一種利用幼胚拯救獲得八仙花種間雜種的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用受精后的幼胚離體培養獲得八仙花遠緣雜交種的方法，屬于生物技術育種領域。
【背景技術】
[0002]八仙花(辦?/ra/^ea又名繡球、紫陽花,為虎耳草科八仙花屬植物。繡球屬{Hydrangea、植物全世界約有85個種，我國繡球屬植物共有47種和11變種，除南部海南、東北部黑龍江、吉林，西北部新疆等省區外，全國各地均有分布，尤以西南部至東南部種類最多。八仙花原產中國和日本，喜溫暖、濕潤和半陰環境，不甚耐寒。夏季酷暑忌烈日直曬，否則葉易焦枯黃，不適宜過分干燥，喜生于含腐殖質豐富、濕潤、排水良好的輕壤土上。繡球屬植物多為灌木，花序、花型、花色豐富是優良的觀賞花卉。八仙花葉大而具有光澤，既可觀花又可觀葉，其適應性強，具有耐寒(在南京地區一些種類的綠期可達300d以上)、抗性強、耐蔭等特性，很少感染病蟲害等優點。繡球屬植物對土壤的酸堿度非常敏感，土壤呈酸性時，開的花為藍色，隨著土壤PH值升高，其花色逐漸由藍變紅，因而，通過調節土壤的PH值可改變八仙花的花色。八仙花被廣泛應用于公園、庭院等景觀中，配置方式多樣，令人駐足流連。近幾年，微型盆栽和切花八仙花在國內外市場廣受歡迎，逐漸成為花市上新寵，歐美、日本等國對八仙花花卉資源及育種的研究較早，培育出了很多的園藝栽培品種。我國園林中應用較多的仍舊是20世紀歐洲選育的八仙花品種，因此繡球屬植物的野生資源開發利用與新品種選育研究具有十分廣闊的前景。
[0003]八仙花在氣候適宜地區是極優良的花灌木，若冬季氣溫不低于15°C，葉叢油亮碧綠，可達到三季有花、四季常青。但由于八仙花大多數品種耐寒性較差，其分布和應用范圍受到限制。為了更好地促進八仙花的園林生產及應用，將這種美麗多變的材料引入到北方地區，甚至讓其在華北地區露地過冬，需要培育出耐寒且美觀的八仙花品種。我國已經從美國引入了耐寒繡球品種——樹繡球，其形態為:落葉灌木或半灌木，高2?3m。葉紙質，交互對生，卵形或卵圓形，緣有鋸齒，兩面有毛。聚傘花序，外圍有大型白色不孕花，中央為可孕花，花期5?7月。該種有2個園藝品種，其中之一是我國南北各地廣泛栽培的‘安娜貝拉’ {Hydrangea arborescens ‘Annabelle’),俗稱“雪山八仙花”,即本試驗的父本品種,是最耐寒的繡球品種之一。其花序全部由大型白色不孕花組成，初綻綠色，漸次轉白，直徑可達20cm以上；另一個園藝品種是大花光葉八仙花(/Z arborescens ' Grandiflora'),花型接近于雪球(snowballs)。對照USDA的野生樹繡球‘安娜貝拉’分布圖，這一耐寒品種分布在北美洲的東北部。其分布地植物的耐受最低溫度達到-31.7°C，這一數據表明該品種可以在華北地區安全露地過冬。‘安娜貝拉’極強的耐寒能力成為我們選擇其作為親本的理由。
[0004]八仙花新品種的培育多數是通過種內雜交實現的，種間雜交屬于遠緣雜交，自然狀態下由于易敗育而無法獲得雜交后代。雜種胚的挽救培養技術作為組織培養的一個重要領域己有近百年的歷史，雜交子房、胚珠和雜交幼胚的離體培養，是目前克服受精后發育障礙的有效方法，在植物育種工作中發揮著極為重要的作用，己廣泛運用于水稻、小麥、玉米等糧食作物的育種工作中。因此利用幼胚拯救技術獲得八仙花雜種后代，是培育觀賞價值高且抗寒性強的八仙花新品種的關鍵所在。
【發明內容】
[0005]
為克服上述問題，本發明提供了一種離體培養子房獲得八仙花種間雜種的方法，該方法能夠提高八仙花種間雜交的雜種成活率，縮短育種周期。
[0006]本發明通過下列技術方案實現:一種離體培養子房獲得八仙花種間雜種的方法，包括以下步驟:
A、子房消毒:將授粉后60-75天的未完全發育子房切割下來，在0-8°C溫度條件下存放24-72小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭2-3次，流水沖洗2_6小時，帶到超凈工作臺上。用75%的酒精浸泡30秒，0.05-0.1%升汞溶液中浸泡8-15min，用無菌水清洗5-6遍，選取膨大的子房，用無菌刀片切去子房基部；
B、接種:在無菌條件下，將滅菌后切去基部的子房接種到1/2MS+6-BA0.5-2 mg/L+NAA
0.1-1 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0。培養溫度為21_26°C，光照強度為2000-2500LX，光照時間12_14h/d，空氣濕度70_85%，培養30-45天后萌發率達到 30-40% ；
C、增殖培養:將萌發的幼胚接種到1/2MS+6-BAI mg/L+NAA 0.5-1.5 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0。培養溫度為21_26°C，光照強度為2000-2500LX，光照時間12_14h/d，空氣濕度70-85%的條件下進行幼苗的增殖培養，30-45
天轉接一次；
D、生根培養:將增殖獲得的無菌幼苗轉接到1/2MS+IBA0-0.5 mg/L+AC 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0。培養溫度為21-26°C，光照強度為2000-2500LX，光照時間12_14h/d，空氣濕度70-85%的條件下進行生根培養，30-45天后統計生根率為100%
E、雜種鑒定:對獲得材料同時進行形態學鑒定和雜種SSR鑒定，其中在形態學鑒定時，對雜種的父母本及后代材料的形態學進行觀察和統計，包括:依據英國皇家園藝學會色譜比色，對父母本及開花后代的花色進行比對并記錄；每株隨機選擇三片完全展開的葉片，進行葉長和葉寬的測定，并分別測定葉柄的長度；每株隨機選擇三個完全盛開的花序，測量其花序的長寬，并記錄每個花序的著花數；每個花序隨機選擇五多單花，測量其單花的長度和寬度；每株隨機選擇五個花瓣，對花瓣長度和寬度進行測量。其中花色與父母本的花色均不同，葉片長寬比、花瓣長度、寬度、長寬比及花序長寬比介于父母本之間的初步確定為真雜種。
[0007]在雜種SSR鑒定時，提取親本及獲得的雜交后代的DNA，對獲得的DNA質量進行鑒定，然后進行PCR擴增及瓊脂凝膠電泳獲得擴增譜帶，并對PCR產物進行檢測，然后使用全自動ABI 3730 DNA自動測序儀對PCR產物進行STR分型。首先根據SSR引物擴增條帶讀數結果，擴增結果較清晰反映出有子代發生重組現象；然后通過分析SM匹配系數進行的UPGMA法聚類結果發現無一子代與親本相似系數為1，即無一子代與親本完全相同。而各子代之間的相似性系數變化范圍在0.47-0.93，體現出各個子代間都存在一定的差異。最后我們可以確定14個雜種子代為真雜種。
[0008]有益效果:本發明提供的利用幼胚拯救獲得八仙花種間雜交的方法，與現有技術相比有如下優點和積極效果:
(I)本發明利用不耐寒的八仙花‘鉆石’ {Hydrangea macrophylla ‘Diamond’)與耐寒樹繡球‘安娜’ (Mydrangea arborescens ‘Annabelle’)進行種間雜交,結合幼胚拯救技術進行八仙花種質創新，實現了八仙花種間遠緣雜交，創造了一批新種質。
[0009](2)本實驗選用將授粉后60-75天后獲得的子房進行離體培養，此時胚已接近成熟，易于獲得雜交后代。
[0010](3)該方法使大量種間雜交胚繼續發育成正常的植株，有效避免遠緣雜交胚早衰現象，同時獲得大量的遠緣雜交后代，實現八仙花種間遠緣雜交。
[0011](4)利用形態學方法和SSR技術對八仙花種間雜種進行早期鑒定。
[0012](5)在本發明基礎上，使利用創新的八仙花種質成為可能，可以獲得更多擁有優良性狀的八仙花新品種。
【附圖說明】
[0013]
圖1、母本八仙花‘鉆石’ {Hydrangea macrophylla ‘Diamond’)
圖 2、父本樹繡球‘安娜貝拉’ {Hydrangea arborescens ‘Annabelle’)
圖3、‘鉆石’與‘安娜貝拉’雜種后代I 圖4、‘鉆石’與‘安娜貝拉’雜種后代2。
【具體實施方式】
[0014]為了更好的說明本發明的實質內容，下面給出本發明的實施例:
實施例1
A、子房消毒:將授粉后60天的未完全發育子房切割下來，在4°C溫度條件下存放48小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭2次，流水沖洗4小時，帶到超凈工作臺上。用75%的酒精浸泡30秒，0.05%升汞溶液中浸泡15min，用無菌水清洗6遍，選取膨大的子房，用無菌刀片切去子房基部；
B、接種:在無菌條件下，將滅菌后切去基部的子房接種到1/2MS+6-BA1.0 mg/L+NAA
1.0 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0。培養溫度為22°C，光照強度為2000Lx，光照時間12h/d，空氣濕度70%，培養30天后萌發率達到30-40% ；
C、增殖培養:將萌發的幼胚接種到1/2MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0。培養溫度為22°C，光照強度為2000Lx，光照時間12h/d，空氣濕度70%的條件下進行幼苗的增殖培養，30天轉接一次；
D、生根培養:將增殖獲得的無菌幼苗轉接到1/2MS+IBA0.5 mg/L+AC 0.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0。培養溫度為22°C，光照強度為2000Lx，光照時間12h/d，空氣濕度70%的條件下進行生根培養，30天后統計生根率為100% ；
E、雜種鑒定:將雜交親本及后代在3月份定植于田間，5月中下旬對親本及雜交后代的形態進行觀察記錄，后代材料的花色、葉片、花序、花瓣等形態學介于父母本之間的初步確定為真雜種。