一種誘導佛手參原球莖分化的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種誘導佛手參原球莖分化的方法，屬于生物領域。
【背景技術】
[0002]蘭科手參屬植物為多年生草本植物，全世界共10種，我國有5種，包括西南手參、手參、短距手參、蛾眉手參和角距手參。佛手參因具有可觀的藥用價值而被列入多部藏醫藥經典。
[0003]蘭科植物的種子極小(每粒種子長1?2 mm,直徑0.1?0.2 mm),由于其胚發育不完全，缺乏供給營養成分的胚乳，因此在自然條件下需要與生境中的真菌共生才能萌發，自然萌發率極低。蘭科植物依其生長的環境可分為氣生蘭和陸生蘭，生長于土壤中的陸生蘭為了適應其分布地的生態環境，在長期的進化中發展了種皮厚及含有阻礙萌發的物質等特征，其種子比氣生蘭種子更難以萌發。蘭科手參屬植物為陸生蘭類，佛手參的無性繁殖是由老手參根部僅增生一個小手參，當小手參長大時，老手參枯死，平均繁殖倍數低于2，而種子的自然萌發率也極低。解決佛手參的種苗規模化繁殖是實現其人工栽培、藥用開發及種質資源保護的關鍵。
[0004]佛手參屬于陸生蘭類，其無性及有性繁殖均較為困難，人為的采挖導致了野生資源日益匱乏，迫切需要像天麻、石斛等藥用蘭科植物一樣進行人工栽培，而種苗的規模化生產是實現人工栽培的關鍵技術。現有技術有人曾嘗試利用佛手參的根、芽體和花梗為外植體進行離體培養研究，設計了大量不同植物生長物質組合的培養基，但接種的150個塊根、150個花梗和20余個芽體無一例誘導成功，表明佛手參組織培養難度很大。該研究還首次對佛手參種子進行了非共生萌發研究，種子萌發率可達到20%，這已經是很重大的突破，但是萌發率還是非常低，而且將萌發后得到的原球莖進一步進行誘導分化處理，分化率最高僅僅為7%左右。
[0005]本發明旨在提供一種誘導佛手參原球莖分化的方法，其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高原球莖的分化率，分化率可高達56.3-81.2%。
【發明內容】
[0006]基于【背景技術】存在的技術問題，本發明針對【背景技術】存在的問題，提供一種誘導佛手參原球莖分化的方法，其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高原球莖的分化率，分化率高達56.3-81.2%。
[0007]本發明的目的通過以下技術方案實現:
一種誘導佛手參原球莖分化的方法，其特征在于，步驟如下:
(1)獲得佛手參種子萌芽得到的原球莖；
(2)愈傷組織形成:
將佛手參種子萌芽得到的原球莖移至誘導增殖培養基；
所述誘導增殖培養基的配方為:以MS為基礎培養基，蔗糖15.8g/L、瓊脂3.9g/L，海藻糖5g/L，復方中藥提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA Ο.lmg/L、pH6.5 ；
所述復方中藥提取液的制備方法為:
如下所述均為質量份；
取5-6份黨參，2份天山雪蓮，1份青果，1份淫羊藿，1.2-1.6份積雪草，0.5份凌霄花，上述藥物按傳統煎煮方法加300份煎煮至30份水時，過濾，紫外線滅菌于3°C備用；
(3)待根狀莖和愈傷組織長出以后，將根狀莖切為長約0.2 cm的節段，愈傷組織切成0.2cmX0.2cm小塊平鋪于新鮮的誘導增殖培養基上；置于溫度26°C，光照周期12 h.d_l，光照強度22μπι01.πΓ、S—1的條件下培養，每45 d繼代一次，并觀察、記錄原球莖的生長狀況。
[0008]根狀莖和愈傷組織的增殖以繼代3次的平均增長質量計算。公式為:根狀莖(愈傷組織)增殖倍數=接種45 d后的平均質量(g)/接種平均質量(g)。
[0009]本發明首次將中草藥萃取液用于提高佛手參原球莖分化率，其效果好，成本低。其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高原球莖的分化率，繼代3次的增殖倍數為3.1-4.2，分化率高達56.3-81.2%。
[0010]本發明的有益之處在于:
(1)本發明其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高瀕危植物佛手參原球莖的分化率，并且形成的芽強壯，成活率高。
[0011 ] (2)繼代3次的增殖倍數為3.1-4.2，分化率高達56.3-81.2%，，這是對瀕危植物佛手參育苗研究的重大突破。
【具體實施方式】
[0012]實施例1:
一種誘導佛手參原球莖分化的方法，其特征在于，步驟如下:
(1)獲得佛手參種子萌芽得到的原球莖；
(2)愈傷組織形成:
將佛手參種子萌芽得到的原球莖移至誘導增殖培養基；
所述誘導增殖培養基的配方為:以MS為基礎培養基，蔗糖15.8g/L、瓊脂3.9g/L，海藻糖5g/L，復方中藥提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA 0.lmg/L、pH6.5 ；
所述復方中藥提取液的制備方法為:
如下所述均為質量份；
取5份黨參，2份天山雪蓮，1份青果，1份淫羊藿，1.6份積雪草，0.5份凌霄花，上述藥物按傳統煎煮方法加300份煎煮至30份水時，過濾，紫外線滅菌于3°C備用；
(3)待根狀莖和愈傷組織長出以后，將根狀莖切為長約0.2cm的節段，愈傷組織切成
0.2cmX0.2cm小塊平鋪于新鮮的誘導增殖培養基上；置于溫度26°C，光照周期12 h.d_l，光照強度22μπι01.πΓ、S—1的條件下培養，每45 d繼代一次，并觀察、記錄原球莖的生長狀況。
[0013]根狀莖和愈傷組織的增殖以繼代3次的平均增長質量計算。公式為:根狀莖(愈傷組織)增殖倍數=接種45 d后的平均質量(g)/接種平均質量(g)。
[0014]本發明首次將中草藥萃取液用于提高佛手參原球莖分化率，其效果好，成本低。其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高原球莖的分化率，繼代3次的增殖倍數為4.1，分化率高達81.2%。
[0015]實施例2:
一種誘導佛手參原球莖分化的方法，其特征在于，步驟如下:
(1)獲得佛手參種子萌芽得到的原球莖；
(2)愈傷組織形成:
將佛手參種子萌芽得到的原球莖移至誘導增殖培養基；
所述誘導增殖培養基的配方為:以MS為基礎培養基，蔗糖15.8g/L、瓊脂3.9g/L，海藻糖5g/L，復方中藥提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA 0.lmg/L、pH6.5 ；
所述復方中藥提取液的制備方法為:
如下所述均為質量份；
取6份黨參，2份天山雪蓮，1份青果，1份淫羊藿，1.2份積雪草，0.5份凌霄花，上述藥物按傳統煎煮方法加300份煎煮至30份水時，過濾，紫外線滅菌于3°C備用；
(3)待根狀莖和愈傷組織長出以后，將根狀莖切為長約0.2cm的節段，愈傷組織切成
0.2cmX0.2cm小塊平鋪于新鮮的誘導增殖培養基上；置于溫度26°C，光照周期12 h.d_l，光照強度22μπι01.πΓ、S—1的條件下培養，每45 d繼代一次，并觀察、記錄原球莖的生長狀況。
[0016]根狀莖和愈傷組織的增殖以繼代3次的平均增長質量計算。公式為:根狀莖(愈傷組織)增殖倍數=接種45 d后的平均質量(g)/接種平均質量(g)。
[0017]本發明首次將中草藥萃取液用于提高佛手參原球莖分化率，其效果好，成本低。其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高原球莖的分化率，繼代3次的增殖倍數為4.2，分化率高達56.3%。
[0018]實施例3:
一種誘導佛手參原