低鐵皮石斛組培過程中的污染率，降低鐵皮石斛的組培成本;本發明鐵皮石斛組培接種方法使鐵皮石斛組培接種效率和移栽成活率大幅提尚，生廣效率是傳統方法的3_4倍，移栽成活率可達92-93%以上。
【具體實施方式】
[0008]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0009]實施例1的鐵皮石斛組培接種方法，包括以下步驟:
1)鐵皮石斛果莢的選擇:選擇露天仿野生栽培3年生的鐵皮石斛所結并生長110天所形成的成熟未開裂果莢；
2)種胚播種:將鐵皮石斛果莢在超凈工作臺上經質量百分比濃度為65%的酒精消毒12min后，再將果莢內的種胚播種到無菌燒杯中；
3)無菌種胚混合液的制備:在步驟2)的無菌燒杯中加入無菌水并攪拌，將種胚分散在無菌水中，分散度為60-70個/mL，得到無菌種胚混合液；
4)萌發生根培養基的配制:以1/2MS培養基作為基礎培養基，以該基礎培養基的體積計，向該基礎培養基中添加下列添加物:萘乙酸(NAA) 0.75 11^/1、活性炭0.3 g/L、6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) 0.08 mg/L、椰汁50 g/L、去皮香蕉35 g/L、大米22 g/L、蔗糖25 g/L和瓊脂5.8 g/L，得到萌發生根培養基，并將該萌發生根培養基的pH值調至6.0，之后將配制的萌發生根培養基分裝到帶透氣孔的650 mL組培瓶中，每個組培瓶的灌液深度為3 cm，然后將各個組培瓶在高壓滅菌鍋內于121 °C滅菌20 min，冷卻后備用；
5)種胚的接種與培養:將無菌種胚混合液用無菌移液器接種到萌發生根培養基中，每個組培瓶的接種量為800 yL，再用無菌涂布棒涂平，將組培瓶的瓶蓋旋緊，接種完成;之后將各個組培瓶于22 °(:下暗處理5天，然后在每日光照強度為1200-1500 Lux、光照時間為10-11 h的培養環境下培養30天，最后在每日光照強度為2500-3000 Lux、光照時間為12-13h的培養環境下培養130天后，得到鐵皮石斛組培苗，組培苗分布均勻、苗體健壯，移栽成活率為92.3 %，變異率為零。
[0010]實施例2的鐵皮石斛組培接種方法，包括以下步驟:
I)鐵皮石斛果莢的選擇:選擇露天仿野生栽培5年生的鐵皮石斛所結并生長120天所形成的成熟未開裂果莢； 2)種胚播種:將鐵皮石斛果莢在超凈工作臺上經質量百分比濃度為70%的酒精消毒14min后，再將果莢內的種胚播種到無菌燒杯中；
3)無菌種胚混合液的制備:在步驟2)的