一種小麥單倍體試管植株染色體加倍的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種小麥單倍體試管植株染色體加倍的方 法。
【背景技術】
[0002] 小麥單倍體植株誘導和染色體加倍是培育小麥新品種，創建用于小麥遺傳分析和 基因定位DH群體的重要技術。小麥單倍體植株可W通過小麥與玉米雜交后染色體排除 化aurie等，1986,1988 ;陳新民等，1996)、花藥培養（歐陽俊聞等，1973 ;朱志清等，2003) 和小抱子培養燈ouraev等，1996 ;Zheng等，2002)S種途徑獲得。其中，花藥培養具有強烈 的基因型依賴性，多數小麥品種或Fl雜種的花藥培養難W獲得愈傷組織和再生植株；雖然 小抱子培養對基因型的依賴性較小，但試驗操作復雜，容易污染，周期較長；小麥與玉米雜 交方式誘導單倍體植株幾乎不受基因型的限制，操作容易，周期較短，但成胚率較低。在獲 得植株的倍性方面，小麥與玉米雜交后通過幼胚捶救獲得單倍體植株幾乎不能自然加倍， 花藥培養方式獲得單倍體植株的自然加倍率20-30 % (李志武等，1996)，小抱子培養方式 獲得單倍體植株的自然加倍率30-40%狂heng等，2002)。為了確保純合二倍體植株的獲得 并提高單倍體植株的加倍效率，需要利用秋水仙素對幼苗或愈傷組織進行染色體加倍。
[0003] 目前為止，對小麥單倍體植株進行染色體加倍利用最多的方法是苗期分葉節加 倍，即將幼苗從培養基中取出，放入質量分數為0.02-0.1%的秋水仙素水溶液中，在通氣 累介導的供氧條件下處理5-10小時，然后取出幼苗，流水沖洗3-4小時，最后移栽在花盆 中。該方法的加倍率一般為50-60%，加倍植株生長發育正常（楊咖萍等，2011 ;趙愛菊等， 2013 ;陳新民等，2013)。利用0. 2%秋水仙素對小麥單倍體植株進行5小時浸根處理，加倍 率也只有37. 5% (楊麗萍等，2011)。但運2種方法操作比較繁瑣，步驟較多，且秋水仙素對 環境產生污染，也增加了人體接觸秋水仙素的機率。因此，鑒于目前小麥單倍體加倍技術存 在的一些缺點，需要建立一種簡便、高效、安全的單倍體植株加倍方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的一個目的是提供一種單倍體植株染色體加倍的方法。 陽〇化]本發明提供的單倍體植株染色體加倍的方法包括如下步驟：將秋水仙素或秋水仙 素水溶液添加在長有單倍體植株的培養基表面，處理，得到加倍的單倍體植株，實現單倍體 植株染色體加倍。
[0006] 上述方法中，所述秋水仙素水溶液的質量分數為0.2-0.6%。
[0007] 上述方法中，所述秋水仙素水溶液的質量分數為0. 4%。
[0008] 上述方法中，所述處理的時間為2地。
[0009] 上述方法中，所述處理的溫度為25°C。
[0010] 上述方法中，所述單倍體植株為小麥單倍體植株；
[0011] 所述小麥單倍體植株具體為小麥品種與玉米品種雜交得到的小麥單倍體植株。
[0012] 上述方法中，所述小麥品種為科農199、新春9號或CB037,所述玉米品種為鄭58。
[0013] 上述方法中，所述培養基為1/2MS培養基；
[0014] 所述1/2MS培養基由溶劑和溶質組成，溶劑為水，溶質在1/2MS培養基中的濃度為 琴〇3825mg/l、KN〇3 950mg/l、CaCl2.2H2〇 220mg/l、M拆〇4.7&0 185mg/l、KH2P〇4 850mg/ 1、KI0. 42mg/l、H3B〇3 3.lmg/l、MnS〇4? 4&0 11. 2mg/l、aiS〇4 ? 7&0 4. 3mg/l、Na2Mo〇4 ? 2&0 0. 13mg/l、CuS〇4.5H2〇 0.013mg/l、CoClz.6電0 0.013mg/l、FeS〇4.7H2〇 13. 9mg/l、 胞2-邸TA? 2&0 18. 7mg/l、薦糖20g/l、維生素Bilmg/1、谷氨酷胺150mg/l、植物凝膠 (F*h}ftagel) 2. 4g/l。
[0015] 本發明的另一個目的是提供上述方法的新用途。
[0016] 本發明提供了上述方法在提高小麥單倍體植株染色體加倍率中的應用。
[0017] 本發明還提供了上述方法在小麥育種中的應用。
[0018] 本發明分別通過秋水仙素溶液在培養基表面添加、加注根部、涂抹葉片3種加倍 方法對小麥單倍體試管苗進行加倍處理，試驗結果表明：移栽前在單倍體試管苗培養基表 面分別添加質量分數為0. 2%、0. 4%、0.6%秋水仙素溶液，小麥單倍體植株加倍率分別為 76. 9%、95. 2%、84.6%，而對照不加倍處理的加倍率為0,表明培養基表面添加秋水仙素溶 液方式對小麥單倍體植株的加倍效果非常明顯（表3,圖5,圖6)，加倍率顯著提高，明顯高 于目前應用的傳統加倍方法。本發明的方法不僅高效、簡單、易行、環保，對小麥單倍體植株 的加倍效果具有普遍性，而且減少了秋水仙素的潛在污染，對于利用細胞工程途徑改良小 麥和小麥基因工程研究具有重要意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1為小麥品種科農199與玉米品種鄭58雜交后幼胚捶救培養獲得的幼苗。
[0020] 圖2為小麥品種科農199與玉米品種鄭58雜交獲得的小麥單倍體植株染色體構 成。
[0021] 圖3為小麥品種新春9號與玉米品種鄭58雜交后幼胚捶救培養獲得的幼苗。
[0022] 圖4為小麥品種新春9號與玉米品種鄭58雜交獲得的小麥單倍體植株染色體構 成。
[0023] 圖5為小麥品種CB037與玉米品種鄭58雜交后幼胚捶救培養獲得的幼苗。
[0024] 圖6為小麥單倍體植株經秋水仙素溶液培養基表面添加獲得加倍植株的染色體 構成。
【具體實施方式】
[00巧]下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[00%] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0027] 下述實施例中的玉米新鮮花粉的定義：在玉米開花期間，上午8:OOam抖落玉米雄 穗上的舊花粉，9:OOam收集玉米雄穗上的新鮮花粉。
[0028] 下述實施例中的小麥遺傳資源：科農199、新春9號和CB037均可從中國農業科學 院作物科學研究所國家農作物種質資源庫獲得。
[0029]下述實施例中的玉米遺傳資源：鄭58可從中國農業科學院作物科學研究所國家 農作物種質資源庫獲得。
[0030] 下述實施例中的1/2MS培養基由溶劑和溶質組成，溶劑為水，溶質在1/2MS培養基 中的濃度為NH4NO3825mg/l、KN〇3 950mg/l、CaCl2.2H2〇 220mg/l、M拆〇4*7&0185mg/l、 KH2PO4850mg/l、KIO. 42mg/l、H3BO33.lmg/1、MnS〇4? 4&0 11. 2mg/l、ZnS〇4? 7&0 4. 3mg/ 1、NazMcA? 2&0 0. 13mg/l、CuS〇4? 5&0 0. 013mg/l、C0CI2?6H2O0. 013mg/l、FeS〇4? 7&0 13. 9mg/l、Naz-EDTA? 2&0 18. 7mg/l、薦糖 20g/l、維生素Bilmg/1、谷氨酷胺 150mg/l、植 物凝膠（Phytagel) 2. 4g^。1/2MS培養基的pH值為6. 0,加熱煮沸后分裝在玻璃培養管中 (直徑3. 5cm，高度12cm)，12rC、高壓濕熱條件滅菌15分鐘。 陽03U 下述實施例中的DA處理液由溶劑和溶質組成，溶劑為水，溶質及其在DA處理液 中的濃度為2, 4-DlOOmg/L和AGP2g/L。DA處理液的具體配制方法為：先準確稱取50mg 2, 4-D，加入200ml無水酒精，用微量移液器充分吸打溶解后加入到500ml蒸饋水中，然后準 確稱取IgAGP加入到上述500ml溶液中。
[0032] 下述實施例中的2, 4-D化4-二氯苯氧乙酸）是Sigma公司產品，貨號為D7299。
[0033] 下述實施例中的AGP(A;r油inogalactanproteins,阿拉伯半乳聚糖蛋白）是 Sigma公司產品，貨號為G9752。
[0034] 下述實施例中的秋水仙素為Sigma公司產品，貨號為C9754。
[0035] 下述實施例中的質量分數為0. 2%的秋水仙素溶液是將200mg的秋水仙素與 100mL的蒸饋水混勻得到的。
[0036] 下述實施例中的質量分數為0. 4%的秋水仙素溶液是將200mg的秋水仙素與50ml 的蒸饋水混勻得到的。
[0037] 下述實施例中的質量分數為0.6%的秋水仙素溶液是將200mg的秋水仙素與 33. 3ml的蒸饋水混勻得到的。
[0038] 實施例1、秋水仙素對小麥單倍體植株的加倍效果方式的摸索
[0039] 一、秋水仙素根部加注對小麥單倍體植株的加倍效果試驗
[0040] W小麥品種科農199與玉米品種鄭58雜交誘導的小麥單倍體幼苗為試驗對象，小 麥與玉米雜交幼胚捶救培養和小麥單倍體植株加倍處理步驟如下：
[0041 ]( 一）小麥單倍體植株的獲得W42] 1、小麥與玉米雜交
[0043] 將小麥品種科農199種植在中國農業科學院作物科學研究所試驗農場（2013年9 月），越冬前覆蓋塑料布（2013年12月），返青期掲開塑料布（2014年3月）；將玉米品種 鄭58種植在中國農業科學院作物科學研究所溫室（2014年2月，分期播種）；小麥品種科 農199抽穗時及時人工去雄、套袋（2014年4月），共去雄40穗；3天后收集玉米品種鄭58 的新鮮花粉授W去雄后的科農199 ;先后于授粉后24小時和48小時用DA處理液噴灑雜交 穗各1次；授粉后16-17天取樣雜交穗（40個麥穗）。
[0044] 2、小麥與玉米雜交幼嫩巧粒滅菌和小麥單倍體植株獲得
[0045] 從小麥品種科農199與玉米品種鄭58雜交后的40個麥穗上收集了 506個幼嫩巧 粒，70 %酒精表面消毒1分鐘，15 %次氯酸鋼滅菌20分鐘，無菌水沖洗5次；在解剖鏡下取 出小麥與玉米雜交幼胚，將小麥與玉米雜交幼胚進行捶救培養：胚軸端向上接種至1/2MS 培養基上，每個培養管接種3-4個雜交幼胚，共接種雜交幼胚43個；先在黑暗、25°C條件下 培養3天，然后在光照、25°C條件下培養20天，最終獲得了 31株試管單倍體植株（圖I)。
[0046] (二）小麥單倍體植株染色體加倍
[0047] 1、小麥單倍體植株染色體檢查
[0048] 移栽前取獲得的31株小麥單倍體試管苗l-2cm長度的根尖，冰水處理24小時，然 后浸泡在酒精與乙酸溶液（酒精與乙酸的體積比為3:1)中固定24小時后放入95%酒精中 保存。經固定的根尖用IN肥1在60°C下水解14分鐘，然后用醋酸洋紅進行染色，在顯微 鏡下觀察單倍體植株染色體。檢查結果表明，獲得的31株試管