三葉青側枝誘導的種苗培育方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種Ξ葉青側枝誘導的種苗培育方法，屬于組織培養植物再生技術領 域。
【背景技術】
[0002] Ξ葉青是民間常用藥，塊根或全草可W入藥，可用于治療高熱驚厥、肺炎、哮喘、肝 炎、腎炎、風濕搏痛、跌打損傷、癡療瘡巧、濕疹、蛇傷等（國家中醫藥管理局（中華本草)編委 會（1999)中華本草，上海科學技術出版社）。《本草綱目》記載"Ξ葉崖爬藤，性味苦、辛、涼， 清熱解毒、活血桂風"；《植物名實圖考》記載"蛇附子可治小兒高熱、止腹痛、取漿沖服"；《浙 江民間常用草藥》記載"治小兒風熱，驚風和痛氣痛;治蛇咬"；《江西草藥》記載"治小兒高熱 驚厥，肺炎，肝炎，外傷出血"等等。近年來在現代藥理學、化學成分等方面取得了一些進展， 本文對Ξ葉青的化學成分、藥理作用、臨床應用及生物工程等研究現狀進行較為系統的闡 述，為研究者提供借鑒。
[0003] 在S葉青的栽培技術方面，Dai等化ffects of shade treatments on the photosynthetic c曰p曰city,chlorophyll fluorescence,曰nd chlorophyll content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.Environmental and Experimental Botany， 65,177-182)將Ξ葉青在強、中、弱光照條件下培養一個月后，通過觀察葉片形態、凈光合速 率及葉綠素巧光反應，發現遮光率低于50%會降低Ξ葉青光合活性而高于75%則限制碳同 化作用，都會抑制植物生長，對于Ξ葉青培養，約67%的遮光率才是最適合的光照條件;牟 豪杰和董愛蘭(CN 101822166A)提供了一套Ξ葉青人工栽培的實施步驟，從選擇種植地、種 植時間、繁殖材料類型，到施肥、追肥、使用遮蔭棚，到最后的采收等都進行了優化選擇;吉 慶勇（Ξ葉青桿插繁殖技術研究，現代中藥研究與實踐，2,12-14)根據生根劑用量、插穗年 齡和基質對插穗生根的影響進行了研究，發現2~3年生老枝用lOOOmg/L IBA溶液浸潰10s 后桿插于黃±中生根效果最佳;吉慶勇（CN 102919013A)發明了一種高效仿野生栽培技術 方法，與人工栽培不同的是，增加了滴灌設備、微生物菌肥，并引導Ξ葉青上架進行立體種 植。傅婷婷(Ξ葉青總黃酬的提取及純化工藝研究，碩±論文，浙江大學)對Ξ葉青總黃酬提 取及純化工藝進行研究，利用紫外/可見分光光度法建立了總黃酬含量測定方法，利用大孔 吸附樹脂法優化了其純化條件。嚴余明（不同工藝Ξ葉青制劑對人肺癌A549裸鼠移植瘤生長 抑制作用比較研究，浙江中醫雜志，8,604-606)通過Ξ種不同工藝制得的Ξ葉青藥劑(凍干 粉、水煎劑、飲片粉)灌喂人肺癌A549移植瘤裸鼠，測定其腫瘤生長動態體積和抑瘤率，發現 Ξ葉青凍干粉和飲片粉抗人肺癌A 549裸鼠移植瘤的作用強于水煎劑，而凍干粉發揮抑瘤 效果的時間要早于飲片粉。顯而易見，Ξ葉青的栽培和加工工藝的研究比較滯后，需要進一 步加大投入研究力度，提高Ξ葉青的種植和加工工藝水平。
[0004] 目前，Ξ葉青生物工程主要設及組織培養。錢麗華(藥用植物"Ξ葉青"的組培快繁 技術研究，杭州農業科技，6,22-23) 葉青蔽芽為材料，進行了蔽芽外植體誘導技術、不 定芽繼代增殖技術及試管苗生根技術研究，實現了其離體快速繁殖，并發現23μπιο1 . πΓ2 · s^i的光照強度有利于蔽芽的萌發;鐘銃倩(Ξ葉青的組織培養與快速繁殖研究，浙江中醫雜 志，6,363)用Ξ葉青的莖尖、帶蔽芽的莖段和葉片為外植體，研究發現最佳誘導外植體為莖 尖；Jiang W.Μ.等（High-frequency shoot regeneration of nodal explants from Tetrastigma hemsleyanum Diels et GiIg：Avaluable medicinal plant.African Journal of Biotechnology, 10,12177-12181)用Ξ葉青的帶蔽芽的莖段為外植體，通過對 外植體的選取與處理、誘導培養、增殖培養、生根培養、移栽等步驟建立了一套組培快繁體 系；盧愛芳等ΓΞ葉青愈傷組織培養及其總黃酬含量的研究"，中藥材，7，1042-1045)ΚΞ 葉青葉片、莖段和無菌苗葉片為外植體，誘導形成愈傷組織，并對其中兩種愈傷組織、葉片、 塊根中的總黃酬含量進行測定，發現總黃酬在愈傷組織中含量較高;彭昕Γ正交法優化Ξ 葉青繼代增殖與生根培養的條件"，現代中藥研究與實踐，2,10-12)等用Ξ葉青的幼嫩帶芽 莖段為外植體，通過正交試驗對其蔽芽增殖、生根培養條件進行優化，得出最適培養基。
[0005] 上述培育方法通常是ΚΞ葉青的芽、葉片、根莖等作為培養對象，其優勢在于生長 快，但所培養的植物苗弱，環境適應性差，尤其是在轉移栽培過程中，成活率較低，并不利于 Ξ葉青的培養。
[0006] 基于此，做出本申請。
【發明內容】
[0007] 為了克服現有Ξ葉青培養所存在的上述缺陷，本發明提供一種培養快捷、成活率 高、苗壯、環境適應性強的Ξ葉青側枝誘導的種苗培養方法。
[0008] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下：
[0009] Ξ葉青側枝誘導的種苗培養方法，ΚΞ葉青帶蔽芽的莖段作為處理對象，進行如 下操作：（1)無菌材料:剪取Ξ葉青帶蔽芽的莖段，清洗得到無菌材料；（2)培養基：WMS或1/ 2MS作為基礎培養基，添加生長素或/和細胞分裂素，分別得到初代培養基、繼代培養基和生 根培養基，初代培養基、繼代培養基與生根培養基中薦糖含量不同；（3)初代培養:將步驟 (1)中的無菌材料接種到初代培養基上，并露出蔽芽，培養30-45天，得到初代無菌苗，側枝 發達；（4)繼代增殖培養:將初代無菌苗側枝分離，剪取帶蔽芽和3-6片葉片的側枝，轉接于 繼代培養基中增殖培養，誘導側枝生長，得繼代苗：（5)壯苗生根培育:繼代苗分離并轉入MS 培養基中，進行壯苗培養30天后，進入生根培養基，培養10-20天，得生根無菌苗；（6)馴化： 將生根無菌苗移至人工氣候室，加水至高于培養基表面，光照馴化培養3-5天；（7)移栽:將 賠石:草炭±安裝2:1的質量比混合，高壓滅菌后作為基質，將馴化后的苗洗去培養基，在僅 保留頂端葉片的情況下移在基質中，即完成Ξ葉青的培養。
[0010] 進一步的，作為優選：
[0011] 步驟(1)中，所選取的Ξ葉青莖段是現在人工氣候室中培養15-30天后所剪取的新 抽出枝條上半木質化的帶蔽芽莖段，與常規直接剪取野外Ξ葉青枝條相比，預先培養，有利 于Ξ葉青的緩沖培養，大大減少污染率;所述的清洗是指:將剪取的Ξ葉青帶蔽芽的莖段流 水沖洗1-2小時，洗潔精清洗3-5分鐘（添加一滴洗潔精，去除外植體表面張力，有利于除 菌），再依次采用無菌水一道清洗、70%乙醇清洗20-30秒，無菌水二道清洗、升隸滅菌8-10 分鐘，無菌水Ξ道清洗4-5次。
[0012] 步驟(2)中，所述的初代培養基和繼代培養基中，薦糖質量百分比為2.5-3%;生根 培養基中，薦糖質量百分數為1.5-2% ;環境條件:光照時間16小時，光照強度2000LUX，溫度 26±2°C。
[001 引步驟(3)中，初代培養基組成為：（1/2-1 )MS+( 1-1.5mg/L)她A+(0-0.5mg/L)NAA。
[0014] 步驟（4)中，所述的繼代培養基的組成為：（1/2-1)15+(1-1.5111旨幾）684+(0- 0.025mg/L)GA+0.025mg/L NAA。
[0015] 步驟(5)中，壯苗培養采用純MS培養基;生根培養基的組成為l/2MS+(0.5-1.5mg/ L)IBA或l/2MS+(0.5-1.5mg/L)NAA。
[0016] 本申請中，草炭±是指炭±有機質含量在30% W上，比重0.7-1.05，呈棟色或黑 色，pH值一般為5.5~6.5，呈微酸性反應，呈層狀分布。
【附圖說明】
[0017] 圖1-1為第一種配方條件下莖尖較嫩蔽芽誘導長大的無菌苗；
[0018] 圖1-2為第一種配方條件下半木質化莖段的蔽芽誘導長大的無菌苗；
[0019] 圖1-3為第二種配方條件下莖尖較嫩蔽芽誘導長大的無菌苗；
[0020] 圖1-4為第二種配方條件下半木質化莖段的蔽芽誘導長大的無菌苗；
[0021 ]圖1-5為第Ξ種配方條件下莖尖較嫩蔽芽誘導長大的無菌苗；
[0022] 圖1-6為第Ξ種配方條件下半木質化莖段的蔽芽誘導長大的無菌苗；
[0023] 圖2-1為繼代母株；
[0024] 圖2-2為分離得到的繼代子株；
[00巧]圖2-3為繼代增殖苗；
[00%] 圖3-1為生根苗；
[0027]圖3-2為生根培養15天時的生根狀態；
[00%]圖3-3為生根培養30天時的生根狀態。