一種苦蕎的快速再生組織培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于苦蕎麥組織培養再生技術領域，尤其涉及一種苦蕎的快速再生組織培養方法。
【背景技術】
[0002]蕎麥是一種藥食同源的植物，分為苦蕎和甜蕎兩大類。其中，苦蕎(F.tataricumGaertn)在分類學上屬寥科(Polygonaceae)，蕎麥屬(Fagopyrum)，一年生雙子葉草本植物。苦蕎發源于中國，其性味苦、平、寒，有益氣力、續精神、利耳目、降氣寬腸健胃的作用，具有極高的營養保健功能。苦蕎的種子、根、莖、葉等多種器官中都富含黃酮類物質，具有“降血糖、降血壓、降血脂”的作用，被譽為“三降食品”。隨著對苦蕎營養價值和藥用價值研究的不斷深入，其越來越受到人們的青睞。苦蕎在組培再生及遺傳育種方面的研究還尚處于起步階段，相關報道并不多見。這主要是由于苦蕎自身的開花習性及遺傳特點所決定的。苦蕎麥為自花授粉，這就使得許多具有優良性狀的基因難以通過人工雜交等方式轉入苦蕎中，且在人工雜交過程中還存在植株易被病蟲侵害，而且增殖速度較慢，難以適應規模化生產的趨勢，難以滿足旺盛的市場需求。而利用植物組織培養技術結合轉基因技術對現有苦蕎品種進行遺傳改良，可以在一定程度上解決苦蕎在育種上所遇到的問題。但是，現有苦蕎再生體系的研究還比較零散，且已經報道的相關研究成果還存在許多需要改進的地方。其中，利用傳統組培再生手段對苦蕎麥進行再生培養通常再生時間較長，從苦蕎外植體誘導出愈傷組織，再由愈傷組織誘導出再生芽，然后再進行再生芽的生根誘導，通常需要12周至16周，且步驟較為復雜、操作不夠簡便，組培的成本也較高，在實際應用中具有一定的局限性。而苦蕎麥在快速再生過程中也存在著部分品種再生芽誘導困難、誘導率低等問題。同時，苦蕎麥的營養價值和藥用價值越來越受到人們的關注，具有極大的市場潛力。目前采用的組培再生方法又存在著一定的弊端，我國苦蕎麥的快速再生技術較為落后，這也間接阻礙了我國苦蕎市場的迅速發展。因此，仍需要進一步優化組培技術。雖然苦蕎已實現了經由原生質體、下胚軸及子葉的組培再生，但是經由頂端分生組織的快速再生技術卻鮮有報道。因而，建立一個更加成熟、高效、迅速的苦蕎快速再生體系對于我國苦蕎麥的產業化發展具有重大的現實意義，這也將為苦蕎轉基因研究和分子遺傳育種研究打下良好的基礎。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種苦蕎的快速再生組織培養方法，旨在解決苦蕎麥在組培再生過程中部分品種再生芽誘導困難、誘導率低的的問題。
[0004]本發明是這樣實現的，一種苦蕎的快速再生組織培養方法，所述苦蕎的快速再生組織培養方法包括以下步驟:
[0005]采用MS基礎培養基對苦蕎無菌苗的培養；
[0006]苦蕎叢生芽的誘導；
[0007]苦蕎再生芽的生根；
[0008]煉苗和移栽。
[0009]進一步，所述的MS基礎培養基組分如下:
[0010]20 XMS 大量元素母液:NH4N03 33.0g, KN03 38.0g, MgS04.7H20 7.4g，KH2P043400mg ；
[0011]200 XMS 微量元素母液:KI 0.166g, H3B03 1.24g，MnS04.4H20 4.46g，ZnS04.7H20 1.72g，Na2Mn04.2H20 0.05g，CuS04.5H20 0.005g, CoC12.6H20 0.005g ；
[0012]200 X MS 鐵鹽母液:FeS04.7H20 5.56g，Na2_EDTA.2H20 7.46g ；
[0013]200 XMS 有機母液:肌醇 20.0g，煙酸 0.lg，VB6 0.lg，VBl 0.lg，甘氨酸 0.4g ；
[0014]20 XMS 鈣鹽母液:CaC12 6.64g。
[0015]進一步，所述MS基礎培養基制備方法如下:
[0016]組分稱量后，使用去離子水溶解并定容到IL ;置于121°C高壓滅菌鍋中滅菌15min備用;
[0017]MS基礎培養基的配置:20X大量元素母液50mL，200X微量元素母液5mL，200X鐵鹽母液5mL，20 X鈣鹽母液50mL，200 X有機母液5mL，植物凝膠2.5g，蔗糖30g ;
[0018]1/2MS培養基的配置:20X大量元素母液25mL，200 X微量元素母液2.5mL，200 X鐵鹽母液2.5mL，20 X鈣鹽母液25mL，200 X有機母液2.5mL，植物凝膠2.5g，蔗糖20g ;
[0019]使用去離子水定容到1L，再用0.5M NaOH調節PH值至5.8—6.2之間，最后，將其置于121°C高壓滅菌鍋中滅菌15min。
[0020]進一步，所述苦蕎麥叢生芽的誘導具體包括:將剪取的苦蕎麥外植體傾斜45°插入苦蕎麥叢生芽誘導培養基之中，每個培養基中接種數5-10個外植體；苦蕎麥叢生芽誘導培養基的配置為MS基礎培養基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ，之后，將接種好苦蕎麥外植體的培養皿置于暗室中進行暗處理，處理時間為2天，之后將其置于人工光照培養箱中進行不定芽的誘導；期間，光照培養箱中光照強度為2000LUX，光照時間為白天16h、夜間8h，溫度為白天25°C、夜間20°C，3-5周后在培養皿中即可得到眾多誘導的不定芽。
[0021]進一步，所述苦蕎麥再生芽誘導生根具體包括:將誘導出的苦蕎麥不定芽從基部切下，垂直插入到苦蕎麥生根培養基中，每瓶接種數為8-10株，苦蕎麥生根培養基的配置為1/2MS基礎培養基中添加1.0mg/L IBA ;隨后將培養瓶放置于人工光照培養箱中進行生根培養，光照培養箱中光照強度為2000Lux，光照時間為白天16h、夜間8h，溫度為白天25°C、夜間20°C，2-3周后在組培瓶中的不定芽即可生根。
[0022]進一步，所述苦蕎麥叢生芽的誘導之前需要制備苦蕎麥快速再生外植體，具體包括:
[0023]苦蕎麥組織培養無菌苗的獲得:選擇顆粒飽滿的苦蕎種子，在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剝去種皮，之后用75%的乙醇浸泡60s，再用10%的次氯酸鈉震蕩處理8min，接著使用無菌水沖洗3次，每次5min，最后，將滅菌后的種子均勻鋪于濾紙上，吸干其表面殘留水分后均勻播撒至MS培養基上，之后，將處理好的種子放于光照培養箱中，溫度為白天25°C光照16h，夜間20°C持續8h ；
[0024]苦蕎麥快速再生外植體的制備:取12-15日齡的苦蕎麥無菌苗，在工作臺內剪取苦蕎組培苗的頂端分生組織作為外植體。
[0025]進一步，所述苦蕎再生植株的煉苗與移栽:選擇組培瓶中生長健壯的苦蕎麥再生苗，打開瓶蓋，洗去不定根上的培養基，移栽到裝有營養土的花盆中，在室內煉苗4-6天，再將花盆中的再生苦蕎麥幼苗取出，最后移栽至松軟的土壤中生長。
[0026]進一步，所述MS基礎培養基的pH值為5.8-6.2，同時添加0.25%的植物凝膠。
[0027]本發明提供的苦蕎的快速再生組織培養方法，通過苦蕎叢生芽的誘導和生根等簡單步驟，即可實現苦蕎麥的快速再生，簡化了組培程序，從外植體的獲得到再生苗的生成僅需5-8周，極大地節省了苦蕎麥的再生時間，是一種快速培育苦蕎麥優良種苗，提高苦蕎麥再生效率的關鍵技術。同時，本發明還具有適用性廣泛的特點，打破了不同苦蕎麥品種間的界限，其再生方法適用于多個品種的苦蕎，解決了苦蕎麥在快速再生過程中部分品種再生芽誘導困難、誘導率低的難題。本發明是一種快速、高效、經濟和簡便的苦蕎麥組培再生方法，通過利用配制的再生培養基進行苦蕎麥優良品種的快速再生，提高了苦蕎麥的再生效率，簡化了苦蕎麥的組培程序，縮短了組織培養的再生時間，有效降低了其組培成本，實現了對不同品種苦蕎麥不定芽的高效誘導、快速再生。
【附圖說明】
[0028]圖1是本發明實施例提供的苦蕎的快速再生組織培養方法流程圖。
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