仙客來植株愈傷組織和芽的培養基及培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物無性繁殖領域，尤其設及一種誘導仙客來葉片形成愈傷組織和芽 的培養基和培養方法。
【背景技術】
[0002] 仙客來（切clamenpersicumMill)又名一品冠、兔耳花、蘿h海棠，為報春花科仙 客來屬多年生球根草本花弁，是近年來較為流行的春節室內名貴盆花，其觀賞價值較高、花 期較長，在歐洲、日本等國都是名列前茅的盆花之一，且市場價格昂貴。仙客來生長適宜溫 度為18~2(TC。仙客來繁殖方法分為有性繁殖和無性繁殖。商品仙客來大多是雜種一代 用種子繁殖難W保存Fi代的原有性狀和雜種優勢，同時種子發芽率低，觀賞價值越高的 品種種子生產越困難，運成為制約仙客來商品化生產和經濟效益的主要因素。仙客來也可 用組織培養、球莖分割等方法繁殖。球莖分割法繁殖速度慢，此種方法只適于栽培條件十分 優越，管理水平高、滅菌、消毒條件好時采用，否則容易失敗。組織培養能夠保持兩性性狀， 并且有很高的繁殖率，為當前仙客來種苗產業的發展提供了一條捷徑，但是由于仙客來芽 分化率低、褐化問題嚴重、生根困難等技術障礙，相關技術達不到高效快速繁殖的目的，仙 客來的組織培養苗尚未進入商品化和產業化生產階段。我國栽培的仙客來優良品種，大多 為國外引進的品種或其后代。國產的仙客來優質品種極其缺乏，國外原種不僅價格昂貴，且 由于其大多為Fi代，繼續繁殖會出現性狀分離，而長期引進國外種子會造成生產成本太高， 因此急需建立國產仙客來優良品種培育體系。因此，通過組織培養快速建立無性繁殖體系， 保持優良品種的固有性狀，是當前仙客來種苗產業急需解決的關鍵問題。
【發明內容】
[0003] 為了達到上述目的，本發明提供了一種能簡單高效保存Fi代的原有性狀和雜種優 勢，同時繁殖系數高的仙客來離體繁殖的技術體系。
[0004] -方面，本發明提供了一種誘導仙客來葉片形成愈傷組織和芽的培養基，其組分 包括，
[0005]
[0006] 此外，還包括占培養基總質量百分比為3. 0~3. 2%的薦糖和占培養基總質量百 分比為0. 8~0. 9%的瓊脂，培養基抑值5. 8~6. 0。
[0007] 另一方面，本發明還提供了一種仙客來植株的培養方法，其包括W下步驟：
[0008] 步驟A，配置如權利要求1所述的培養基，對培養基、操作環境進行滅菌和消毒；
[0009] 步驟B，仙客來植株葉片在采取前，將植株進行遮光處理24~26小時，然后將仙客 來植株幼葉消毒、切塊，反面向上置于培養基表面；
[0010] 步驟C，將步驟B接種好的材料置于20°C~22°C下黑暗培養30~40天。
[0011] 本發明提供了一種仙客來植株愈傷組織和芽的培養基及培養方法，通過"二步法" 有效防止外植體褐化，高效誘導形成仙客來愈傷組織和芽。首先，仙客來葉片在采取前，將 植株進行遮光處理24~26小時，離體低溫（20°C~22°C)黑暗培養，有效解決了褐化難 題；其次，通過低溫（20°C~22°C)黑暗培養，誘導愈傷組織，30~40天后提高培養溫度至 25°C~28°C，光照培養誘導成芽；最后，芽形成15~20天后誘導生根。該技術體系能有效 抑制褐化，繁殖系數高，并能保存Fi代的原有性狀和雜種優勢，為仙客來種苗的工廠化生產 提供關鍵技術支撐。 【具體實施方式】
[0012] 一方面，本發明提供了一種誘導仙客來葉片形成愈傷組織和芽的培養基，其組分 包括，
[0013]
[0014] 此外，還包括占培養基總質量百分比為3. 0~3. 2 %的薦糖和占培養基總質量百 分比為0. 8~0. 9%的瓊脂，培養基抑值5. 8~6. 0。
[0015] 具體的，本專利所述2, 4-D(2, 4-二氯苯氧乙酸）、6-BA(6-節氨基嚷嶺）、KT(激動 素）、IBA(嗎I噪下酸）和NAA(糞乙酸）是植物激素。
[0016] 優選的愈傷組織和芽的誘導培養基，其組分包括，
[0017]
[001引此外，還包括占培養基總質量百分比為3. 0~3. 2%的薦糖和占培養基總質量百 分比為0. 8~0. 9%的瓊脂，培養基抑值5. 8~6. 0。
[0019] 另一方面，本發明還提供了一種仙客來植株的培養方法，其包括W下步驟：
[0020] 步驟A，配置如權利要求1所述的培養基，對培養基、操作環境進行滅菌和消毒；
[0021] 步驟B，仙客來植株葉片在采取前，將植株進行遮光處理24~26小時，然后將仙客 來植株幼葉消毒、切塊，反面向上置于培養基表面；
[0022] 步驟C，將步驟B接種好的培養基20°C~22°C下黑暗培養30~40天。
[0023] 本發明W仙客來植株的幼嫩葉片作為外植體，既取材方便，又可達到徹底消毒。此 夕F，外植體的擺放方法對愈傷組織誘導具有極顯著的影響。該實驗將葉片反面向上置于培 養基，相對于正面向上置于培養基更有利于愈傷組織的誘導作用。運可能是由于該擺放方 法與植物體自然生長狀態相反，從而可刺激更多愈傷組織的形成；同時葉片的下表皮向上， 使氣孔暴露出來，更有利于氣體交換。第=，所述步驟B中仙客來葉片在采取前，將母株進 行遮光處理24~26小時，然后再切取外植體培養。如此，能夠有效抑制外植體褐化。第 四，高溫能促進酪氧化，而低溫能抑制酪類化合物氧化，降低多酪氧化酶的活性，從而減輕 褐化。因此，在不影響正常生長和分化的前提下，盡量降低溫度。本發明采用20°C~22°C 培養。第五，本發明發現黑暗低溫培養，減小了外界因素對愈傷組織誘導的影響，因此，是仙 客來目前抗褐化的最佳選擇。
[0024] 優選的，還包括步驟D，將步驟C培養得到的愈傷組織轉至光照培養，光照強度 2000~25001X，光照時間為12~14小時/天，同時培養溫度升至25°C~28°C。可W通過 改變培養溫度，一步法形成幼芽。
[00巧]進一步優選的，還包括步驟E，芽形成15~20天后將不定芽剪下，轉接至生根培養 基中繼續培養，培養條件為，光照強度2000~25001X，光照時間為12~14小時/天。
[0026] 更進一步優選的，所述生根培養基組分如下，
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[0028]
[0029] 此外，還包括占培養基總質量百分比為3. 0~3. 2%的薦糖和占培養基總質量百 分比為0. 8~0. 9%的瓊脂，培養基抑值5. 8~6. 0。
[0030] 更進一步優選的，還包括步驟F，將已有3~4片葉，具有5~6條根系的幼苗煉苗 后栽入基質中定期噴水保濕培養。
[0031] 優選的，所述步驟BW完全展開的幼葉為外植體，切去葉片邊緣，并沿主葉脈剪切 成塊，切塊尺寸為IOmm~IlmmXIOmm~11mm。外植體的選擇很重要，本發明開始用成熟葉 片作為外植體，但其褐化嚴重。選用仙客來完全展開的幼葉取得了較好的效果，葉片沿主葉 脈剪切比側脈細脈剪切愈傷組織誘導率高，從主葉脈剪口處開始增厚膨大，然后形成愈傷， 因此選用帶有主脈的幼嫩葉片為外植體可獲得高質量的愈傷組織。外植體大小對褐化的影 響，表現為小的材料更容易發生褐化，相對較大的材料則褐化較輕。因此，葉片外植體適當 切大些，IOmm~11臟XIOmm~11臟比較合適。
[0032] 優選的，所述步驟B中將仙客來植株葉片切塊在質量濃度為0. 1~0. 12%的升隸 溶液中浸泡10~15min，再用無菌水沖洗3~4次進行消毒。各種消毒用的化學試劑對外 植體的傷害也會引起褐化，酒精消毒對外植體的傷害比較重，較易引起材料的死亡，對于不 易褐化的種類，用氯化隸消毒后，一般不會引起褐化，若用次氯酸鋼進行消毒，則很容易引 起褐化的發生，而且消毒效果不如氯化隸。針對仙客來褐化，應盡可能減少用酒精消毒外 植體的時間，實驗證明，不用酒精消毒，適當延長升隸消毒的時間可W獲得比較好的消毒效 果。
[0033] 優選的，所述步驟B中將培養基在1(UKP，121~126°C滅菌20~25min。
[0034] 下面結合具體實施例，進一步對本發明進行詳細描述。當然所描述的實施例僅是 本發明的一部分實施例，而不是全部實施例，基于本發明中的實施例，本領域技術人員在沒 有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明的保護范圍。
[0035] 實施例1
[0036] 實驗材料：本發明植株母體采用仙客來"國旗紅"品種，購于武漢市青山區鐵機路 花弁市場。外植體采用仙客來的幼嫩健康葉片。
[0037] 儀器設備：
[0038] 1.格蘭仕微波爐，名秀光波G8023S化-K3型，佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有 限公司；
[0039] 2.雙哈全自動不誘鋼雙層立式電蒸汽壓力消毒器，YX. 350Z，上海S申醫療器械有 限公司；
[0040] 3.BOXUN潔凈工作臺，潔凈等級100級（> 0. 5ym粒子《3粒子/L)YS-800-2 ;
[00川 4.TO肥智能光照培養箱，GXZ型，南京同立實驗儀器有限公司；
[0042] 5.電子天平，200血S角燒瓶、方形塑料帶蓋培養瓶、綴子、解剖刀、培養皿、濾紙、 酒精燈。
[004引操作步驟：
[0044] 1.培養基配制
[0045] 配置仙客來植株愈傷組織和芽的培養基，其組分如下，
[0046]
[0047]
[004引此外，還包括占培養基總質量百分比為3. 0%的薦糖和占培養基總質量百分比為 0. 8%的瓊脂，調抑至5. 8~6. 0,得到培養基。