淋巴細胞的凍存方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于外周血或臍帶血分離的淋巴細胞的凍存方法。
【背景技術】
[0002]淋巴細胞作為一種效應細胞，廣泛存在于人外周血液、骨髓或人臍帶血中。高純度的淋巴細胞的獲取對于疾病的細胞學診斷、成分輸血、治療用細胞產品的制備等具有非常重要的意義。在臨床應用過程中，常見的問題是很難保證提供足夠數量的淋巴細胞。針對該問題目前常用的做法是，利用低溫凍存技術保存外周血或臍帶血個細胞，在需要時復蘇并誘導培養為各種免疫細胞。但凍存過程會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環境，同時伴隨生物性損傷的危險。
[0003]為了將凍存過程中細胞的損傷降至最低，使細胞復蘇時存活率最高，最佳的冷凍條件是盡可能地降低細胞內的晶體形成，減少細胞內水凝固所形成的高濃度溶質對細胞造成的低溫損傷。因此需要采取緩慢冷凍、加入冷凍保護劑排除水分、在盡可能低的溫度下保存細胞、快速復蘇等方法來達到對細胞產生最低損傷的目的，其中冷凍保護劑的作用十分重要。常用的冷凍保護劑主要有甘油、二甲基亞砜(DMSO)等滲透性試劑，以及羥乙基淀粉(HES)、白蛋白和聚乙二醇(PEG)等非滲透性試劑，目前常用的是DMSO。
[0004]現有技術中，細胞凍存復蘇后的存活率通常在70%_90%之間。細胞凍存復蘇后的存活率可能會受到細胞采集、分離、凍存等過程的影響。因此，為提供足夠量的淋巴細胞，現有技術中細胞凍存復蘇后的存活率仍需進一步提高，同時也應避免回輸給患者時出現惡心、嘔吐或過敏等不良反應，提尚安全性。
[0005]因此，有必要提供一種能夠有效提高細胞凍存復蘇后的存活率、提高回輸到患者的細胞的安全性的凍存方法。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種能夠有效提高細胞凍存復蘇后的存活率、提高回輸到患者的細胞的安全性的淋巴細胞的凍存方法。
[0007]為解決上述技術問題，本發明提供技術方案如下:
[0008]—方面，提供一種淋巴細胞的凍存方法，包括如下步驟:
[0009]I)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨的分離液加入到離心管中；
[0010]2)將抗凝劑處理過的外周血或臍帶血中加入等體積的生理鹽水或無血清培養基稀釋后平鋪在所述分離液上，在8-25°C，200g-800g，10?30min條件下離心，吸取上層血漿備用，吸取白膜層細胞獲得淋巴細胞；
[0011]3)配制凍存液:將12%DMS0+10%右旋糖酐+18%所述上層血漿+1 %海藻糖+59%注射用生理鹽水混合作為凍存液；
[0012]4)將所述淋巴細胞與所述凍存液按0.9?1.1:1的比例混勻，分裝于細胞凍存管中；
[0013]5)將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉入液氮中凍存。
[0014]本發明中涉及的全部原料均符合靜注級原料藥標準，原料不確定性小，安全性高；本發明使用的分離液包含海藻糖、超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨，海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構成的非還原性糖，對多種生物活性物質具有非特異性保護作用，對單個核細胞起到一定的保護作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強陽離子聚電解質有助于紅細胞的沉淀;利用本發明的分離液對血液樣品進行離心處理后，淋巴細胞與單核細胞將在分離介質和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細胞條帶，而紅細胞、粒細胞等其他細胞在離心力及本發明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質層;本發明使用的分離液凍存方法首先從分離單個細胞開始，并將上層血漿作為凍存液的一部分，右旋糖酐作為替代血漿，減少免疫反應，使用DMS0、海藻糖降低低溫對細胞的傷害，而且分離液的組分與凍存液組分部分接近，進一步減少外源物質對細胞的傷害，提尚安全性。
[0015]進一步地，所述淋巴細胞與所述凍存液的按1:1的比例混勻。
[0016]進一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標準的右旋糖酐2?4重量份，海藻糖5?7重量份，超低粘度海藻酸鈉0.5?I重量份，泛影葡胺3?5重量份，聚二烯丙基二甲基氣化錢0.04?0.1重量份，L-繳氛酸0.008-0.01重量份和L-殼氛酸0.009-0.012重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0017]本發明分離液中的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品;海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構成的非還原性糖，對多種生物活性物質具有非特異性保護作用，對單個核細胞起到一定的保護作用；超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強陽離子聚電解質有助于紅細胞的沉淀;L-纈氨酸、L-亮氨酸在保持淋巴細胞活性的基礎上對提高分離淋巴細胞分離率也具有一定的幫助;本發明的分離液對于獲得高純度的淋巴細胞具有重要意義;本發明配方中的全部原料均符合靜注級原料藥標準，原料不確定性小，安全性高。
[0018]進一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標準的右旋糖酐2.5?3.5重量份，海藻糖5.5?6.5重量份，超低粘度海藻酸鈉0.6?0.9重量份，泛影葡胺3.5?4.5重量份，聚二稀丙基二甲基氯化錢0.06?0.09重量份，L-繳氨酸0.008-0.01重量份和L-殼氨酸0.009-0.012重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0019]優選地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標準的右旋糖酐3重量份，海藻糖6重量份，超低粘度海藻酸鈉0.8重量份，泛影葡胺4重量份，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.08重量份，L-纈氨酸0.009重量份和L-亮氨酸0.011重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0020]進一步地，所述右旋糖酐為Dextran70。
[0021]進一步地，所述分離液的密度為1.070?1.09(^/0113，滲透壓為275?300811101/1^，pH為6?9，粘度為3.0?5.0cp。
[0022]綜上所述，本發明的有益效果表現為:
[0023]本發明中涉及的全部原料均符合靜注級原料藥標準，原料不確定性小，安全性高；本發明使用的分離液包含海藻糖、超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨，海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構成的非還原性糖，對多種生物活性物質具有非特異性保護作用，對單個核細胞起到一定的保護作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強陽離子聚電解質有助于紅細胞的沉淀;利用本發明的分離液對血液樣品進行離心處理后，淋巴細胞與單核細胞將在分離介質和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細胞條帶，而紅細胞、粒細胞等其他細胞在離心力及本發明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質層;本發明使用的分離液凍存方法首先從分離單個細胞開始，并將上層血漿作為凍存液的一部分，右旋糖酐作為替代血漿，減少免疫反應，使用DMS0、海藻糖降低低溫對細胞的傷害，而且分離液的組分與凍存液組分部分接近，進一步減少外源物質對細胞的傷害，提高安全性。
【具體實施方式】
[0024]為使本發明的實施例要解決的技術問題、技術方案和優點更加清楚，下面將結合具體實施例進行詳細描述。但本發明絕非限于這些例子。以下所述僅為本發明較好的實施例，僅僅用以解釋本發明，并不能因此而理解為本發明專利范圍的限制。應當指出的是，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
[0025]實施例一
[0026]I)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨的分離液加入到離心管中；
[0027]2)將抗凝劑處理過的外周血或臍帶血中加入等體積的生理鹽水或無血清培養基稀釋后平鋪在分離液上，在8-25°C，200g-800g，10?30min條件下離心，吸取上層血漿備用，吸取白膜層細胞獲得淋巴細胞；
[0028]3)配制凍存液:將12 % DMS0+10%右旋糖酐+18 %上層血漿+1 %海藻糖+59 %注射用生理鹽水混合作為凍存液；
[0029]4)將淋巴細胞與凍存液按0.9?1.1:1的比例混勻，分裝于細胞凍存管中；
[0030]5)將細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉入液氮中凍存。
[0031]其中，分離液的制備方法為:在具備局部百級層流凈化條件的環境下，在20°C下，將符合藥用標準的右旋糖酐4g，海藻糖5g，超低粘度海藻酸鈉0.5g，泛影葡胺5g，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.1g，L-纈氨酸0.0lg和L-亮氨酸0.009g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
[0032]實施例二
[0033]I)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨的分離液加入到離心管中；
[0034]2)將抗凝劑處理過的外周血或臍帶血中加入等體積的生理鹽水或無血清培養基稀釋后平鋪在分離液上，在8-25°C，200g-800g，10