一種海桐體細胞胚胎發生和植株再生的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物繁殖方法，特別是一種海桐體細胞胚胎發生和植株再生方法。
【背景技術】
[0002]海桐(Pittosporum tobira(Thunb.)Ait))主要分布于長江流域以南各省區，海桐屬常綠灌木或小喬木，對二氧化硫、氯氣、氟化氫等有害氣體有較強抗性，是國內外首次發現各部位均具有較強化感作用的園林綠化植物。海桐枝葉，異名七里香葉(臺灣)，具有解毒、殺蟲的功能，主要用于治療疥瘡、腫毒(國家中醫藥管理局《中華本草》編委會編，中華本草4，上海科學技術出版社，1999:65-66)。
[0003]現代研究表明，海桐的根、莖、葉、花、果實和種子中均含有類胡蘿卜素、萜類等復雜化學成分，表現抗菌、抗腫瘤、殺蟲、神經保護、除草等多種生物活性和很高的藥用價值，海桐具有保護谷氨酸誘導的神經毒性的活性，其枝葉可以止血、解毒、抗菌，根可以散瘀止痛、祛風活絡，果實總皂苷能抑制腫瘤細胞的增生，種子具有固精、澀腸、保護心血管系統、預防冠心病等功效，因此，海桐具有醫藥工業、食品(保健型食用油)、日用化妝品等廣泛開發前景，其種植需求量日益增長(孫卓，劉紅星與黃初升，海桐植物化學成分以及生物活性的研究，化工技術與開發，2014(01)，22-26)。
[0004]海桐的傳統繁育方法為壓條、扦插和播種，但壓條繁殖既破壞樹形又難以大量繁殖，扦插繁殖的繁殖系數受生根效率的影響，且根系不發達，株型不豐滿;經長期栽培，海桐雄蕊常表現退化而不育，結實率低，播種種源有限，且受生理休眠影響，海桐種子在自然條件下難以萌發，種子成苗率低(米銀法，宋乾江與李巍，不同濃度NAA和IBA處理對海桐扦插生根的影響，山東農業科學，2011(08):44-47;)，(唐安軍與柳建平，海桐種子的休眠解除與萌發，種子，2011 (05):46-49；)，(http://frps.eflora.cn/frps/Pittosporum:中國植物志第35 (2)卷，海桐花科海桐花屬3，海桐)。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種海桐體細胞胚胎發生和植株再生的方法，能夠解決海桐種子在自然條件下難以萌發，種子成苗率低的問題。
[0006]本發明的技術方案是:一種海桐體細胞胚胎發生和植株再生的方法，包括以下步驟:
[0007](1)外植體的選擇與消毒:取海桐新鮮種子作為外植體，依次用2v/v%洗潔精水溶液浸泡5min，線狀自來水沖洗15-30min，添加了 2-3滴吐溫-20的0 ,lv/v%升汞100mL消毒8-lOmin，無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中，無菌水為經高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0008](2)外植體誘導獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體置于超凈工作臺內，接種到MS培養基中，在培養溫度為23-27°C，黑暗的條件下培養20d得到無菌試管苗，其中，MS培養基中添加GA30.1-0.5mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養基pH值為5.8;
[0009](3)胚性愈傷組織的誘導:將步驟(2)中得到的無菌試管苗的子葉置于MS胚性傷組織誘導培養基中，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10h/d的條件下培養30d，得到胚性愈傷組織，其中，MS胚性傷組織誘導培養基添加2，4-D0.5-2.5mg/L、TDZ0.5-2.0、CH200mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養基pH值5.8 ；
[0010](4)胚狀體誘導與萌發:將步驟(3)中得到胚性愈傷組織置于MS萌發培養基中，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間8-10h/d的條件下培養30d，得到體細胞胚胎再生小植株，其中，MS萌發培養基中中添加蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養基pH值為5.8;
[0011](5)壯苗培養:將步驟(4)中得到的體細胞胚胎再生小植株置于MS壯苗培養基中，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間8-10h/d的條件下培養30d，得到完整自根苗，其中，MS壯苗培養基中添加6-BA0.1-0.5mg/L、NAA0.05-0.lmg/L、蔗糖30g//L和瓊脂58/1，培養基?!1值5.8;
[0012](6)煉苗移栽:將所述完整自根苗在溫度為25°C的室內煉苗4-7d，待培養基表面形成角質后，取出幼苗，洗凈根部培養基，移栽到滅菌蛭石的基質中，生長一個月后移栽到大田。
[0013]本發明的突出優點在于:海桐體細胞胚胎發生和植株再生方法技術方法簡便，從外植體到植株再生，煉苗移栽整個培養周期打破傳統組培繁殖方式，將芽誘導和得根一步完成，縮短培養周期，提高繁殖系數，移栽成活率高，出苗整齊一致，便于管理。
[0014]實施例1
[0015]本發明所述的海桐體細胞胚胎發生和植株再生方法，包括以下步驟:
[0016](1)外植體的選擇與消毒:取海桐新鮮種子作為外植體，依次用2v/v%洗潔精水溶液浸泡5min，線狀自來水沖洗15-30min，添加了 2-3滴吐溫-20的0 ,lv/v%升汞100mL消毒8-lOmin，無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體。其中，無菌水為經高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0017](2)外植體誘導獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體置于超凈工作臺內，接種到MS培養基中，在培養溫度為23-27°C，黑暗條件下培養20d得到無菌試管苗。其中，MS培養基中添加GA30.lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養基pH值為5.8。
[0018](3)胚性愈傷組織的誘導:將步驟(2)中得到的無菌試管苗的子葉，在超凈臺內用解剖刀劃傷子葉，平貼于MS胚性愈傷誘導培養基上，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10h/d的條件下培養30d，得到胚性愈傷組織，其中，MS胚性愈傷組織誘導培養基中添加2，4-D0.5mg/L、TDZ0.511^/1、0120011^/1、蔗糖3(^/1和瓊脂58/1，培養基pH值5.8;
[0019](4)胚狀體誘導與萌發:將步驟(3)中得到胚性愈傷置于MS萌發培養基中在培養溫度為23-27°C，光照強度15001UX，光照時間8-10h/d的條件下培養30d，得到體細胞胚胎再生小植株。其中，MS萌發培養基中添加蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養基pH值為5.8。
[0020](5)壯苗培養:將步驟(4)中得到的體細胞胚胎再生小植株置于MS壯苗培養基中，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間8-10h/d的條件下培養30d，得到完整自根苗。其中，MS壯苗培養基中添加6-BA0.5mg/L、ΝΑΑ 0.lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養基pH值為5.8。
[0021](6)煉苗移栽:將所述完整自根苗在室溫下煉苗4-7d，待培養基表面形成角質后，取出幼苗，洗凈根部培養基，移栽到滅菌蛭石的基質中，生長一個月后，移栽到大田。每天早晚各噴霧一次。
[0022]實施例2
[0023](1)外植體的選擇與消毒:取海桐新鮮種子作為外植體，依次用2v/v%洗潔精水溶液浸泡5min，線狀自來水沖洗15-30min，添加了 2-3滴吐溫-20的0 ,lv/v%升汞100mL消毒8-lOmin，無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體。其中，無菌水為經高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0024](2)外植體誘導獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體置于超凈工作臺內，接種到MS培養基中，在培養溫度為23-27°C，黑暗條件下培養20d得到無菌試管苗。其中，MS培養基中添加GA30.lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養基pH值為5.8。
[0025](3)胚性愈傷組織的誘導:將步驟(2)中得到的無菌試管苗的子葉，在超凈臺內用解剖刀劃傷子葉，平貼于MS胚性愈傷誘導培養基上，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10h/d的條件下培養30d，得到胚性愈傷組織，其中，MS胚性愈傷組織誘導培養基中添加2，4-01.011^/1、了022.011^/1、0120011^/1、蔗糖3(^/1和瓊脂58/1，培養基pH值5.8;
[0026](4)胚狀體誘導與萌發:將步驟(3)中得到胚性愈傷置于MS萌發培養基中在培養溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間8-10h/d的條件下培養30d，