一種離體培養(yǎng)用水稻花藥快捷分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種離體培養(yǎng)用水稻花藥快捷分離方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻花藥培養(yǎng)是指用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，把發(fā)育到一定階段的花藥，接種在人工 培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，W改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育程序，誘導(dǎo)其分化，并連續(xù)進行有絲分裂， 形成細(xì)胞團，進而形成一團無分化的薄壁組織--愈傷組織，隨后使愈傷組織分化成完整的 水稻植株?；ㄅ嘀仓杲?jīng)過人工加倍或自然加倍產(chǎn)生純合的二倍體植株，通過常規(guī)系統(tǒng)選育 方法，選出綜合性狀優(yōu)異的純合穩(wěn)定株系（品系），再經(jīng)過進一步的品種比較、區(qū)域試驗和生 產(chǎn)示范育成新的品種，運種花培技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合的方法就是花培育種。
[0003] 水稻花藥培養(yǎng)是當(dāng)今生物技術(shù)育種中較為成熟、實用、快速、有效的育種新技術(shù)。 水稻花藥培養(yǎng)育種主要特點表現(xiàn)為縮短育種周期，提高選擇效率，加速有效性狀轉(zhuǎn)移等。花 藥培養(yǎng)育種已與常規(guī)雜交育種、遠(yuǎn)緣雜交育種、誘變育種W及轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展形成 了一套育種技術(shù)體系?；ㄅ嘤N是水稻育種多、快、好、省的新途徑，在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向高技術(shù)農(nóng) 業(yè)的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著紐帶作用。
[0004] 1968年日本新關(guān)和大野通過花藥離體培養(yǎng)獲得水稻花培植株，掲開了人類利用花 藥創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的序幕。水稻花培育種具有縮短育種年限、擴大變異范圍、提高選擇效率 等優(yōu)勢，近幾十年來發(fā)展很快，在水稻育種中已被廣泛應(yīng)用?；ㄅ嘤N是近代生物技術(shù)的重 要組成部分，也是生物技術(shù)各領(lǐng)域中最早在水稻方面進入實用化階段的一種育種方法。我 國自1970年開始水稻花培研究W來，經(jīng)歷了啟動、調(diào)整、發(fā)展Ξ個階段，在花培方法、誘導(dǎo)手 段、取材世代及群體規(guī)模等研究上不斷完善、創(chuàng)新，培育出了大量花培品種、恢復(fù)系及不育 系等，為品種改良創(chuàng)造了大量的種質(zhì)資源，為遠(yuǎn)緣雜交育種、超級稻育種、新株型育種及轉(zhuǎn) 基因育種等現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展提供了重要的技術(shù)支撐。
[000引1975年我國利用花培育種技術(shù)第一次育成了梗稻品種單豐1號，標(biāo)志著花培技術(shù) 在我國常規(guī)水稻育種應(yīng)用的開端。隨后利用花培技術(shù)育出了很多優(yōu)良的常規(guī)品種，如中花 系列、龍梗系列、京花系列、閩花系列、寧梗系列、早單7301、晚單7號、合單76-085、合江21、 浙梗66號、花寒早、花培528、南抗1號、朝花矮、協(xié)優(yōu)議-8等，通過審定的品種有40多個。不育 系和恢復(fù)系的長期使用會發(fā)生退化，因此嚴(yán)格的提純復(fù)壯措施非常必要，因此花培育種在 不育系和恢復(fù)系的提純上應(yīng)用較多。葛美芬等同配套提純了燦優(yōu)63的Ξ系材料珍燦97B、珍 燦97A和恢復(fù)系明恢63。1993年張家宏等對水稻印尼水田谷6號質(zhì)源不育系Π-32Α和優(yōu)IA的 花培提純獲得成功?；ㄅ噙^程產(chǎn)生的變異也為水稻的選育提供了新的遺傳基礎(chǔ)材料，選育 出了一些應(yīng)用廣泛的新恢復(fù)系和新組合。如四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所選育出的花廣518、花 廣549、花廣1357和蜀恢162等廣親和恢復(fù)系。張志雄等同利用花培技術(shù)選育出了恢復(fù)系川 恢802和組合Π優(yōu)802。另外，由于水稻釉梗雜種和爪釉雜種的后代穩(wěn)定非常慢，可W對其雜 種后代進行花藥培養(yǎng)，加速其雜種后代的穩(wěn)定，W加速水稻育種的進程。利用花培技術(shù)已選 育出了具有良好育性轉(zhuǎn)換特性的光溫敏不育系I-IS-1、I-IS-2、1103S、H1286S、1647S、 ZNDBS和培MS-1 等。
[0006] 作為世界上最大的稻米生產(chǎn)國和消費國，我國的水稻研究在世界上處于領(lǐng)先地 位。水稻產(chǎn)量的飛躍、品質(zhì)的改良、對特定環(huán)境的適應(yīng)性、對病、蟲、草的水平抗性等等，設(shè)及 宏觀生態(tài)領(lǐng)域與微觀基因領(lǐng)域的研究。水稻花藥培養(yǎng)是水稻育種在微觀領(lǐng)域與宏觀領(lǐng)域的 紐帶，作用不可忽視。植物的生長受著內(nèi)部基因與外部環(huán)境的雙重影響，目前植物組織培養(yǎng) 技術(shù)還不能使培養(yǎng)的外部環(huán)境與每個個體的生長達到最佳組合，因此該技術(shù)還不是很完美 的，具體到每種植物的組織培養(yǎng)還需要在不斷的研究當(dāng)中繼續(xù)加W改進。水稻花培技術(shù)本 身還有很多急需改進的地方，其中培養(yǎng)基的成分包括大量元素、微量元素、維生素W及生長 激素等等的組成及用量還有待于進一步的研究，操作方法等也應(yīng)深入地研究并簡化，才能 保證在水稻育種應(yīng)用中的高效地位。
[0007] 現(xiàn)階段花培育種在花藥培養(yǎng)方法上仍存在著工作量大、工作效率低的矛盾，限制 了花培技術(shù)在育種中的應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，新的技術(shù)不斷被創(chuàng)造出來，也為花 培途徑育種的應(yīng)用技術(shù)提出更高要求。如何提高工作效率、加快選擇效率、縮短育種周期、 創(chuàng)新種質(zhì)材料、配合其它生物技術(shù)的應(yīng)用，快速獲得純系，充分利用花培技術(shù)在基礎(chǔ)理論研 究和育種應(yīng)用研究的雄厚基礎(chǔ)，成為我們迫切需要解決的問題。
[0008] 多年的實驗經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限 性。剪穎抖藥法是目前花藥分離最普遍的操作方法，然而，剪穎和抖藥過程既需要專業(yè)組培 操作，又需要消耗大量的勞動，成為花培操作的限速步驟。如何快捷分離水稻花藥，并且保 證分離后水稻花藥維持活力且無污染適宜離體培養(yǎng)，是解決花培操作低效的關(guān)鍵。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有花藥離體培養(yǎng)操作方法的專業(yè)操作要求高且耗時耗力 的缺陷，提供一種提高操作量、工作效率高的離體培養(yǎng)用水稻花藥快捷分離方法。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案解決的： 1. 一種離體培養(yǎng)用水稻花藥快捷分離方法，其特征在于:所述分離方法的步驟如下： (1) 取穗及預(yù)處理； (2) 對預(yù)處理后的稻穗進行滅菌； (3) 在無菌條件下將稻穗進行機械分割，切碎的稻穗倒入離屯、管中密封后置于搖床上 震蕩； (4) 將初步震蕩后的離屯、管放入高速冷凍離屯、機中，20°C條件下9000-10000rpm離屯、獲 得離體花藥； (5) 對離體花藥進行接種培養(yǎng)。
[0011] 所述步驟（1)中的取穗W稻巷大而不破、劍葉葉枕距為5~8cm、稻穗中部花藥位置 占穎殼的1/^3~1/^2為標(biāo)準(zhǔn)取穗。
[0012] 所述步驟（1)中的預(yù)處理過程為:先用75%乙醇表面消毒，然后濕潤的紗布包裹整 個稻穗，保持稻穗濕潤，最后放到冰箱中，在4°C下低溫預(yù)處理2-8天。
[0013] 所述步驟(2)中的滅菌過程為:預(yù)處理后剪下稻巷，將稻巷浸泡于70%的酒精中處 理3~5min，然后將該稻巷轉(zhuǎn)移于超凈工作臺中剝離稻穗，用消毒過的紗布包裹稻穗后用濃 度為0.1%的升隸滅菌9-llmin并間或搖動，無菌水漂洗3~4次，打開紗布驚干。
[0014] 所述步驟(3)中切碎的稻穗倒入含有60-80ml的薦糖溶液的100毫升離屯、管中， 蓋上離屯、管蓋并用保鮮膜將離屯、管蓋頭位置緊緊封閉。
[0015] 所述步驟(3)中密封的離屯、管從超凈工作臺中取出后置于搖床上進行300-40化pm 震蕩 5-lOmin。
[0016] 所述步驟(3)中的稻穗按照2.2-2.8mm/段進行機械分割。
[0017] 所述步驟(4)中的離體花藥需要放回超凈工作臺后倒入盛有已滅菌的薦糖溶 液容器。
[0018] 所述步驟巧）中的離體花藥接種培養(yǎng)過程為：用滅菌過的網(wǎng)篩勺攬動裝有離體花 藥的薦糖溶液，使離體花藥均勻分散，然后圉出，使得離體花藥均勻分散到網(wǎng)篩勺上，控出 液滴，將離體花藥磕到裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，26-28°C暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)出愈傷組織。
[0019] 所述的網(wǎng)篩勺的孔徑為48目-70目。
[0020] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點： 本發(fā)明通過創(chuàng)造性地對水稻花藥采取機械切割的方式進行破碎，然后根據(jù)具體需要采 用不同大小的離屯、力對碎片進行分離，成功提取到了純凈的水稻花藥，并通過優(yōu)化離屯、介 質(zhì)和采用無菌操作，成功獲取到了活力旺盛的水稻花藥，并將分離獲取的水稻花藥進一步 花培驗證成功，該水稻花藥快捷分離方法提高了花培操作量的同時提升了花培工作效率。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實驗驗證和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0022]本發(fā)明提供的離體培養(yǎng)用水稻花藥快捷分離方法的詳細(xì)技術(shù)方案為： (1) 取穗及預(yù)處理 W稻巷大而不破、劍葉葉枕距為5~8cm、稻穗中部花藥位置占穎殼的~1/2為標(biāo)準(zhǔn) 取穗，取穗時間一般選擇晴天上午9: 00