南洋楹無性系組織培養的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種南洋楹無性系組織培養的方法。
【背景技術】
[0002] 南洋植(Paraserianthes falcataria)是含羞草科(Mimosaceae)，屬常綠喬木樹 種，種植后3~4年可成林，4~5年可利用，且根系具有結瘤固氮能力，可改良土壤、提高地 力，是一個生態友好型的優良速生工業用材樹種。我國南洋楹栽培面積已達3萬余公頃，但 現有栽培林分全部為實生苗造林，存在如下缺陷：（1)南洋楹種子主要依靠進口和在國內早 期引種尚存的少量散生母樹上采集，種子來源不清、品質良莠不齊、產量年份波動較大；（2) 由于林木基因雜合程度高，南洋植林分普遍存在生長速度不一、分枝數量與大小不一等分 化問題。通過組織培養的方法可望快速滿足市場對南洋楹良種種苗的需求，實現南洋楹造 林的無性系化和良種化，顯著提高南洋楹林分的生長量和木材質量，促進南洋楹相關產業 可持續發展。
[0003] 目前，南洋楹組織培養技術尚處于試驗研究階段，主要由于外植體采集困難、滅菌 難度高、玻璃化及黃化現象嚴重、增殖倍數較低等瓶頸問題阻礙了其規模化繁殖。
【發明內容】
[0004] 基于此，本發明提供了一種南洋楹無性系組織培養的方法，該方法能夠減少幼苗 玻璃化現象和無效愈傷組織的產生，有效提高增殖倍率以及成苗率，縮短培育周期，實現南 洋楹無性系規模化繁殖。
[0005] 具體技術方案如下：
[0006] -種南洋楹無性系組織培養的方法，包括以下步驟：
[0007] (1)獲取外植體:采集南洋楹優良母樹種子，通過無菌育苗技術獲得無菌苗，以單 株無菌苗作為外植體;或者采用南洋楹優良母樹的根頸部位萌芽條作為外植體；
[0008] (2)誘導培養:將外植體分段切割，每段含1個頂芽或1~2個腋芽，接入誘導培養基 誘導愈傷組織及芽分化產生不定芽，培養1個周期后切除基部老化愈傷組織繼續轉接，再培 養一個周期，每個周期28~35天；
[0009] (3)增殖培養:將芽分化增殖與芽伸長增加腋芽數量增殖相結合，將步驟(2)的愈 傷組織和不定芽直接轉入增殖培養基，自然散射光培養28~35天后，轉接，轉為人工光源培 養；
[0010] (4)生根培養:不定芽增長到3~5cm時，切下轉入生根培養基，培養6~12天；
[0011] (5)煉苗:將培養瓶移到室外遮陰棚中閉瓶煉苗10~14天，邊煉苗邊生根，再揭去 瓶蓋注入清水，注入清水的量為覆蓋培養基平面以上0.5~1.0cm，開蓋煉苗2~5天；
[0012] (6)植株移栽:將煉苗后的小苗根部的培養基清洗干凈后，于晴天下午的4點半以 后或陰天移栽至育苗基質中，覆蓋透明塑料薄膜，保濕，培育28~32天后除去塑料薄膜，讓 其繼續生長;所述育苗基質為體積比為3~4:1的黃心土和泥碳土。
[0013] 在其中一個實施例中，步驟(2)所述的誘導培養基由以下組分組成:MS培養基、0.4 ~1.0 mg/L細胞分裂素6-BA、25~35g/L鹿糖、6~8g/L卡拉膠;所述誘導培養基的p H為5.6 ~6;培養條件為:溫度20~30°C，每天光照14~18小時，光照的強度為1000~20001x。
[0014] 在其中一個實施例中，步驟（2)所述的誘導培養基由以下組分組成:MS培養基、 0.5mg/L細胞分裂素6-BA、30g/L鹿糖、7g/L卡拉膠;所述誘導培養基的p H為5.8;培養條件 為:溫度28°C，每天光照16小時，光照的強度為15001x。
[0015] 在其中一個實施例中，步驟(3)將不定芽團轉入增殖培養基時將長度大于1.0cm的 芽體單獨切下，并分段切割，每段含1個頂芽或1~2個腋芽。
[0016] 在其中一個實施例中，步驟(3)所述增殖培養基由以下組分組成:MS培養基、0.1~ 0 · 3mg/L細胞分裂素6-BA、0 · 01~0 · 05mg/L萘乙酸、25~35g/L鹿糖、6~8g/L卡拉膠;所述育 苗培養基的P H為5.6~6;培養溫度為20~30°C，人工光源培養的光照強度為1000~ 2000 Ix，每天光照12~16小時。
[0017] 在其中一個實施例中，步驟（3)所述增殖培養基由以下組分組成：MS培養基、 0 · 2mg/L細胞分裂素6-BA、0 · 05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖、7g/L卡拉膠;所述育苗培養基的p H 為5.8，培養溫度為28°C，人工光源培養的光照強度為15001x，每天光照14小時。
[0018]在其中一個實施例中，步驟(4)所述生根培養基由以下組分組成：1/2MS培養基、 0 · 1~0 · 5mg/L萘乙酸、0 · 1~0 · 5mg/L吲噪丁酸、20~30g/L鹿糖、6~8g/L卡拉膠;所述生根 培養基的P H為5.6~6;培養溫度為20~30°C。
[0019] 在其中一個實施例中，步驟(4)所述生根培養基由以下組分組成：1/2MS培養基、 0 · 2mg/L萘乙酸、0 · 2mg/L吲哚丁酸、25g/L蔗糖、7g//L卡拉膠;所述生根培養基的p H為5 · 8; 培養溫度為28~30°C。
[0020] 在其中一個實施例中，步驟(5)所述閉瓶煉苗的時間為12天，注入清水的量為覆蓋 培養基平面以上I cm，開蓋煉苗的時間為3天。
[0021] 在其中一個實施例中，步驟(6)將煉苗后的小苗根部用濃度為5%的多菌靈清洗干 凈;所述保濕為保持濕度80~90 %;除去塑料薄膜前，晴天需覆蓋遮陰網；所述育苗基質為 體積比為3:1的黃心土和泥碳土。
[0022] 本發明的發明人經過長期的經驗積累與實驗研究，獲得了本發明所述的南洋楹無 性系組織培養的方法，該方法經過發明人長期的實驗研究，對誘導增殖流程、培養基以及培 養條件、煉苗等技術環節進行了優化。在誘導培養步驟中，在其培養基中加入高劑量細胞分 裂素6-BA可以快速誘導愈傷組織及芽分化，同時使芽體內積累一定濃度的激素，可降低后 續增殖培養過程中激素的使用量，減少幼苗玻璃化現象和無效愈傷組織的產生;增殖培養 過程中將芽分化增殖與芽伸長增加腋芽數量增殖相結合，有效提高了增殖倍率，使增殖倍 率提高到3.0以上;且在增殖培養時先將組培苗通過28~35天的自然散射光照，有效減少了 玻璃化和黃化現象，苗色增綠;將生根與煉苗結合進行，可縮短培育周期，強化煉苗過程，經 過本技術煉苗后的植株強壯、根長適宜、抗性增強，且苗木移栽的成活率顯著提高;在植株 移栽步驟中選擇在晴天下午4點半以后移植或者陰天移植，可以有效提高移植苗的成活率， 晴天下午4點半以后移植，其成活率達到早上的3倍。因此，本發明提供的南洋楹無性系組織 培養的方法可以有效減少幼苗玻璃化、黃化現象以及無效愈傷組織的產生，提高增殖倍率 以及成苗率，縮短培育周期，實現南洋楹無性系規模化繁殖。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合具體實施例對本發明做進一步的闡述。
[0024] 實施例1南洋楹無性系組織培養的方法
[0025] 本實施例的南洋楹無性系組織培養的方法，包括以下步驟：
[0026] 1、獲取外植體:在廣東省博羅縣林業科學研究所營建的引進南洋楹種源及家系試 驗林中，采集17年的優良母樹的BLS16種子，通過無菌育苗技術獲得無菌外植體。
[0027] 2、誘導培養:選擇1株生長健壯的無菌苗，苗高約3. Ocm，切除根部后，切分為2段， 其中一段含1個頂芽，另一段含2個腋芽，接入誘導培養基，培養35天后，切除基部老化愈傷 組織繼續轉接，再培養30天。誘導培養基的成分為:MS培養基+細胞分裂素6-BA(0.5mg/L) + 蔗糖(30g/L) +卡拉膠(7g/L)，p H值為5.8;培養條件為:溫度28°C，每天光照16小時，光照的 強度為15001x。獲得增殖芽12個，最長芽長度為5.0cm，幼嫩愈傷組織2團。
[0028] 3、增殖培養:將芽分化增殖與芽伸長增加腋芽數量增殖相結合，將愈傷組織和不 定芽直接轉入增殖培養基，長度大于1.0 cm的芽體單獨切下，并分段切割，每段含1個頂芽或 1~2個腋芽，接入增殖培養基。放置于培養室內可接收自然散射光的位置，控制溫度約為28 °C。培養30天后，轉接，培養光源轉為光照強度為15001x的人工光源，每天光照14小時。增殖 培養基的成分為:MS培養基+6-BA(0.2mg/L)+萘乙酸(NAA，0.05mg/L)+蔗糖(30g/L)+卡拉膠 (7g/L)，pH值5.8。人工光源培養一個周期為20天，連續培養4個周期。每個周期得到的苗木 苗徑粗壯，葉片多，葉色綠，平均苗高為3.2cm，平均增殖率為4.1。
[0029] 4、生根培養:不定芽增長到3~5cm時，切下轉入生根培養基培養10天。生根培養基 成分為：1/2MS 培養基+NAA(0.2mg/L)+吲哚丁酸（IBA，0.2mg/L)+蔗糖(25g/L)+卡拉膠(7g/ L)，p H值5.8。培養溫度約28°(3。
[0030] 5、煉苗:將培養瓶移到室外遮陰蓬中閉瓶煉苗12天，邊煉苗邊生根，再揭去瓶蓋注 入清水(注水量為培養基平面以上lcm)，煉苗3天。所得植株強壯，抗風抗萎蔫性強，根系長 度2~4cm，適宜移栽。
[0031] 6、植株移栽：用濃度為5%的多菌靈清洗干凈根部的培養基后，于晴天下午4點半 后移栽至育苗基質中，育苗基質為體積比為3:1的黃心土和泥碳