一種基于玉米幼胚的形態鑒別單倍體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種基于玉米幼胚形態鑒別單倍體的方法。
【背景技術】
[0002] 玉米是我國種植面積第一大作物，2012年，玉米播種面積超過％00萬hm2。我國 97% W上的玉米播種面積使用雜交玉米化i J，2009)。優良玉米自交系的選育是玉米利用 雜種優勢、選育優良雜交種的基礎和關鍵。但傳統選育方法需要7~8個世代才能獲得較為 穩定的自交系，而單倍體育種技術只需2個世代(Weber D F，2014)。因此，單倍體育種技術 作為一種快速獲得純系的方法已經被國內外許多種業公司規模化應用，成為可與轉基因技 術、分子標記輔助育種技術相媳美的現代化玉米育種=大核屯、技術之一(陳紹江等，2009)。
[0003] 隨著單倍體育種技術的大規模應用，進一步提高其效率及工程化顯得極為重要。 單倍體技術流程可W劃分為W下4個環節:①單倍體的產生;②單倍體的鑒別;③單倍體的 加倍;④DH系的利用。其中，單倍體的誘導對DH系（doubled haploid,DH)的產生至關重要， 決定著單倍體獲得的數量。單倍體的鑒別是單倍體育種技術工程化的重要環節，其鑒別的 準確率、速率直接影響單倍體育種技術的規模化應用。
[0004] 通過組培途徑進行DH系的工廠化生產是實現單倍體工程化育種的又一重要方式。 現有單倍體的鑒別方法如包括根尖壓片染色體計數、細胞流式儀分析核酸含量、SSR和SNP 分子標記檢測、Rl-nj顏色標記、巧粒油分標記、巧粒重量等（Antoine-Michard S and Becke;rt 1,1997;陳紹江等，2003;Ba;rret P et al,2008;Melchinger A E et al,2013;Xu X et al,2013;Barton J E et al,2014;Smelser A et al,2015)。運些方法主要是對巧粒 和植株效果較好，但在組培條件下，如何實現單倍體的快速準確選擇尚無高效方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的是提供一種鑒別或輔助鑒別玉米單倍體幼胚的方法。
[0006] 本發明提供的鑒別或輔助鑒別玉米單倍體幼胚的方法為如下1)或2)或3):
[0007] 1)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照寬度由小到大的順序進行排序，選擇排序為前20-30%的玉米幼 胚，得到或候選得到玉米單倍體幼胚；
[000引2)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照面積由小到大的順序進行排序，選擇排序為前20-30%的玉米幼 胚，得到或候選得到玉米單倍體幼胚；
[0009] 3)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照長度由小到大的順序進行排序，選擇排序為前20-30%的玉米幼 胚，得到或候選得到玉米單倍體幼胚。
[0010] 上述方法中，所述選擇排序為前30 %的玉米幼胚。
[0011] 上述方法中，所述玉米幼胚長度為2.0~7.0mm。
[0012] 上述方法中，所述玉米單倍體誘導系為農大高誘5號或農大高油高誘3號;所述母 本為玉米自交系或玉米雜交種。
[0013] 上述方法中，所述玉米自交系為B73或Mol7;所述玉米雜交種為鄭單958或B73/ Mol7；
[0014] 所述B73/M017是WB73為母本，Mol7為父本的雜交子代。
[0015] 上述方法中，所述玉米幼胚的數量為86-1734;所述玉米幼胚的數量具體為86、 189、428、335、411、474、1642或17：34。
[0016] 本發明的另一個目的是提供上述方法的新用途。
[0017] 本發明提供了上述方法在培育玉米單倍體植株中的應用。
[0018] 本發明的最后一個目的是提供一種培育玉米單倍體植株的方法。
[0019] 本發明提供的培育玉米單倍體植株的方法包括如下步驟，
[0020] 1)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照長度或寬度或面積由小到大的順序進行排序，選擇排序為前so-so % 的玉米幼胚， 得到或候選得到玉米單倍體幼胚；
[0021 ] 2)將所述玉米單倍體幼胚在加倍培養基上進行加倍，培養，根據株型和/或莖桿顏 色選取玉米單倍體植株。
[0022] 通過實驗證明：本發明的方法在玉米幼胚時期即可實現對單倍體的挑選，在幼胚 顏色表達之前將很大一部分雜合的二倍體幼胚淘汰掉，提前了單倍體挑選的時間，提高挑 選的效率，進一步縮短了育種時間，也節省了后續的成本，提高了經濟效益。且本發明提供 的方法具有自動化挑選單倍體的前景，加速了玉米單倍體工程化育種的進程。
【附圖說明】
[0023] 圖1為單倍體幼胚的照片。其中，紅色箭頭所指的為單倍體幼胚。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0025] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0026] 玉米單倍體誘導系農大高誘5號(CAU5)為下述實施例中的父本，在文獻"Dong, X.， et al.(2014)."Marker-assisted selection and evaluation of high oil in vivo haploid inducers in maize. "Molecular Breeding 34(3): 1147-1158." 中公開過，公眾 可從中國農業大學獲得。
[0027] 玉米(Zea mays L.)雜交種鄭單958是北京思農種業有限公司的產品，執行標準： GB4404.1-2008。
[0028] 玉米單倍體誘導系農大高油高誘3號（C冊13)為下述實施例中的父本，在文獻"董 昕，2014,玉米單倍體誘導基因姐irl精細定位與新型誘導系選育研究，博±論文"中公開 過，公眾可從中國農業大學獲得。
[00巧]玉米自交系B73和Mol7為下述實施例中的母本，在文獻"Lee M,化aropova N, Beavis W D,et al.Expanding the genetic map of maize with the intermated B73X Mol7(IBM)population[J] .Plant molecular biology,2002,48(5-6) :453-461."中公開 過，公眾可從中國農業大學獲得。
[0030] MS鹽是上海宇涵生物科技有限公司的產品，產品目錄號為140225。
[0031] B73/M017是WB73為母本，Mol7為父本雜交得到的Fl代個體，在文獻"Lee M， Sharopova N,Beavis W D,et al.Expanding the genetic map of maize with the intermated B73XMol7(IBM)population[J].Plant molecular biology,2002,48(5-6): 453-461."中公開過，公眾可從中國農業大學獲得。
[0032] 實施例1、一種基于玉米幼胚形態鑒別單倍體的方法
[0033] -、單倍體幼胚的鑒別方法
[0034] 1、雜交
[0035] (1)雜交親本
[0036] WB73為母本，W誘導系CAU5為父本，雜交，得到雜交子代A;
[0037] WMol7為母本，W誘導系CAU5為父本，雜交，得到雜交子代B;
[0038] WB73為母本，W誘導系C冊13為父本，雜交，得到雜交子代C;
[0039] WMo